CCL18在惡性黑素瘤中的表達及其與血管內皮生長因子、Ki67表達的相關性研究

宋昊 王白鶴 邵雪寶 程偉 熊競舒 王小坡 王建 曾學思 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科

CCL18在惡性黑素瘤中的表達及其與血管內皮生長因子、Ki67表達的相關性研究

宋昊 王白鶴 邵雪寶 程偉 熊競舒 王小坡 王建 曾學思 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病研究所病理科

目的探討趨化因子配體18（CCL18）在惡性黑素瘤（惡黑）組織中的表達和臨床意義，與血管內皮生長因子（VEGF）、Ki67表達的相關性。方法用免疫組化方法檢測58例惡黑石蠟標本中CCL18、VEGF及細胞增殖核抗原Ki67的表達，同時檢測20例色素痣石蠟標本中CCL18的表達水平。對CCL18的表達與惡黑臨床病理及VEGF、Ki67的表達進行相關性分析。用免疫熒光方法驗證CCL18在惡黑組織中的表達。結果CCL18在惡黑組陽性率為84.48%（49/58），而在色素痣組均無表達，差異有統計學意義（χ2=45.46，P＜0.01）。CCL18在惡黑的表達與腫瘤Clark分級、Breslow厚度呈正相關（rs值分別為0.609、0.644，均P＜0.01）；在有無潰瘍以及有無淋巴結轉移組間差異有統計學意義（均P＜0.05）。CCL18的表達在不同性別、年齡、肢端/非肢端惡黑患者組間差異無統計學意義（均P＞0.05）。惡黑中CCL18陽性表達水平與VEGF表達水平呈正相關（rs=0.727，P＜0.05），與Ki67表達水平無相關（P＞0.05）。免疫熒光顯示，惡黑組織中腫瘤細胞胞質表達CCL18。結論CCL18在惡黑組織中高表達，與腫瘤侵襲、轉移有一定關系。

痣和黑素瘤；趨化因子CCL18；病理過程；血管內皮生長因子類；Ki?67抗原

趨化因子配體18（CCL18）是一種CC型趨化性細胞因子，主要由M2型單核/巨噬細胞或樹突細胞分泌，可作為基本細胞因子維持機體穩態，其基因位于染色體17q11.2［1］。目前研究表明，淋巴及外周組織中單核細胞表達的CCL18可能促進炎癥及病理狀態下淋巴細胞及未成熟樹突細胞的趨化，并影響上皮間質轉化，與腫瘤的侵襲、轉移相關［2?3］。CCL18因子在惡性黑素瘤（惡黑）中的作用不清楚，我們通過檢測惡黑、色素痣組織中CCL18的表達，探討CCL18在惡黑組織中的表達意義。

資料與方法

1.資料：2012—2015年中國醫學科學院皮膚病醫院經臨床、組織病理學及免疫組化確診的58例惡黑（包括原位黑素瘤15例，侵襲性黑素瘤43例，其中轉移性黑素瘤5例）和20例色素痣石蠟標本。58例惡黑患者中，男26例，女32例；年齡26～86歲，平均59歲，其中20～59歲25例，60～86歲33例。病程0.3個月至8年。皮損位于肢端者45例，非肢端者13例。伴發潰瘍者34例，不伴潰瘍者24例。Clark分級Ⅰ～Ⅱ級29例，Ⅲ～Ⅴ級29例。Breslow厚度≤1 mm 14例，1～2 mm 13例，2～4 mm 23例，＞4 mm 8例。2例惡黑及對照正常皮膚新鮮組織標本取自2016年4月本院經臨床、組織病理及免疫組化確診并手術擴大切除的惡黑患者。

2.主要試劑：CCL18免疫組化抗體為濃縮型兔抗人多克隆抗體（英國Abcam公司）。血管內皮生長因子（VEGF）、Ki67均為即用型兔抗人單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。DAB酶底物顯色試劑盒和即用型快捷免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。CCL18免疫熒光抗體為鼠抗人單克隆抗體（美國RD Systems公司）。免疫熒光二抗為Alexa Fluor?488標記山羊抗小鼠IgG（南京福麥斯生物技術有限公司）。

