顯色固液雙相培養基快速檢測結核分枝桿菌的臨床應用評價

王智存,白廣紅,施　婕,鄒遠嫵,王　卓,朱　蕾,李曉曉

(陜西省結核病防治院，西安 710100)

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·臨床研究·

顯色固液雙相培養基快速檢測結核分枝桿菌的臨床應用評價

王智存,白廣紅,施婕,鄒遠嫵,王卓,朱蕾,李曉曉

(陜西省結核病防治院，西安 710100)

目的探討固液雙相培養基快速檢測結核分枝桿菌的臨床價值。方法對350例患者的痰標本分別進行涂片抗酸染色、改良羅氏培養法、固液雙相培養法、Bactec 960培養法檢測。結果350例痰標本涂片抗酸染色法陽性率為14.8%，改良羅氏培養法為24.0%，固液雙相法為35.7%，Bactec 960培養法為40.3%，改良羅氏培養法與涂片抗酸染色法比較，差異有統計學意義(P<0.01)，固液雙相培養法與改良羅氏培養法比較，差異有統計學意義(P<0.01)，固液雙相培養法與Bactec 960培養法比較，差異無統計學意義(P>0.05)。改良羅氏培養法平均報告陽性時間為21.5 d，固液雙相培養法液相平均為13.2 d，固相為16.4 d，Bactec 960培養法平均為11.8 d。結論固液雙相培養法操作簡便，陽性率高，時間短，適合基層醫院快速檢測結核分枝桿菌。

結核分枝桿菌；培養； 結核病

全國第5次結核病流行抽樣調查報告，2010年全國人口有活動性肺結核患者499萬例，鄉村明顯高于城鎮，無癥狀肺結核患者比例明顯增加，有癥狀患者初診結核病院或?？漆t院僅占3.2%[1]。結核病防治的關鍵是早期診斷，早期治療。涂片抗酸染色率低(10%～20%)，我國普及和通用方法為改良羅氏培養法，但時間長(8周)，液體快速培養法(Bactec 960培養基等)營養成分高，速度快，平均報告陽性率時間13 d，但價格昂貴，需特殊儀器，不能在綜合醫院和基層醫院普及和應用。現探討結合液體和固體培養基特點，研究顯色固液雙相培養基應用于臨床的效果。報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料350例痰標本來自2014年5～12月該院門診和住院患者采集的清晨痰液，標本量3～5 mL，形狀為干酪痰、血痰、黏液痰，排除唾液樣痰標本，同一患者只使用1份痰標本。

1.2培養基改良羅氏培養基(7毫升/支)購自珠海貝索生物技術有限公司，Bactec 960培養基和添加劑購自BD公司，固液雙相培養基以改良羅氏培養基為基礎，加入含10%添加劑的7H9液體培養基4 mL，約占斜面的一半。

1.3方法

1.3.1痰標本消化處理痰標本涂片抗酸染色后加入1～2倍體積NALC-NaOH混合溶液震蕩，消化離心處理[2]。

1.3.2接種培養標本加200 μL至改良羅氏培養基和固液雙相培養基；Bactec 960 7H9培養基加標本500 μL，置Bactec 960中培養檢測。改良羅氏法還需37 ℃平臥放置斜面24 h后直立放置，培養后3、7 d觀察細菌生長情況，此后每周觀察1次，培養陽性隨報告羅氏培養基結果觀察及判斷參考《結核病診斷實驗室檢驗規程》進行[3]。固液雙相培養基第9天加入過濾除菌0.1 g/L刃天青(沃凱公司)顯色液30 μL至固液雙相培養基，顏色從藍色變為粉紅色,即利于細菌生長。

1.4統計學處理采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析，計數資料以百分率表示，組間比較使用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.14種方法檢測痰標本的結果比較改良羅氏培養法與涂片抗酸染色法比較，差異有統計學意義(χ2=9.34，P<0.01),固液雙相培養法與改良羅氏培養法比較，差異有統計學意義(χ2=11.466，P<0.01),固液雙相培養法與Bactec 960培養法比較，差異無統計學意義(χ2=1.55，P>0.05)；改良羅氏培養法污染率為2.0%，固液雙相培養法為2.6%，Bactec 960培養法為5.42%。見表1。

