程序性死亡分子1及其配體1在尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞的表達及意義

陳惠勇 楊文林 林立 黃新宇 尹嘉文 陳嘉惠

510260廣州醫科大學附屬第二醫院皮膚科

程序性死亡分子1及其配體1在尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞的表達及意義

陳惠勇 楊文林 林立 黃新宇 尹嘉文 陳嘉惠

510260廣州醫科大學附屬第二醫院皮膚科

目的研究程序性死亡分子1（PD?1）及其配體1（PD?L1）在尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞表面的表達，探討PD?1/PD?L1信號通路在尖銳濕疣患者細胞免疫中的作用。方法采用流式細胞儀檢測30例尖銳濕疣患者和20例健康對照者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1的表達及CD4+、CD8+T淋巴細胞計數，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法檢測血清中白細胞介素2（IL?2），干擾素γ（IFN?γ）的水平，比較兩組間的差異，分析尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平與CD4+、CD8+T淋巴細胞計數、細胞因子IL?2、IFN?γ的相關性。結果尖銳濕疣組CD4+、CD8+T淋巴細胞PD?1表達水平（分別為9.48%±3.31%和12.52%±3.17%）、PD?L1表達水平（4.40%±1.46%、7.07%±2.23%）分別高于健康對照組（PD?1：7.12%±2.16%、9.95% ± 2.17%，t=2.81、3.16，均P＜ 0.01；PD?L1：3.26% ± 1.13%、5.39% ± 1.69%，t=2.96、2.88，均P＜ 0.01）。尖銳濕疣組CD4+T淋巴細胞計數（727.43± 138.59個/μl）低于對照組（804.25± 92.83個/μl，t=2.17，P＜ 0.05），CD8+T淋巴細胞計數與對照組差異無統計學意義（t=1.24，P＞0.05），CD4+/CD8+比值（1.23±0.35）低于對照組（1.46± 0.34，t=2.24，P＜ 0.05）。尖銳濕疣組血清IL?2、IFN?γ水平均低于對照組（t=2.12、2.16，均P＜ 0.05）。相關分析顯示，尖銳濕疣患者外周血CD4+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平分別與CD4+T淋巴細胞計數、CD4+/CD8+比值、IL?2、IFN?γ水平均呈負相關（P＜ 0.05）；CD8+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平與CD4+/CD8+比值均呈負相關（P＜0.05），與CD8+T淋巴細胞計數無相關性（P＞0.05）。結論尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞高表達的PD?1可能通過與其配體PD?L1作用形成PD?1/PD?L1信號通路，抑制T淋巴細胞免疫應答，導致尖銳濕疣患者CD4+T淋巴細胞數量減少，CD4+/CD8+比值下降，IL?2、IFN?γ減少。

尖銳濕疣；T淋巴細胞；程序性死亡分子1；程序性死亡分子配體1

約90%的尖銳濕疣患者為人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）低危型（6、11型）感染引起［1］。HPV可通過影響抗原提呈細胞的黏附和遷移，改變細胞因子、趨化因子表達等復雜的機制［2］，發生逃逸現象，逃避宿主免疫系統的攻擊，致使病毒持續感染，反復發作。尖銳濕疣的特異性免疫主要是細胞免疫，其中T淋巴細胞為主要的效應細胞［3］。近年來，主要表達于活化的T淋巴細胞表面的負性共刺激信號分子陸續被發現，如程序性死亡分子1（programmed death?1，PD?1）和程序性死亡分子配體1（programmed death ligand?1，PD?L1）。研究顯示，PD?1/PD?L1信號通路可通過限制T細胞的激活和擴散，減少細胞因子的產生或擴散等，抑制效應T淋巴細胞的免疫表達［4］，引起T淋巴細胞功能減弱、無能甚至死亡［5］。本研究通過分析尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平與CD4+、CD8+T淋巴細胞計數、白細胞介素2（interleukin?2，IL?2）、干擾素γ（interferon?γ，IFN?γ）水平的相關性，探討PD?1/PD?L1信號通路在尖銳濕疣患者細胞免疫中的作用。