3.免疫組化法檢測石蠟標本CCL18、VEGE、Ki67：石蠟切片脫蠟至水，65℃水浴孵育45 min至1 h脫色素檸檬酸/乙二胺四乙酸（EDTA）緩沖液高壓修復6 min；滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育15 min，3，3′?二氨基聯苯氨四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木精復染。磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，廠家提供已知陽性片做陽性對照。

4.免疫熒光法檢測新鮮組織標本CCL18：新鮮組織冰凍切片經4%甲醛液固定10 min，Triton X?100通透15 min，免疫染色封閉液封閉1 h；滴加一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育1 h，4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）染色3 ～ 5 min。封片后激光共聚焦顯微鏡觀察。

5.免疫組化結果判定：CCL18陽性表現為顯微鏡下細胞胞質棕黃色染色，在高倍鏡（×400）下隨機選擇5個視野，根據陽性細胞所占的百分率及染色強度評分。陽性細胞百分率評分標準：不著色計0分，＜25%計1分，25%～50%計2分，＞50%計3分。染色強度評分標準：不著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，深褐色計3分。二項乘積得最終評分。最終評分：（-）計0分，（+）計1～ 3分，（++）計4～6分，（+++）計＞6分。VEGF陽性表現為胞膜或胞質棕黃色染色：根據染色強度分為4級：陰性（-），弱陽性（+），中度陽性（++），強陽性（+++）。Ki67陽性表現為胞核棕黃色顆粒沉著，取5個高倍（×400）視野，以陽性細胞所占細胞總數的平均值計算Ki67陽性率，分為4級：（-）為不著色，（+）為陽性細胞數 ＜ 5%，（++）為5% ～ 50%，（+++）為 ＞ 50%。結果由兩名皮膚病理科醫師獨立閱片進行，每張組化切片均同時行HE染色對照。

6.共聚焦顯微鏡觀察：樣品在激光共聚焦顯微鏡（日本Olymplus公司）下掃描。胞核染色為藍色熒光，CCL18陽性表達的胞質染色為綠色熒光，計算機采集數據并合成圖像。

7.統計學方法：用SPSSl9.0統計軟件進行數據統計分析，計數資料比較采用χ2檢驗，兩組獨立等級資料的非參數檢驗采用Mann?WhitneyU檢驗，等級資料相關性分析用Spearman相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.CCL18在惡黑組織及色素痣組織中的表達：CCL18在20例色素痣均無表達，在58例惡黑有49例有CCL18陽性表達（圖1A），陽性率為84.48%，而且CCL18與人黑素瘤標志物Melan?A（T細胞識別黑素瘤抗原，圖1B）在同一組織中的陽性分布一致。CCL18在惡黑組的表達明顯高于色素痣組，差異有統計學意義（χ2=45.46，P＜0.01）。2例新鮮標本免疫熒光染色示CCL18在2例惡黑組織腫瘤細胞胞質陽性表達（圖2A），而CCL18在2例正常皮膚組織中不表達（圖2B）。

2.惡黑組織中CCL18與VEGF、Ki67表達水平的相關性：VEGF在惡黑標本中均存在不同程度的表達（圖1C），Ki67在大部分惡黑標本中弱陽性或陽性表達（圖1D）。CCL18表達水平與VEGF表達水平呈正相關（rs=0.727，P＜0.01），與Ki67表達水平無相關性（P＞0.05）。見表1。

圖1 免疫組化檢測惡性黑素瘤組織中蛋白表達（EnVision法×100） 1A：趨化因子配體18CCL18在腫瘤細胞陽性表達，胞質呈棕黃色；1B：T細胞識別黑素瘤抗原在腫瘤細胞陽性表達，胞質呈棕黃色；1C：血管內皮生長因子在部分細胞胞膜或胞質呈棕黃色染色；1D：細胞增殖核抗原Ki67在部分細胞胞核呈棕黃色染色 圖2 免疫熒光染色檢測皮膚惡性黑素瘤患者趨化因子配體18的表達2A：惡性黑素瘤組織中，CCL18在腫瘤細胞陽性表達，呈綠色熒光；2B：正常皮膚組織中，CCL18不表達

