離子液體/季銨鹽輔助氯過氧化物酶促氧化合成聚酚

王圣潔, 劉麗霞, 蔣育澄,2, 胡滿成,2, 李淑妮,2, 翟全國,2

(1. 陜西師范大學化學化工學院, 2. 大分子科學陜西省重點實驗室, 西安 710119)

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離子液體/季銨鹽輔助氯過氧化物酶促氧化合成聚酚

王圣潔1, 劉麗霞1, 蔣育澄1,2, 胡滿成1,2, 李淑妮1,2, 翟全國1,2

(1. 陜西師范大學化學化工學院, 2. 大分子科學陜西省重點實驗室, 西安 710119)

基于氯過氧化物酶(CPO)催化氧化苯酚衍生物單體, 建立了一個聚酚的綠色合成體系. 以對苯基苯酚、 對甲基苯酚、 4-乙基苯酚、 對羥基肉桂酸、 對異丙基苯酚和鄰甲基苯酚等6種底物為考察對象, 以聚合物的產率、 聚合度及熱穩定性為評價指標, 研究了體系中引入離子液體(ILs)或季銨鹽(QAS)以及底物結構和反應微環境等對聚合反應和聚合物性質的影響. 結果表明, 引入少量咪唑類ILs或QAS可有效提高產物收率, 其中ILs/QAS的陽離子基團越大和疏水鏈越短, 越有利于酶催化聚合反應的進行; 而ILs/QAS添加量的影響則呈現“鐘罩”型規律. 同時, 苯酚對位取代遠比鄰位取代有利于聚合反應進行; 而對位取代基中烷基類給電子基團比芳香基取代更有優勢, 所得聚合物的聚合度和熱穩定性相對增大, 但隨著取代基團的增大, 其空間位阻不利于聚合物產率的提高; 反應體系的pH應控制在弱酸性至近中性, 以避免競爭性的副反應的發生; 而氧化劑H2O2則需要采用間歇式加入以抑制瞬時過濃導致CPO活性中心卟啉環的氧化損傷. 基于CPO的活性中心結構分析了聚合機理.

氯過氧化物酶; 聚苯酚; 離子液體/季銨鹽; 底物結構; 反應微環境

酚類聚合物中以酚醛樹脂的應用最為廣泛, 可用于制造各種塑料、 涂料、 膠粘劑及合成纖維等[1～5]. 這類材料由苯酚與甲醛聚合而成, 但由于甲醛的毒性使其生產和使用都受到限制[1], 所以人們一直在尋求盡量少用或者避免使用甲醛制備酚醛樹脂的合成方法或者可以替代酚醛樹脂的聚酚產品, 以解決傳統工業生產中的污染問題.

近年來, 人們發現一些過氧化物酶能夠催化H2O2氧化苯酚或使其衍生物單體聚合, 所獲得的聚酚熱穩定性較好, 有替代酚醛樹脂的潛力. 由于酶促反應條件溫和, 環境友好, 過程易控, 選擇性好等優勢引起了人們的極大興趣, 其中研究最多的是將辣根過氧化物酶[6～8]和漆酶[9,10]用于聚酚合成. 但這些酶促聚合反應都是在水溶液中進行, 受有機底物水溶性的制約, 使聚合物的產率較低, 通常需要加入有機溶劑作為共溶劑. 然而大多數酶是親水性的, 有機溶劑會使酶分子表面的水化層被破環而導致活性受損, 甚至完全失活, 同時有機溶劑的引入也不利于反應的綠色化.

本文采用氯過氧化物酶(CPO)催化H2O2氧化5種酚類衍生物單體聚合, 制備了相應的聚酚, 通過引入少量咪唑類離子液體或季銨鹽可有效提高單體的聚合效率并提高聚合物的熱穩定性. 所選用的CPO兼具過氧化物酶、 過氧化氫酶和細胞色素P-450的催化功能, 目前被認為是血紅素過氧化物酶家族中催化活性最廣泛的酶[11～18]. 反應過程一步完成, 綠色環保; 所得聚合物純度較高, 反應中所需的酶用量極少.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

各種酚衍生物包括對苯基苯酚、 對甲基苯酚、 4-乙基苯酚、 對羥基肉桂酸、 對異丙基苯酚和鄰甲基苯酚; 咪唑類離子液體:溴化1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM][Br])、 溴化1-丙基-3-甲基咪唑([PMIM]·[Br])、 溴化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM][Br]); 季銨鹽包括四甲基溴化銨(TMABr)、 四乙基溴化銨(TEABr)、 四丙基溴化銨(TPABr)、 四丁基溴化銨(TBABr). 上述試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司. 十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、 30%(質量分數)過氧化氫及其它化學試劑均購自西安化學試劑廠. 以上試劑均為分析純, 所有溶液均以超純水配置(R>18.25 MΩ·cm).

