壓力對污泥中微生物種群結構特性的影響研究★

趙　聰　武照遠　張鴻斌

(天津市市政工程設計研究院，天津　300051)

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壓力對污泥中微生物種群結構特性的影響研究★

趙聰武照遠張鴻斌

(天津市市政工程設計研究院，天津300051)

為研究高壓條件對微生物的影響，選取穩定運行的A2O工藝中的好氧段污泥與新鮮污水混合進行高壓曝氣處理污水，待處理效果及微生物達到穩定后，用高通量測序對微生物進行多樣性與差異性分析，得到了高壓條件對微生物多樣性與差異性的影響。

污水，調壓反應器，微生物，高通量測序

污水中污染物的去除主要靠微生物，特定種類的微生物在污水中污染物去除方面可以起到特定的作用，比如生物脫氮主要包括三個階段：氨化反應、硝化反應和反硝化反應。氨化細菌參與氨化反應，亞硝化細菌和硝化細菌參與硝化反應，反硝化細菌參與反硝化反應。聚磷菌參與除磷反應[1-3]。因此污水中污染物的去除規律與系統內的微生物有著必然的聯系。污水處理工藝中涉及高壓的工藝很少，常見的只有深井曝氣工藝，且該工藝應用不多，研究也比較少[4,5]。因此高壓條件對降解污染物的微生物會產生怎樣影響的研究具有頗為重要的意義。

我們經常用DGGE、高通量測序等研究微生物。研究發現，DGGE反映的優勢種群有限，DGGE的監測結果經常會低估物種的微生物組成。高通量測序的手段在近幾年發展迅速，該種手段可以獲得大量的微生物信息，對微生物種群結構的研究更加準確和全面[6,7]。本文采用高通量測序對微生物進行種群結構的特性研究。污泥樣本取自11月份，分別為A2O工藝中的厭氧段、缺氧段、好氧段、工藝接種污泥、好氧段污泥經高壓培養后的污泥。本文主要分析好氧段、好氧段污泥經高壓培養后的污泥兩個樣本，考察高壓條件對微生物的影響。

1　實驗

1.1實驗用水水質及實驗接種污泥

本次試驗原污水采用哈爾濱工業大學二校區家屬區的生活污水，污泥來自實驗室中穩定運行、污染物去除效果良好的A2O反應器中的好氧段污泥。實驗時間為7月、8月，此時哈爾濱工業大學二校區家屬區的生活污水的水質狀況如表1所示。

表1　哈爾濱工業大學家屬區的生活污水7月、8月水質狀況

試驗接種的A2O反應器中的好氧段污泥參數如表2所示。

表2　試驗接種污泥情況

1.2實驗裝置與實驗方法

1.2.1實驗裝置

圖1為調壓反應器的結構圖，反應器的有效容積為10 L，工作壓力是0.7 MPa。由下至上主要零部件為進氣口、出水口、攪拌槳、排氣閥、電機、壓力表、磁力耦合器。空壓機通過進氣口給反應器供氣來為反應供氧，反應結束后通過出水口放出污水，排氣閥可以控制排出氣體的量，從而調節反應器內的壓力，壓力表顯示反應器內的壓力情況，從而及時調節反應的壓力。空壓機型號為EC51，空壓機有兩個作用，首先可以為反應提供充足的溶解氧，再者可以給反應器提供高壓。反應時將污水和污泥投入調壓反應器中，控制調壓反應器內的壓力，達到試驗的目的。調壓反應器實物見圖2，空壓機實物見圖3。

1.2.2實驗方法

試驗時間為7月份、8月份，兩月的平均水溫分別為17.1 ℃和17.7 ℃。將適量具有活性的污泥和污水混合后放入調壓反應器中進行污染物去除，此時測得污泥濃度為2.84 g MLSS/L。開啟空壓機，調節排氣閥，控制調壓反應器室內壓力(相對壓力)為0.7 MPa，每天曝氣兩次，每次3 h。每次試驗結束后監測污水處理效果，包括出水COD，氨氮，TN，TP，經過6 d后，處理效果達到穩定。此時采集污泥樣本后首先放在-80 ℃冰箱內冷藏，然后在室溫下解凍后，用10 mL離心管將污泥樣品放入離心機里離心。離心后把上清液去掉，取出有效的污泥樣本進行DNA提取，提取的試劑盒為Mobio土壤試劑盒。DNA提取后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，編號1～5樣品分別表示：1號：缺氧段污泥；2號：經高壓培養后的污泥(接種污泥來自好氧段);3號：厭氧段污泥;4號：工藝接種污泥;5號：好氧段污泥。文中只考慮2號、5號污泥樣品。樣品條帶清晰，參數如表3所示。

表3　DNA的濃度與純度

表3表示DNA提取成功，可以進行PCR擴增。本試驗測序類型為細菌16S rRNA，PCR擴增用的引物為515F(5′- GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。PCR的產物經過純化和定量以后，把等摩爾的有不一樣標簽序列混合，利用MiSeq測序儀測定基因序列。PCR反應體系見表4。

表4　PCR反應體系

2　結果與分析

微生物的多樣性與差異性分析:

1)微生物的多樣性分析。

通過高通量手段，使用97%相似度的OTU，得到5個樣品的稀釋性曲線(Rarefaction curve)。稀釋性曲線中橫坐標代表隨機抽取的測序數據量，縱坐標代表觀測到的OTU數量，它不僅可以表示測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也表明樣本的測序數據量是不是合適。曲線越平緩，測序數據量越合理，抽取更多的數據只會產生少量新的OTU，即可表觀樣品測序深度。

豐富度指數(Chao與ACE)、多樣性指數(Shannon)與OTU數量均可以反映樣品的多樣性，數值越大，說明樣品多樣性越好，豐富度越高。其中，Chao與Shannon是最常用的兩個指標，其中Shannon不僅可以表征物種的豐富程度，還可以體現物種在群落中的分布性。樣品多樣性參數見表5。

表5　樣品多樣性參數

如圖4所示，各個樣品編號意義如下：1為缺氧段污泥；2為經高壓培養后的污泥；3為厭氧段污泥；4為工藝接種污泥；5為好氧段污泥。這里只考慮2號和5號樣品。結合圖表可以看出，經高壓培養后的污泥的多樣性變大。系統內微生物種類越多，多樣性越大，系統的穩定性就會更強，能更好地抵御外界的沖擊負荷。可以看出，經過高壓培養后的好氧段污泥的微生物種類沒有減少，反而增多了，說明試驗的壓力并沒有淘汰掉大部分微生物，如此程度的壓力不會對微生物產生較大影響。

2)微生物的差異性分析。

Venn圖用來表征樣本中共有和獨有的OTU數量，可以直觀得看出樣本中OTU的重疊性(見圖5)。PCA分析圖將數據進行最大限度的簡化，反映在圖中即如果樣本距離越近，則樣本組成越相似(見圖6)。本節結合兩圖對微生物的差異性進行分析。

結合圖5，圖6可以看出，取自好氧段并經過高壓培養后的污泥與好氧段的差異性比較明顯，該污泥反而與缺氧段污泥比較接近。這可能與培養環境有關。因為高壓培養時對微生物進行高壓曝氣，然后泄壓停止曝氣，再繼續高壓曝氣，如此循環。泄壓后形成了較長時間的缺氧環境，可能導致了該污泥與缺氧段污泥比較相似。也從另一個角度說明了該試驗中的壓力不足以淘汰大量種類的微生物。

3　結語

本文為了考查壓力變化對微生物的影響，采用了高通量測序的手段對試驗工藝中的好氧段污泥和經過高壓培養后的好氧段污泥進行了試驗，包括DNA提取、PCR擴增和高通量測序。分析了樣品微生物的多樣性和差異性，得到了如下的試驗成果：

1)結合稀釋性曲線(Rarefaction curve)、豐富度指數(Chao與ACE)、多樣性指數(Shannon)與OTU數量研究微生物的多樣性表明，經高壓培養后的污泥的多樣性變大，說明經過高壓培養后的好氧段污泥的微生物種類沒有減少，反而增多了，試驗壓力并沒有淘汰掉大部分微生物，如此程度的壓力不會對微生物產生較大影響。

2)結合Venn圖和PCA分析圖對微生物的差異性進行分析表明，經高壓培養后的好氧段污泥與好氧段的差異較明顯，該污泥反而與缺氧段污泥比較接近，這可能與相似的培養環境有關。也從另一個角度說明了該試驗中的壓力不足以淘汰大量種類的微生物。

[1]吳昌永.A2O工藝脫氮除磷及其優化控制的研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學,2010:184.

[2]姜欣欣.基于A/O/A運行模式的SBR工藝脫氮除磷效能及其微生物特性研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學,2011:135.

[3]Yan P,Guo J,Wang J,et al.Enhanced nitrogen and phosphorus removal by an advanced simultaneous sludge reduction,inorganic solids separation,phosphorus recovery,and enhanced nutrient removal wastewater treatment process[J].Bioresource Technology,2015(183):181-187.

[4]張鐵軍.深井曝氣廢水處理技術的現狀及其發展[J].煤礦環境保護,2000(01):38-39.

[5]馮生華,蔣惠敏.從深井曝氣到雙威工藝的技術發展:全國小城鎮污水處理技術(設備)交流與工程咨詢研討會[C].珠海,2003.

[6]王興春.高通量測序技術及其應用[J].中國生物工程雜志，2012，32(1)：109-114.

[7]夏圍圍,賈仲君.高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價[J].微生物學報,2014(12):1489-1499.

On influence of pressure on the structural features of microbial population in sludge★

Zhao CongWu ZhaoyuanZhang Hongbin

(TianjinMunicipalEngineeringDesignInstitute,Tianjin300051,China)

In order to research the influence of the high-pressure on the microbial population, the paper selects the sludge at aerobic zones and fresh waste water mixture in A2O under the stable operation, undertakes the diversifying and differentiation analysis of the microbial population with the high-throughout sequencing after the treatment effect and the stability of the microbial population, and achieves the influence of the high-pressure on the diversification and differentiation of the microbial population.

waste water, pressure adjustment reactor, microbial population, high-throughout sequencing

1009-6825(2016)19-0104-03

2016-04-19★：國家科技重大專項研究任務(項目編號：2013ZX07201007-002-01)

趙聰(1991- )，男，助理工程師；武照遠(1978- )，男，高級工程師；張鴻斌(1981- )，男，高級工程師

X703

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