副銀屑病皮損及外周血TCRγ基因重排的檢測及其臨床意義探討

王曉明 薛峰 鄭捷

200025上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科

副銀屑病皮損及外周血TCRγ基因重排的檢測及其臨床意義探討

王曉明 薛峰 鄭捷

200025上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科

目的檢測副銀屑病患者皮損及外周血TCRγ基因重排并探討其臨床意義。方法20例副銀屑病患者，采用BIOMED?2多重PCR擴增體系檢測其皮膚及外周血TCRγ鏈基因重排，分析TCRγ基因重排與患者一般資料、臨床類型、組織病理表現（非特異表現和非典型表現）的相關性。結果20例副銀屑病患者皮損中，7例TCRγ基因重排陽性。11例外周血TCRγ基因重排檢測中3例陽性，其中2例皮損檢測亦陽性。皮損及外周血TCRγ基因重排與患者性別、年齡、病程、臨床類型均無關（P＞0.05），而皮損TCRγ基因重排陽性與蕈樣肉芽腫相關不典型表現有關（P＜0.05）。20例患者平均隨訪（44.85±18.48）個月，1例進展為蕈樣肉芽腫，2例痊愈。結論副銀屑病患者皮損TCRγ基因重排陽性可能與蕈樣肉芽腫相關不典型表現有關，結合組織病理不典型表現，提示有進展為蕈樣肉芽腫的可能。

類銀屑病；基因重排，γ鏈T細胞抗原受體；蕈樣真菌病

副銀屑病是一組病因未明的慢性鱗屑性炎癥性皮膚病，由于皮損形態不一，病理又無特異性改變，故有時診斷較為困難，尤其是與早期蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）的鑒別。目前學者們對副銀屑病與早期MF間的關系持不同觀點，WHO分類認為小斑塊型為良性疾病，而大斑塊型是腫瘤前的淋巴增生性疾病［1］。但近年來，副銀屑病進展為MF的案例屢有報道［2?6］。TCR基因重排檢測可作為MF與良性炎癥性疾病的輔助鑒別手段，但有文獻報道［2?3，5，7?10］，副銀屑病患者皮損或外周血中也可出現TCR基因重排陽性。我們檢測副銀屑病患者皮損和（或）外周血TCR基因重排，探討其臨床意義。

材料和方法

一、材料

1.標本來源：2009年4月至2014年8月就診于上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科的20例經臨床和組織病理確診的副銀屑病患者，臨床表現為淡紅色或紅褐色斑疹、斑丘疹、丘疹，上覆少量鱗屑，刮之無點狀出血現象，無自覺癥狀或稍有瘙癢，慢性病程。

2.主要試劑和儀器：DNeasy Blood&Tissue Kit（德國Qiagen公司），甲酰胺、Taq酶、Genescan?500LIZ、PCR擴增儀、DNA3130XL序列測定儀（美國ABI公司），Peak Scanner Software v1.0（德國Applied Biosystems公司），紫外分光光度計（上海昂拉儀器有限公司）。

二、方法

1.皮膚及外周血TCRγ基因重排檢測（TCR?γ?PCR?GSA方法）：①外周血及皮膚DNA的抽提：用DNeasy Blood&Tissue Kit抽提外周血及粉碎后的皮損處皮膚組織DNA，具體步驟按說明書操作；②模板DNA濃度及純度測定：用紫外分光光度計于260～280 nm波長下測量抽提的DNA樣本吸光度（A值），A260/A280值在1.8～2.0間即為純DNA樣本；③PCR擴增：TCRγ基因引物 VγJγ設計參照BIOMED?2法［11］，引物序列如表1所示；④PCR產物基因掃描：將熒光引物擴增的PCR產物進行基因掃描，采用ABIDNA3130XL序列測定儀測定，并使用Peak Scanner Software v1.0分析。上述TCRγ基因重排的檢測，每個樣本至少重復1次，若2次結果不一致，則進行第3次檢測，以至少有2次可重復性結果作為最終結果。

