通過CRISPR Cas/9系統敲除ICP227蛋白基因抑制單純孢疹病毒HSV-1的復制

●李昭君

通過CRISPR Cas/9系統敲除ICP227蛋白基因抑制單純孢疹病毒HSV-1的復制

●李昭君

CRISPR-Cas9 基因編輯技術是基于細菌或古細菌 CRISPR 介導的獲得性免疫系統衍生而來，由一段 RNA通過堿基互補配對識別 DNA，指導Cas9 核酸酶切割識別的雙鏈 DNA，誘發同源重組或非同源末端鏈接，進而實現在目的 DNA 上進行編輯。病毒通過特異的受體侵染細胞[1]，其基因組在細胞內發生復制、轉錄、翻譯等過程完成其生活周期，某些 DNA 病毒或逆轉錄病毒基因組會整合到宿主基因組中。基因治療是病毒感染疾病治療的新趨勢，因此，基因編輯技術在持續感染的病毒或潛伏感染病毒疾病治療中具有重大的潛在意義。本文我們利用 CRISPR-Cas9 敲除HSV-1病毒復制過程中重要基因，從而抑制病毒的復制，對病毒感染的治療中有重要意義。

CRISPR Cas/9系統；ICP27蛋白；HSV-1病毒

隨著測序技術以及大數據信息科學的發展，越來越多導致疾病的基因突變己經被發現。不僅如此，如今的技術己經可以預測一些疾病的發生可能與基因組上哪些DNA突變相關。近十年來，ZFN和TALE N人工核酸酶的出現改變了整個基因編輯領域過去的面貌。但是ZFN的特異有時受到相鄰模塊的影響，TALEN的DNA結合域存在大量的重復序列，給載體的構建帶來相當的難度，因此并沒有被廣泛應用。就在TALEN技術出現后不久，CRISPR／Cas技術的出現很好地解決了這些問題。CRISPR／Cas系統的核心由Cas9蛋白以及單鏈引導RNA（sgRNA）組成。前者扮演核酸酶的作用，后者則負責引導Cas9蛋白與靶序列的結合。CRISPR／Cas系統要發揮功能必須滿足兩個條件：一個是SgRNA與靶點DNA序列按照堿基互補原則配對；另一個是在與SgRNA配對的靶序列3＇端必須緊跟PAM序列。由于CRISPR／Cas系統靶向新的靶點只需要合成新的SgRNA，相較于ZFN和TALEN更為靈活，且操作簡便，效率更高，所以在基因編輯領域中被廣泛應用。

1 實驗原理

CRISPR/Cas9系統包含兩大部分，一個是前間區序列臨近基序PAM(NGG)序列，它主要起定位功能，Cas9必須識別出PAM序列才會切割病毒DNA。 PAM序列的存在阻止了Cas9攻擊細菌自身包含記憶的DNA 。另一部分就是向導序列sgRNA ，sgRNA的設計和選擇是Crispr-Cas9技術的精髓，也是實驗是否成功的關鍵一 步。sgRNA決定了Cas9的靶向性和特異性。對于目前廣泛應用的土壤農桿菌系 統來說：sgRNA序列的3‘端必須是NGG序列（Cas9會在PAM序列5‘端大約3bp處對DNA 序列進行切割。

2 實施方法設計

2.1 目的基因的CDS區域選擇

2.1.1 選擇依據

HSV-1基因可分為立即早期基因（IE）、早期基因（E）、和晚期基因。立即早期基因轉錄出現在病毒的DNA復制之前，立即早期基因轉錄后，激活隨后的早期基因和晚期基因，引起病毒的復制及感染。其中，ICP27蛋白就屬于IE基因編碼的蛋白之一[2]，在HSV-1生命周期的IE期產生，主要調節病毒和宿主細胞mRNA的合成與成熟，敲除ICP27可阻斷HSV-1病毒的復制，是HSV-1復制必需的高保守蛋白，而且與其他孢疹病毒的基因產物存在較高的同源性。因此我們決定將Crispr的靶序列定位在ICP27蛋白的編碼區（CDS區域）。

2.1.2 查找CDS區域

我們通過NCBI網站查找ICP27的編碼區 ，首先通過文獻查閱，得知HSV-1的登錄號為NC001806, 通過查找HSV-1之后查找ICP27蛋白，最終得到ICP27蛋白的CDS區的堿基序列，大約1500多個堿基對。

2.2 選擇最佳目標序列，確定剪切位點

運行http∶//crispr.mit.edu/ 分析軟件，將編碼ICP27 蛋白的CDS序列分段輸入到在線免費設計sgRNA的軟件Input框中，然后進行設計運算，會按照分數由高到低自動輸出目標序列，從中選取分數最高，脫靶最少的目標序列進行設計。通過分析比對，我們得出一條得分最高，脫靶最少的一條序列，即GATACTCGACGCCGCTCGCC CGG。

2.3 重組載體的構建

重組載體中需包含sgRNA, 表達Cas9蛋白的基因，以及篩選用的EGFP(增強綠色熒光蛋白)或者Puro(嘌呤霉素)，然后給予公司合成。

2.4 重組載體的轉染與篩選

需先摸索病毒與細胞的使用比例，即 MOI 值。使細胞感 染慢病毒，經適宜濃度的 Puro進行抗藥性篩選或使用EGFP(增強綠色熒光蛋白) 進行熒光測定，得到穩定表達 CAS9 和 sgRNA 的混 合克隆細胞株，實現對目的基因的敲除。

2.5 檢測sgRNA活性

靶序列經過 CAS/sgRNA 切割后由于缺乏修復模板，將主要以非同源重組的 方式進行修復。因此將靶序列 PCR 擴增后經過變性，退火，將形成錯配。錯配酶將 識別錯配的雜合雙鏈并且剪切。產物跑電泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例， 即可反映出 Cas9/sgRNA 的活性。

2.6 驗證sgRNA有效性

培養病毒細胞，觀察細胞的死亡率。若sgRNA序列有效，則導入sgRNA序列的細胞能殺死病毒，比現有藥物更有效。

3 結語

由 細 菌 免 疫 系 統 衍 生 的 新 的 基 因 編 輯 技 術 CRISPR-Cas9 與ZFN 和TALEN 相比較，具有設計簡單、應用靈活、操作簡便等優點，在敲除細胞表面受體和切割病毒基因組、抑制病毒復制中有顯著效果。可以說，在未來臨床應用以及基因治療中還有很長的一段路要走，還有很大改進空間，比如提高 Cas9編輯的準確性，避免脫靶現象出現[3]；高效的導入細胞方法以及確保細胞靶向性等等。研究人員需要不斷 優 化系 統 ， 通 過 改 造 CIRSPR 編 輯 方 法 ，降低脫靶效應；采用腺病毒載體提高 Cas9基因轉導效率等。CRISPR-Cas9 作為新的基因編輯技術，在慢性病毒感染或潛伏病毒感染疾病中具有巨大的潛在科學研究和臨床治療意義。

（作者單位：山東中醫藥大學）

[1]殷利眷,胡斯奇,郭斐. CRISPR-Cas9基因編輯技術在病毒感染疾病治療中的應用[J]. 遺傳,2015,(05):412-418.

[2]賈麗潔. ICP27特異性siRNA抑制HSV-1病毒復制的實驗研究[D].鄭州大學,2010.

[3]趙海衛,呂欣,尹文. CRISPR/Cas9系統——靶向基因組編輯的新策略[J]. 中國病原生物學雜志,2015,(03):281-284.