對象與方法

1.研究對象：2015年9-12月在我院皮膚科診斷為尖銳濕疣的30例患者納入尖銳濕疣組。納入標準：符合衛計委疾病控制司制定的尖銳濕疣診斷標準。排除標準：合并HIV感染等其他性病；合并自身免疫性疾病和其他過敏性疾病；合并腦、肺、心、肝、腎、血液等系統性疾病；合并乙肝等其他病毒感染性疾病；合并結核、腫瘤等疾病；1年內使用過免疫增強劑或免疫抑制劑；月經期、妊娠期、哺乳期婦女。來自我院體檢中心的健康者20例為對照組。所有研究對象均了解檢查項目并簽署知情同意書。

2.儀器和試劑：Navios流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），全自動酶標儀ELX800（美國BioTek公司）。流式細胞術抗體：藻紅蛋白?花青苷5標記的CD3抗體（CD3?PC5）、異硫氰酸熒光素標記的CD4抗體（CD4?FITC）、藻紅蛋白?得克薩斯紅標記的CD8抗體（CD8?ECD）（美國Beckman Coulter公司），PE標記的鼠抗人PD?1（PD?1?PE）、PD?L1（PD?L1?PE）抗體及各種同型對照IgG抗體（美國eBioscience公司）。人IL?2、IFN?γ ELISA試劑盒（中國杭州聯科生物技術股份有限公司）。

3.標本收集及處理：所有研究對象均抽取6 ml靜脈血，其中2 ml于肝素鋰抗凝管常溫保存，在6 h內用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平；2 ml于EDTA?K2抗凝管中常溫保存，在6 h內進行CD4+、CD8+T淋巴細胞流式細胞計數；余2 ml于干燥管在室溫下靜置1 h后離心（1 260×g，5 min），取上層血清置1 ml微量離心管中標號，-80℃冰箱保存備用。

4.T淋巴細胞表面PD?1及PD?L1的檢測：取3支流式細胞分析管，其中1支加入熒光素標記單抗CD3?PC5、CD4?FITC、CD8?ECD和PD?1?PE各5 μl，1支加入CD3?PC5、CD4?FITC、CD8?ECD和PD?L1?PE各5 μl，另1支中加入相應同型對照IgG?PE抗體。3支試管中各加肝素鋰抗凝血50 μl，室溫避光孵育15 min，加入經10倍稀釋的溶血素C 200 μl，靜置15 min后，加入2 ml磷酸鹽緩沖液（PBS），離心（310×g，5 min），棄上清，加500 μl PBS重懸后流式細胞儀檢測。

5.外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞計數測定：取2支流式細胞分析管，其中1支加入熒光素標記單抗CD3?PC5、CD4?FITC、CD8?ECD各5 μl，另1支加入相應同型對照IgG抗體。在2支試管中各加入EDTA?K2抗凝血50 μl，室溫避光孵育15 min，加入經10倍稀釋的溶血素C 200 μl，靜置15 min后，加入2 ml PBS，離心（310 ×g，5 min），棄上清，加500 μl PBS重懸，再加相應比例的熒光計數微球后，流式細胞儀檢測。

6.細胞因子IL?2、IFN?γ水平的檢測：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測血清中細胞因子IL?2、IFN?γ水平，嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書操作。

7.統計學處理：采用SPSS 22.0軟件，計量數據符合正態分布以x±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析；P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

1.一般情況：30例尖銳濕疣患者，男17例，女13例，年齡18～60（36.48±10.71）歲；20例對照者，男12例，女8例，年齡18～60（37.65± 10.14）歲。兩組在性別、年齡上的差異均無統計學意義，具有可比性。尖銳濕疣患者病程（2.16±0.48）個月。

2.外周血T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1的表達水平：尖銳濕疣患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1的表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01），見表1。

3.外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞計數、CD4+/CD8+比值、IL?2水平、IFN?γ水平：尖銳濕疣組CD4+T淋巴細胞計數、CD4+/CD8+比值、IL?2和IFN?γ水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），而其CD8+T淋巴細胞計數與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