表1 惡性黑素瘤CCL18與Ki67、VEGF表達的關系

3.惡黑組織中CCL18表達水平與臨床病理特征的關系：見表2。CCL18表達水平與惡黑Clark分級、Breslow厚度呈正相關（rs分別為0.609、0.644，均P＜0.01），在有無潰瘍、有無淋巴結轉移組間差異有統計學意義（均P＜0.05），有潰瘍組CCL18表達水平高于無潰瘍組，有轉移組CCL18表達水平高于無轉移組。而CCL18表達水平在不同性別、年齡、部位（肢端/非肢端）組間差異無統計學意義（均P＞0.05）。

討 論

研究表明，惡黑組織中存在腫瘤相關巨噬細胞即M2型巨噬細胞，并與惡黑的侵襲和轉移具有密切關系，發揮促癌作用［4］。CCL18是M2型巨噬細胞分泌的一種趨化性細胞因子，除了在炎癥過程中激活和趨化白細胞，CCL18還在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中表達升高，參與上皮間質轉化、促進血管生成，最終促進腫瘤的侵襲及轉移。

目前對CCL18在惡黑發生發展中的作用尚無研究，辛崇美等［5］通過細胞學研究發現，CCL18有促進A375細胞侵襲的作用，并明顯促進腫瘤血管生成，其表達提示惡黑獲得更高的侵襲能力［6?7］。本研究結果顯示，CCL18表達在惡黑組織中升高，與腫瘤Clark分級、Breslow厚度呈正相關，并在腫瘤形成潰瘍或發生淋巴結轉移的情況下CCL18表達增高，表明CCL18在惡黑中具有促進腫瘤侵襲及轉移的促癌作用。

為了進一步評估CCL18與惡黑增殖、侵襲及轉移的相關性，我們選取了與增殖相關的抗原Ki67以及與血管生成相關的抗原VEGF進行研究。有研究表明Ki67抗原與腫瘤的生長、浸潤、轉移等生物學行為密切相關［8］。VEGF能促進血管內皮細胞增殖、分裂，誘導腫瘤微環境中新生血管形成，并增加血管通透性，從而促進腫瘤生長和轉移［9?10］。本文結果顯示，在惡黑中CCL18的表達與Ki67的相關性不明顯，表明CCL18對惡黑細胞的增殖活性可能無明顯影響，但CCL18的表達水平與VEGF的表達有相關性，與辛崇美等［5］CCL18有促進腫瘤血管生成的研究，結果一致。說明CCL18在惡黑的血管形成中發揮重要作用。

表2 CCL18在惡性黑素瘤組織中的表達及其與腫瘤臨床病理特征的關系

［1］Schutyser E,Richmond A,Van Damme J.Involvement of CC chemokine ligand 18（CCL18） in normal and pathological processes［J］.J Leukoc Biol,2005,78（1）:14?26.DOI:10.1189/jlb.1204712.

［2］Su S,Liu Q,Chen J,et al.A positive feedback loop between mesenchymal?like cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis［J］.Cancer Cell,2014,25（5）:605?620.DOI:10.1016/j.ccr.2014.03.021.

［3］Bonecchi R,Locati M,Mantovani A.Chemokines and cancer:a fatal attraction［J］.Cancer Cell,2011,19（4）:434?435.DOI:10.1016/j.ccr.2011.03.017.

［4］殷芳,吳飛,陳佳,等.腫瘤相關巨噬細胞對皮膚惡性黑素瘤細胞A375生物學行為的影響［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（9）:619?623.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.09.003.

YinF,WuF,ChenJ,etal.Effects of tumor?associated macro?phages on the biological behavior of A375 human malignant melanoma cells［J］.Chin J Dermatol,2014,47（9）:619?623.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2014.09.003.

［5］辛崇美,李光,孫建方,等.CCL18趨化性細胞因子對A375黑素瘤細胞株增殖和侵襲的影響［J］.中華皮膚科雜志,2010,43（12）:833?836.

Xin CM,Li G,Sun JF,et al.Effects of chemokine CCL18 on the proliferation and invasion of a human melanoma celllineA375［J］.ChinJDermatol,2010,43（12）:833?836.

