海洋潮間帶混凝土結構表面微生物群落組成研究★

孟　靜　尹繼龍

(交通運輸部天津水運工程科學研究院　水工構造物檢測、診斷與加固技術交通行業重點實驗室，天津　300456)

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海洋潮間帶混凝土結構表面微生物群落組成研究★

孟靜尹繼龍

(交通運輸部天津水運工程科學研究院水工構造物檢測、診斷與加固技術交通行業重點實驗室，天津300456)

通過對天津港海域水位變動區部位的混凝土進行鉆芯取樣，分析了混凝土表面生物膜的主要成分，并從蛋白質含量、多糖含量、核酸含量、腐殖質四方面進行了定量分析，探討了混凝土表面生物群落的基本架構，為后續生物膜對混凝土耐久性影響奠定了基礎。

海洋環境，混凝土，生物膜，鉆芯取樣

處于海洋環境中的結構物，特別是處于潮間帶的部分總是會被各種各樣的生物所覆蓋，形成一層類似于防護層的膜結構，稱為“生物膜”[1]。在以往混凝土結構耐久性研究中，很少考慮這種膜對氯離子在混凝土結構中的滲透影響[2]。文章通過提取一定量的樣品，從微觀角度進行成分分析，探討了混凝土表面生物群落的基本架構，為后續研究生物膜對氯離子在混凝土滲透中的作用，建立合理的氯離子滲透模型具有重要的意義。

1　工程概況

天津港地處渤海灣西端，位于海河下游及其入海口處，年平均氣溫12.3 ℃，年平均最高氣溫16.2 ℃，年平均最低氣溫9.1 ℃，極端最高氣溫39.9 ℃，極端最低氣溫-18.3 ℃，累積年平均相對濕度為65%。以該海域水工建筑物表面附著生物膜為研究對象，通過微觀角度來分析其組成。

研究對象選取該海域高樁碼頭樁帽位置混凝土。由于其處于水位變動區，上面長滿了各種生物，除常見的牡蠣，藤壺等，還有許多肉眼不可見的微生物[3，4]，且碼頭服役時間越長，附著量越明顯，這些生物附著在混凝土表面，生物本身及其代謝物和分泌物，形成了一層厚厚的膜，即為生物膜。由于位于碼頭下方，很多牡蠣表面都附著有厚厚的黑色油脂，用手使勁一掰，就能掰下部分牡蠣殼，大部分活牡蠣都緊密的粘在混凝土表面，用錘子砸，可見鮮活的牡蠣肉，其外殼密密麻麻、層層疊疊的粘在混凝土表面，粘結力十分強，需用工具才能將其“鏟下”，且還不能完全清除。從現場近距離來看，膜在混凝土表面的覆蓋程度也是不均勻的，但從常識來判斷，即使是表面看起來“干凈”的部位，只要處于水位變動區，其上面肯定也是生活了許多微生物及其分泌、代謝產物。從生物在混凝土的空間分布來看，以水位變動區中間位置開始，向上、向下均呈現出逐漸減少的趨勢，詳見圖1。

2　鉆芯取樣

混凝土芯樣按照CECS 03—2007鉆芯法檢測混凝土強度技術規程的規定[5]進行，取直徑為±10 mm，長度±20 mm的圓柱體芯樣。另外，為了采集到大量的生物膜信息，在取芯樣的同時，用工具將其附近生物膜強行整體剝落。

3　樣品生物膜成分測定

3.1實驗方法

對混凝土表面生物膜分析，包括蛋白質、多糖、核酸、腐殖質等四個方面的測定。

1)樣品處理。將樣品用干凈的刷子及一定體積的蒸餾水反復沖刷，超聲15 min后，離心取上部清液，即為待測溶液。

2)蛋白質含量測定。蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法(Bradford法)：其原理是蛋白質與考馬斯亮藍G-250可定量結合，結合后，其對可見光的最大吸收峰從465 nm變為595 nm。在考馬斯亮藍G-250過量且濃度恒定的情況下，溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍G-250從吸收峰465 nm轉變成吸收峰為595 nm，且該轉變有一定的數量關系。一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在595 nm處的吸光度基本能保持線性增加。該染色法簡單迅速，干擾物質少，靈敏度高，已廣泛應用于蛋白質含量的測定，結果如圖2所示。