2.組織病理分析：20例副銀屑病病理表現歸為2種類型，一種為非特異性表現：表皮正常，或出現海綿水腫，可有淋巴細胞外滲，真皮淺層小血管周圍淋巴組織細胞浸潤，且無異形細胞；另一種為不典型表現，即與MF相關的表現：真表皮之間線性排列的淋巴細胞，緊密結合在基底層細胞，細胞可有異形性，淋巴細胞有時會聚集。

3.臨床隨訪觀察：自檢測皮損及外周血TCRγ基因重排之日起至2015年10月31日，對患者的臨床過程及預后進行隨訪觀察。

表1 TCRγ基因引物序列

4.統計學方法：采用SPSS12.0統計軟件，正態分布數據以x±s表示，不符合者以中位數M（P25～P75）表示。正態分布的計量資料采用獨立樣本t檢驗，非正態分布則采用秩和檢驗。計數資料R×C列聯表采用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、臨床資料

20例副銀屑病患者中，男8例，女12例，年齡7～74（47.9±17.07）歲，病程0～20年，中位病程2.5年。如表2所示，20例患者中，點滴型9例，大斑塊型3例，小斑塊型8例，所有患者均進行了皮損TCRγ基因重排檢測，共7例陽性，分別為點滴型2例，大斑塊型2例，小斑塊型3例；11例（點滴型6例、大斑塊型2例、小斑塊型3例）進行了外周血TCRγ基因重排檢測，共3例陽性，分別為點滴型1例，小斑塊型2例，后2例皮損檢測亦為陽性。組織病理出現不典型表現者6例，分別為大斑塊型3例、小斑塊型2例、點滴型1例。

二、皮損TCRγ基因重排與患者性別、年齡、病程、臨床類型、組織病理表現的關系

皮損TCRγ基因重排陽性的7例患者年齡（50.71±15.03）歲，13例陰性患者（46.38±18.47）歲，兩組比較，t=0.531，P=0.602；陽性組病程［M（P25～P75）為2（2 ～ 5）年，陰性組3（1 ～ 4）年，兩組經秩和檢驗，差異無統計學意義（P=0.643）。皮損TCRγ基因重排與性別、臨床類型均無關（均P＞0.05）。7例陽性者中5例有不典型病理表現，13例陰性者中僅1例有不典型病理表現，差異有統計學意義（P＜0.05），即皮損TCRγ基因重排陽性與MF相關不典型表現有關。見表2。

三、外周血TCRγ基因重排與性別、年齡、病程、臨床類型及病理表現的關系

3例外周血TCRγ基因重排陽性患者中2例皮損基因重排陽性，而8例外周血陰性患者中5例皮損陰性。3例外周血TCRγ基因重排陽性患者年齡（55.67±3.22）歲，8例陰性患者（39.5±16.05）歲，兩組比較，t=1.667，P=0.128；陽性組中位病程2年，陰性組3年，兩組經秩和檢驗，差異無統計學意義（P=0.776）。外周血TCRγ基因重排與性別、臨床類型及病理表現無關，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

四、隨訪觀察

20例副銀屑病患者自檢測TCRγ基因重排之日起隨訪16～80（44.85±18.48）個月。自皮損初發的時間為16～282（89.5±55.88）個月。2例痊愈（點滴型1例，小斑塊型1例）；1例大斑塊型患者在隨訪第18個月時通過病理檢查確診為MF，其前后2次病理表現見圖1，此例患者2次皮膚及外周血TCRγ基因重排結果一致（皮損檢測陽性，外周血檢測陰性）。17例患者病情反復（8例點滴型，2例大斑塊型，7例小斑塊型），但尚無皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）或其他腫瘤發生，繼續隨訪中。

表2 副銀屑病患者皮損與外周血TCRγ基因重排與患者性別、臨床類型及病理表現的關系（例）

討 論

PCR方法檢測TCR基因重排可以發現皮損及外周血中的T細胞克隆，為診斷CTCL提供重要線索。針對TCR中α、β、δ和γ 4種鏈的結構，目前可分別設計V區和J區通用引物進行PCR。但在CTCL患者中，TCRγ基因重排幾乎出現在所有T細胞淋巴瘤，其頻率高于其他3條鏈，而且γ基因的結構相對簡單，沒有可變D區域，利于設計PCR引物，擴增出更多可能的基因重排方式。因此，本研究選擇TCRγ基因作為TCR的克隆性分析的對象［12］。