［6］Gao J,Li ZH,Tang W,et al.Chemokine C?C motif ligand 18 expression correlates with tumor malignancy in breast cancer［J］.Pathol Biol（Paris）,2015,63（4?5）:199?203.DOI:10.1016/j.patbio.2015.07.001.

［7］Wang Q,Tang Y,Yu H,et al.CCL18 from tumor?cells promotes epithelial ovarian cancer metastasis via mTOR signaling pathway［J/OL］.Mol Carcinog,2015［2016?1?4］.http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mc.22419/full.［Publish online ahead of print Oct 12,2015］.DOI:10.1002/mc.22419.

［8］王寶娜,王翔,張增海,等.Ki67在乳腺癌中的表達及臨床意義［J］.中華腫瘤雜志,2014,36（4）:273?275.

Wang B,Wang X,Wang J,et al.Expression of Ki67 and clinicopathological features in breast cancer［J］.Chin J Oncol,2014,36（4）:273 ?275.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253?3766.2014.04.007.

［9］Felcht M,Thomas M.Angiogenesis in malignant melanoma［J］.J Dtsch Dermatol Ges,2015,13（2）:125 ?136.DOI:10.1111/ddg.12580.

［10］Brychtova S,Bezdekova M,Brychta T,et al.The role of vascular endothelial growth factors and their receptors in malignant melanomas［J］.Neoplasma,2008,55（4）:273?279.

Expression of CC chemokine ligand 18 in cutaneous malignant melanoma tissues and its relationship with vascular endothelial growth factor and Ki67 antigen expressions

Song Hao,Wang Baihe,Shao Xuebao,Cheng Wei,Xiong Jingshu,Wang Xiaopo,Wang Jian,Zeng Xuesi,Xu Xiulian,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo measure the expression of CC chemokine ligand 18（CCL18）in cutaneous malignant melanoma（CMM）tissues,and to explore its clinical significance,as well as relationship with vascular endothelial growth factor（VEGF）and Ki67 antigen expressions.MethodsImmunohistochemistry was performed to measure CCL18,VEGF and Ki67 expressions in 58 paraffin?embedded CMM tissue specimens,as well as CCL18 expression in 20 paraffin?embedded pigmented nevus specimens,and immunofluorescence assay to confirm the expression of CCL18 in fresh CMM tissue specimens.Correlations of CCL18 expression with CMM clinicopathologic features,VEGF and Ki67 expressions were analyzed.ResultsCCL18 was detected in 49（84.48%）of 58 paraffin?embedded CMM specimens,but in none of the 20 paraffin?embedded pigmented nevus specimens,with a significant difference in the positive rate of CCL18 between the CMM group and pigmented nevus group（χ2=45.46,P＜ 0.01）.The expression of CCL18 in paraffin?embedded CMM tissues was positively correlated with Clark′s level and Breslow thickness of CMM（rs=0.609,0.644 respectively,bothP＜ 0.01）,and was significantly different between ulcerated and non?ulcerated CMM（P＜ 0.05）,as well as between patients with and without lymphatic metastasis（P＜ 0.05）.However,there were no significant differences in the expression of CCL18 among patients of different age,gender,or between acral and non?acral CMM（allP＞0.05）.In addition,the expression of CCL18 in CMM tissues was positively correlated with that of VEGF（rs=0.727,P＜ 0.05）,but unrelated to that of Ki67（P＞ 0.05）.Immunofluorescence assay showed CCL18 expression in the cytoplasm of tumor cells in CMM tissues.ConclusionCCL18 is highly expressed in CMM tissues,and may be involved in tumor invasion and metastasis.

Nevi and melanomas;Chemokine CCL18;Pathologic processes;Vascular endothelial growth factors;Ki?67 antigen

s:Xu Xiulian,Email:xxlqjl@sina.com;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

2016?01?29）

（本文編輯：尚淑賢）

徐秀蓮，Email：xxlqjl@sina.com；孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.10.002

國家自然科學基金（81272992）；江蘇省自然科學基金（BK2012505、BK20131063）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012505,BK20131063）