3)多糖含量測定。多糖含量的測定方法為苯酚—硫酸法，主要利用多糖在硫酸的作用下會水解為單糖，單糖會迅速脫水生成糖醛衍生物，再與苯酚生成橙黃色化合物的特性，用紫外可見分光光度計在490 nm下測定吸光度值，結果如圖3所示。

表1　測定結果匯總

4)核酸含量測定。核酸含量測定是利用核酸、核苷酸及其衍生物都有共軛雙鍵，具有紫外吸收的特性，且RNA和DNA的紫外吸收峰均為260 nm，使用微量核算蛋白分析儀在260 nm下可直接

讀出核酸含量。

5)腐殖質的測定。腐殖質測定方法為改進的Lowry法，其原理是在Lowry法測蛋白質含量的基礎上稍加修改，測定添加和不添加硫酸銅時顏色的變化所引起的500 nm下吸光度值的變化。添加硫酸銅時顏色變化是由于腐殖酸化合物和顯色氨基酸共同產生的。不添加硫酸銅時由牛血清白蛋白(BSA)而產生的顏色降低到20%，但腐殖酸的并沒有減少。根據式(1)～式(4)進行計算：

Atotal=Aprotein+Ahumic

(1)

Ablind=0.2Aprotein+Ahumic

(2)

Aprotein=1.25(Atotal-Ablind)

(3)

Ahumic=Ablind-0.2Aprotein

(4)

其中，Atotal為添加硫酸銅時的總吸光度；Ablind為未添加硫酸銅時的總吸光度；Ahumic為腐殖酸化合物產生的吸光度；Aprotein為蛋白質產生的吸光度。

3.2測定結果

測定結果匯總見表1。

4　結語

通過比較不同批次樣品的蛋白質含量，多糖含量，核酸含量，腐殖質的差異可以比較得出：1)3月3日樣品生物膜成分含量較高，3月16日樣品次之，而其余三個批次的樣品生物膜成分含量較少，說明可能前兩個批次樣品產胞外聚合物的微生物較多；2)同時從整體來說，生物膜成分含量偏低，分析是由于季節原因，微生物活力較低，且生物膜分布不均勻；3)為以后的不同季節生物膜成分分析提供了有效的方法，此外，已經分析得出的生物膜成分架構為后續的生物膜對混凝土耐久性影響的研究提供科研數據。

[1]譚智軍.海洋生物膜對海洋混凝土抗氯離子滲透性的影響[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學，2010.

[2]朱志偉.氯離子侵蝕下帶裂縫鋼筋混凝土結構耐久性分析方法研究[D].天津：天津大學，2013.

[3]呂建福.長期暴露的海工混凝土性能與顯微結構分析[J].中國礦業大學學報，2010，39(4)：528-533.

[4]樂建新.混凝土中微生物的侵蝕機理及其控制的研究[J].山東建材，2007(5):61-63.

[5]CECS 03—2007，鉆芯法檢測混凝土強度技術規程[S].

On concrete structure surface microbial community composition in the ocean intertidal zone★

Meng JingYin Jilong

(TianjinResearchInstituteforWaterTransportEngineering,MOTKeyLaboratoryofHarbor&MarineStructureSafety,MinistryofCommunications,Tianjin300456,China)

Through carrying out concrete drill core sampling of Tianjin harbor water level fluctuating parts, the paper analyzes major concrete surface biological membrane compositions, carries outs quantitative analysis from aspects of protein content, polysaccharide content, nucleic acid content and humus, and explores basis concrete structure surface microbial community frame, which has laid a foundation for studying the impaction of continuous biological membrane upon concrete durability.

ocean environment, concrete, biological membrane, drill core sampling

1009-6825(2016)19-0023-02

2016-04-25★：中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(項目編號：TKS13014)

孟靜(1981- )，女，副研究員

TV331

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