本研究7例副銀屑病患者皮損TCRγ基因重排陽性，包括3例點滴型、2例大斑塊型及3例小斑塊型。11例外周血TCRγ基因重排檢測中3例陽性，包括 1 例點滴型及 2例小斑塊型。研究［2?3，7?8］顯示，大斑塊型皮損TCR基因重排陽性率為0～50%，Simon等［2］檢測12例大斑塊型皮損TCRγ基因重排，6例陽性。小斑塊型皮損TCR基因重排陽性率為0 ～ 66.7%［2?3，7?8］。Klemke等［3］分析了 5 例小斑塊型皮損TCRγ基因重排，2例陽性。而Bernier等［7］分析20例小斑塊型皮損TCRγ基因重排，未發現陽性者。文獻［13?15］顯示，良性炎癥性疾病（包括濕疹、銀屑病、扁平苔蘚、癢疹、藥疹等）皮損TCRγ基因重排陽性率為0～21.7%。既往研究中，66.7%（14/21）CTCL患者皮損TCRγ基因重排陽性，且皮損處陽性率較外周血高［16］。本研究結果與既往文獻比較，副銀屑病（尤其是大斑塊型）皮損TCRγ基因重排陽性率較高，與CTCL相近，故認為副銀屑病的TCRγ基因重排陽性的意義值得探討。

本研究中分別有3例大斑塊型、1例小斑塊型及1例點滴型出現不典型病理表現，且不典型病理表現與皮損TCRγ基因重排有關，即皮損TCRγ基因重排陽性患者易出現不典型病理表現。V?kev?等［17］回顧分析105例副銀屑病患者的病理表現，發現85%小斑塊型和54%大斑塊型可出現不典型表現，但該研究未檢測TCR基因重排情況。Bernier等［7］分析了88例副銀屑病患者的組織病理，顯示15%小斑塊型和23.5%大斑塊型有不典型表現。因此，皮損TCRγ基因重排陽性可能提示淋巴細胞的一種克隆增生模式，或可提示疾病的進展變化。本研究還顯示，外周血TCRγ基因重排與不典型病理表現無關。也有研究顯示，外周血TCRγ基因重排陽性患者均無不典型病理表現［7］，或未發生 CTCL［8］。因此，我們認為皮損中TCRγ基因重排陽性比外周血更具特異性，更有意義。

研究認為，從出現皮損至病理確診MF需要48～72個月［18］，本研究從患者出現皮損開始隨訪16～282個月。1例皮損TCRγ基因重排陽性的大斑塊型患者在隨訪第18個月時通過組織病理確診進展為MF，且其前后兩次組織病理顯示其初始的不典型表現逐步發展為典型早期MF的病理特點。既往研究顯示，10%～46%大斑塊型可進展為MF［4，17］。Simon等［2］對12例大斑塊型患者平均隨訪9年，1例發展為MF，且為皮損TCRγ基因重排陽性者。V?kev?等［17］對36例大斑塊型患者平均隨訪6年，35%進展為MF，其中16%早期組織病理有不典型表現，但研究未進行基因重排檢測。Bernier等［7］長期隨訪發現，皮損TCR基因重排陽性的大斑塊型進展為MF的概率是單純根據臨床病理診斷者的4倍［9］。因此，我們認為同時有皮損TCRγ基因重排陽性及不典型病理表現的大斑塊型應與其他大斑塊型區分開來，認為其有更高的概率發展為MF，二者結合對預測患者進展為MF有較大幫助，應加強對這類患者的隨訪觀察。