4.相關分析：Pearson相關分析顯示，尖銳濕疣患者外周血CD4+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平分別與CD4+T淋巴細胞計數（r=-0.415、-0.450）、CD4+/CD8+比值（r=-0.407、-0.382）、IL?2（r=-0.393、-0.426）、IFN?γ水平（r=-0.412、-0.392）呈負相關（均P＜ 0.05）；CD8+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1的表達水平與CD4+/CD8+比值均呈負相關（r=-0.424、-0.455，均P＜0.05），而與CD8+T淋巴細胞計數無明顯相關性（r=0.272、0.166，均P＞0.05）。

表1 尖銳濕疣患者CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD?1及PD?L1表達水平（%，x±s）

討 論

尖銳濕疣由HPV感染所引起，HPV持續感染的關鍵環節是免疫逃逸導致的病毒清除障礙［6］，而HPV感染免疫逃逸機制可能與T淋巴細胞為主的細胞免疫功能障礙密切相關。T細胞活化不僅需要主要組織相容性復合體（MHC）分子將抗原肽遞呈給抗原特異性T細胞提供第一信號，還需要一些細胞表面共刺激分子（如CD28及B7等）傳遞協同刺激信號（第二信號）［7］，而PD?1和PD?L1則分別為CD28及B7的家族成員。PD?1主要表達于活化CD4+、CD8+T細胞上，在調節T細胞活化和耐受方面發揮關鍵性作用。PD?L1主要表達于T細胞、B細胞上，并已被證實在免疫耐受和調節自身反應性T、B細胞方面起關鍵性作用［8］。當PD?1與PD?L1結合形成PD?1/PD?L1信號通路后，可引發抑制信號的產生，下調細胞因子IL?2、IFN?γ的分泌及存活蛋白的表達，從而抑制T細胞的免疫反應［9］。Wang等［10］已證實了PD?1/PD?L1信號對T細胞免疫的負性調控作用。

文獻［11］報道，感染H1N1禽流感病毒的患者，T細胞表面的PD?L1表達水平與T細胞數量呈負相關，且PD?L1促進CD8+T細胞的凋亡并減少細胞因子的分泌，減弱T細胞對H1N1禽流感病毒的免疫反應。研究［12］還發現，高危型HPV患者的宮頸T細胞中PD?1和PD?L1表達顯著增加，并與上皮內瘤樣病變分級呈正相關。關于PD?1、PD?L1在尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞的表達情況目前仍不清楚。本研究結果顯示，尖銳濕疣組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1的表達水平均高于對照組，提示PD?1/PD?L1信號通路參與了尖銳濕疣的T淋巴細胞免疫。尖銳濕疣組外周血CD4+T淋巴細胞計數低于對照組，提示在尖銳濕疣的早期，CD4+T淋巴細胞的增殖已開始受到抑制，但兩組CD4+T淋巴細胞計數仍在正常范圍內，這可能是由于我們研究的尖銳濕疣組患者病程較短［（2.16±0.48）個月］，均為初發病例，而CD4+和（或）CD8+T細胞數量明顯改變并非短期內就能出現的。相關性分析顯示，尖銳濕疣組CD4+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平與CD4+T淋巴細胞計數均呈負相關，提示PD?1、PD?L1的高表達可能通過PD?1/PD?L1信號通路抑制了CD4+T淋巴細胞的增殖，導致CD4+T淋巴細胞數量減少。

表2 尖銳濕疣患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞計數、CD4+/CD8+比值、IL?2、IFN?γ水平（x± s）

CD4+T淋巴細胞根據分泌的細胞因子，可分為Th1和Th2兩類細胞。人體對HPV感染反應以Th1細胞介導的細胞免疫為主［13］，以分泌細胞因子IL?2和IFN?γ為特征。本研究結果顯示，尖銳濕疣組外周血IL?2、IFN?γ水平均低于對照組，且CD4+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1表達水平與IL?2水平、IFN?γ水平均呈負相關，提示CD4+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1高表達可使Th1細胞介導細胞免疫功能受到抑制，分泌細胞因子IL?2、IFN?γ減少。此外，尖銳濕疣組CD4+/CD8+比值低于對照組，且尖銳濕疣組CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD?1、PD?L1的表達水平與CD4+/CD8+比值均呈負相關。一般認為，尖銳濕疣患者CD4+T細胞計數降低而CD8+T細胞計數增高，引起CD4+/CD8+比值降低。也有研究［14］發現，CD8+T細胞計數無明顯變化，與我們的研究結果一致。提示CD4+/CD8+比值降低主要是由于CD4+T細胞降低引起，且在尖銳濕疣的細胞免疫缺陷中居主導地位。