表1　　4種方法檢測痰標本結果比較

注：-表示無數據。

2.23種方法報告陽性時間結果比較改良羅氏培養法平均報告陽性時間21.5 d，固液雙相培養法液相13.2 d，固相16.4 d，Bactec 960培養法11.8 d。見表2。

表2　　3種方法培養結核分枝桿菌陽性耗時結果比較(n)

注：-表示無數據。

2.32種方法檢測陽性菌落結果比較固液雙相培養法與改良羅氏培養法陽性菌落(++、+++、++++)結果比較，差異有統計學意義(P<0.05)，菌落(+)差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　　2種方法檢測陽性菌落生長結果比較(n)

3　討　　論

探討適合我國結核病疫情的細菌學檢查方法，早期發現傳染源，規范治療避免耐藥性和減少疫情傳播極為重要。

結核分枝桿菌培養法作為結核病診斷的“金標準”，傳統羅氏培養法3～8 周才能得到結果，Bactec 960培養法等液體培養基營養豐富，可使用儀器進行連續監測，平均報告陽性時間為13 d，具有自動化和高靈敏度優點[4]。

本研究結果表明，涂片抗酸染色法陽性率為14.8%，改良羅氏培養法24.0%，固液雙相培養法為35.7%，Bactec 960培養法為40.3%。固液雙相培養法與涂片抗酸染色法、改良羅氏培養法比較，差異有統計意義(P<0.05)，與Bactec 960 培養法比較，差異無統計學意義(P>0.05)。固液雙相培養基采用固液雙相一體化統計，其營養豐富，可減少污染，提高陽性率，孔雀綠可進一步避免雜菌污染，分離純化獲得單個菌落，對結核分枝桿菌有促進生長的作用。培養陽性菌落直觀明白，省去抗酸染色步驟，減少工作量，為結核分枝桿菌藥敏試驗奠定基礎，Bactec 960培養陽性管中結核分枝桿菌形成條索狀[5]。7H9培養管培養基對菌液濃度配制時濁度影響，使細菌濃度較難控制，影響藥敏試驗中細菌接種量，造成藥物敏感試驗結果不準確。

改良羅氏培養法平均報告陽性時間21.5 d，固液雙相培養法液相平均時間13.2 d，固相平均時間16.4 d，Bactec 960培養法11.8 d。結核分枝桿菌生長緩慢：(1)標本經酸或堿處理后直接接種至培養基，至少需2～3 d 培養基才能緩沖酸堿，達到pH 7.2左右，而本組固液雙相培養基接種pH 6.8 PBS消化混合液后，減少培養基緩沖時間[6]。(2)細菌在固體培養基不能有效吸收營養成分而導致細菌對數生長期延長，改良羅氏培養基接種后需傾斜，平放斜面24 h以便細菌充分接觸培養基，細菌在雙相培養基內可使細菌浸泡在營養成分中以利于新陳代謝，對數生長期提前，省去改良羅氏培養基平臥放置斜面的操作，操作簡便快捷。液體培養基陽性標本呈絮狀沉淀生成，難以鑒別雜菌污染，而固液雙相培養基生長的菌落則呈典型菜花狀，易于判斷。刃天青是一種氧化還原指示劑，在氧化狀態呈紫藍色，且在還原狀態下呈粉紅色或紅色還原產物。通過培養結核分枝桿菌還原刃天青鹽從而判斷細菌是否生長[7]。該方法顯色劑用量少，不需儀器，比較方便，可快速檢測液相中是否有結核菌生長。實際應用中加入刃天青試劑后一般需要過夜培養。張朝寶等[8]研究XTT/mpms試劑只需繼續培養4 h，且XTT/mpms和TH9培養基37 ℃恒溫培養時間至少在7 d內保持相對穩定，其工作濃度對分枝桿菌具有低細胞毒性。

綜述所述，固液雙相培養法操作簡便，試劑成本低，陽性率高，不需特殊儀器，陽性平均時間比改良羅氏培養法提前1周，便于綜合醫院和基層醫院檢測結核分枝桿菌，具有一定的臨床價值。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.042

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1673-4130(2016)19-2756-02

2016-03-12

2016-05-17)