盡管WHO分類認為小斑塊型為良性疾病，但也有較多進展為MF的報道。本研究雖然病例數少，但顯示小斑塊型患者外周血TCRγ基因重排陽性率較高。Muche等［8］和Klemke等［3］研究顯示，小斑塊型患者外周血TCR基因重排陽性率較高，分別為64.3%、40%，但其實際臨床意義尚未明確，被稱為“未確定意義的T細胞克隆”。75歲以上正常老年人可出現外周血TCR基因重排陽性［19］，但本研究3例患者均為75歲以下，故其臨床意義仍需進一步研究。V?kev?等［17］平均隨訪10年，發現10%小斑塊型進展為MF，但未進行TCR基因重排檢測。本研究隨訪時間內未發現進展為MF的小斑塊型患者。Belousva等［5］報道1例小斑塊型進展為MF，該患者的外周血及新發生的斑塊皮損TCRγ基因重排陽性，而陳舊斑片皮損為陰性，鑒于小斑塊型外周血TCRγ基因重排陽性率較其他臨床類型及皮損處高，我們認為對伴有不典型病理表現的小斑塊型病例，應當重視對其隨訪。

本研究9例點滴型患者皮損TCRγ基因重排檢測中有3例陽性。Shieh等［10］研究顯示，點滴型皮損TCR基因重排陽性率為50%，這種差異可能是樣本量較小所致。此外，本研究1例點滴型患者的外周血TCRγ基因重排陽性，相對其他臨床類型也無明顯差異。本研究顯示，點滴型患者TCRγ基因重排陽性率相對低，且臨床過程多呈現良性慢性反復，有痊愈病例，無進展為MF的病例。既往文獻缺乏對點滴型患者TCR基因重排的分析，也鮮有點滴型進展為MF的案例［6］。因此，我們認為點滴型并非早期MF，但其TCRγ基因重排陽性的意義仍需進一步研究。

本研究顯示，副銀屑病患者的TCRγ基因重排陽性與性別、年齡、病程、臨床類型無明顯相關性，但皮損TCRγ基因重排與不典型病理表現顯著相關。隨訪中1例發展為MF，提示副銀屑病尤其是斑塊型可能與MF有關。皮損TCRγ基因重排陽性結合組織病理的不典型表現，可更好地提示進展為MF的可能性。這一結論還需大樣本研究證實。

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Detection of TCRγ gene rearrangements in skin lesions and peripheral blood of patients with parapsoriasis and their clinical significance

Wang Xiaoming,Xue Feng,Zheng Jie
Department of Dermatology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

ObjectiveTo detect TCRγ gene rearrangements in skin lesions and peripheral blood of patients with parapsoriasis,and to study their clinical significance.MethodsTotally,20 patients with parapsoriasis were included in this study.BIOMED?2 multiplex PCR was performed to detect TCRγ gene rearrangements in lesional skin（n=20）and peripheral blood（n=11）samples from the patients with parapsoriasis.Statistical analysis was performed to assess the relationship of TCRγ gene rearrangements with clinical types of parapsoriasis as well as general information and histopathological manifestations（including non?specific manifestations and atypical manifestations）of patients.ResultsTCRγ gene rearrangements were positive in lesional skin from 7 of the 20 patients,in peripheral blood from 3 of 11 patients,and in both lesional skin and peripheral blood from 2 patients.Positive TCRγ gene rearrangements in skin lesions were significantly correlated with mycosis fungoides（MF）?related atypical histopatho?logical manifestations（P＜ 0.05）,but those in neither skin lesions nor peripheral blood were correlated with gender and age of patients or clinical course and types of parapsoriasis（allP＞ 0.05）.During an average follow?up time of 44.85 ±18.48 months,1 case progressed into MF,and 2 were cured.Conclusions Positive TCRγ gene rearrangements in skin lesions of patients with parapsoriasis may be correlated with MF?related atypical manifestations.The presence of TCRγ gene rearrangements and atypical histopathological manifestations may suggest the possibility of progression from parapsoriasis into MF.

Parapsoriasis;Gene rearrangement,gamma?chain T?cell antigen receptor;Mycosis fungoides

Zheng Jie,Email:jie?zheng2001@126.com

鄭捷，Email：jie?zheng2001@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.08.010

2015?11?19）

（本文編輯：周良佳 顏艷）