本研究結果顯示，尖銳濕疣患者外周血T淋巴細胞PD?1、PD?L1表達上調，PD?1/PD?L1信號通路增強，可能負向調控了尖銳濕疣患者T淋巴細胞增殖，減少細胞因子分泌，引起HPV清除障礙而導致尖銳濕疣反復發作，提示PD?1/PD?L1信號通路與尖銳濕疣患者細胞免疫紊亂有一定關系。

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Programmed death?1 and programmed death ligand?1 expressions on peripheral blood T lymphocytes from patients with condyloma acuminatum and their significance

Chen Huiyong,Yang Wenlin,Lin Li,Huang Xinyu,Yin Jiawen,Chen Jiahui
Department of Dermatology,The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,China

ObjectiveTo measure the expressions of programmed death?1（PD?1）and programmed death ligand?1（PD?L1）on peripheral blood T lymphocytes of patients with condyloma acuminatum（CA）,and to investigate their role in cellular immunity in these patients.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 30 patients with CA（CA group）and 20 healthy human controls（control group）.Flow cytometry was conducted to detect the expressions of PD?1 and PD?L1 on the surfaces of peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes,and to determine the counts of CD4+and CD8+T lymphocytes.Enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to measure the levels of serum interleukin?2（IL?2）and interferon?γ（IFN?γ）.Statistical analyses were carried out to compare the above parameters between the two groups,and to assess the relationship of PD?1 and PD?L1 expressions with the counts of CD4+and CD8+T lymphocytes as well as with the serum levels of IL?2 and IFN?γ.ResultsThere was a significant increase in the expression rates of PD?1 and PD?L1 on CD4+T lymphocytes（PD?1:9.48% ± 3.31%vs.7.12% ± 2.16%,t=2.81,P＜0.01;PD?L1:4.40% ±1.46%vs.3.26% ±1.13%,t=3.16,P＜0.01）and CD8+T lymphocytes（PD?1:12.52%±3.17%vs.9.95%±2.17%,t=3.16,P＜0.01;PD?L1:7.07%±2.23%vs.5.39%±1.69%,t=2.88,P＜0.01）in the CA group compared with the control group.Moreover,the CA group showed significantly lower counts of CD4+T lymphocytes（727.43 ± 138.59/μlvs.804.25 ± 92.83/μl,t=2.17,P＜ 0.05）and CD4/CD8 ratio（1.23±0.35vs.1.46±0.34,t=2.24,P＜ 0.05）than the control group,while no significant difference was observed in CD8+T lymphocyte counts between the CA group and control group（613.60±121.60/μlvs.572.45±103.08/μl,t=1.24,P＞0.05）.The levels of serum IL?2 and IFN?γ were both lower in the CA group than in the control group（t=2.12,2.16,respectively,bothP＜ 0.05）.In the CA group,PD?1 and PD?L1 expression levels on peripheral blood CD4+T lymphocytes were both negatively correlated with CD4+T lymphocyte counts,the CD4/CD8 ratio,as well as IL?2 and IFN?γ serum levels（allP＜ 0.05）,and those on peripheral blood CD8+T lymphocytes were also negatively correlated with the CD4/CD8 ratio（allP＜ 0.05）,but uncorrelated with CD8+T lymphocyte counts（bothP＞ 0.05）.ConclusionPD?1 was highly expressed on peripheral blood T lymphocytes from patients with CA,which may inhibit T lymphocyte?mediated immune response,decrease CD4+T lymphocyte counts,the CD4/CD8 ratio as well as IL?2 and IFN?γ serum levels by interacting with its ligand PD?L1 and forming the PD?1/PD?L1 signaling pathway.

Condylomata acuminata;T?lymphocytes;Programmed death?1;Programmed death ligand?1

Yang WL,Email:yangwenlin@21cn.com

楊文林，Email：yangwenlin@21cn.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.08.006

2016?02?14）

（本文編輯：周良佳 顏艷）