真菌Caldariomycesfumago的培養及CPO的提純參照Hager等[19]的方法, 但在酶的提純階段用丙酮代替甲醇進行沉淀. 將所提取的酶溶液濃縮至7.4 mg/mL, 置于4 ℃冷柜保存. Monochlorodimedon(MCD)氯化反應分析表明CPO氯化活性為5700 U/mL; 2,2′-聯氯-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)氧化反應分析表明CPO氧化活性為3400 U/mL; CPO純度達到Rz=1.09(Rz=A398/A280=1.44, 視為純酶).

EQUINX55型傅里葉變換紅外光譜儀(德國Brucher公司); UV-1700型紫外-可見分光光度計(島津國際貿易上海有限公司); Q50熱分析系統(美國TA公司); Agilent1100-Esquire6000型液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS, 德國布魯克公司); Q600 SDT熱重差熱聯用分析儀, 美國TA公司; Q1000 DSC型熱重分析儀.

1.2實驗過程

向100 mL樣品管中依次加入50 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH= 5.5)和酚衍生物底物(終濃度達到0.1 mol/L), 用恒溫磁力攪拌器在25 ℃及固定轉速下持續攪拌. 然后加入CPO(終濃度達到1.5×10-7mol/L), 聚合反應用H2O2啟動, 采用間歇式加入H2O2, 每10 min滴加一次5%的雙氧水, 每次滴加8 μL, 共滴加500 μL, 12 h后終止反應. 將產物離心20 min后真空抽濾, 用50%(體積分數)的乙醇洗滌以除去過量的底物、 表面活性劑以及少量的CPO和H2O2, 于70 ℃下烘干得到粉末狀產物. 聚合物的產率根據下式計算:

引入ILs或QAS時步驟同上, 其中ILs(25 ℃時液態存在)的添加量為5%(體積分數), QAS(25 ℃時固態存在)的添加量達到終濃度0.08 mol/L.

紅外光譜表征采用KBr壓片. 熱分析溫度范圍:-180～725 ℃; 靈敏度:0.2 μW; 加熱速率:0.01～200 ℃/min; 溫度范圍:室溫～1500 ℃; 靈敏度:0.1 μg. 產物用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后測定紫外-可見光譜, 掃描范圍:200～900 nm. 樣品以甲醇溶解后以Agilent 1100-Esquire 6000 LC-MS分析檢測其聚合度.

2　結果與討論

2.1產物表征

5種苯酚衍生物的結構如圖1所示.

Fig.1　Phenols compounds used in the polymerization catalyzed by CPO(A) p-Methyl phenol; (B) p-ethyl phenol; (C) p-propyl phenol; (D) p-phenyl phenol; (E) p-hydrox-cinnamic acid.

2.1.1聚合物FTIR分析以對苯基苯酚及對甲基苯酚的反應產物為例, 其CPO催化聚合反應產物的紅外光譜如圖2所示. 其中3450～3490 cm-1的特征吸收峰歸屬為酚羥基的伸縮振動, 3100 cm-1的特征吸收峰歸屬為飽和烷烴的碳氫伸縮振動, 1600～1400 cm-1的特征吸收峰歸屬為苯環骨架的伸縮振動, 1100 cm-1的特征吸收峰歸屬為碳氧鍵的伸縮振動. 4-乙基苯酚、 對羥基肉桂酸和對異丙基苯酚的反應產物的紅外圖譜也同樣表明:CPO催化H2O2氧化苯酚衍生物的產物為聚酚, 即這5種酚類衍生物單體都發生了聚合.

Fig.2　FTIR spectra of phenyl polymers(A) Polymer of p-phenyl phenol; (B) polymer of p-methyl phenol.

通過對比實驗表明, 如果反應體系中僅加入氧化劑H2O2, 無CPO存在, 則沒有聚合物出現, 這說明酚衍生物聚合歸因于CPO的催化.

2.1.2液相色譜-質譜聯用采用液相色譜-質譜聯用分析檢測聚合物的聚合度, 根據質譜圖中的分子離子峰的質荷比(m/z值)來測定單體的聚合數.

Fig.3　Mass spectrum of the product of CPO-catalyzed oxidation of p-phenyl phenol

圖3為對苯基苯酚的聚合產物的質譜圖. 根據質譜檢測的結果, 對苯基苯酚、 對甲基苯酚、 4-乙基苯酚、 對異丙基苯酚、 對羥基肉桂酸等5種酚衍生物的單體聚合數分別可以達到4～7, 7～8, 10～13, 13～14以及3～4.

2.1.3熱分析差示掃描量熱分析及熱重分析表明所獲得的聚酚都表現出較好的熱穩定性, 分解溫度都在150 ℃以上. 以不同底物為單體制備的聚酚的熱分解溫度分別為對苯基苯酚:170 ℃; 對甲基苯醛:160 ℃; 4-乙基苯酚:155 ℃; 對羥基肉桂酸 120 ℃. 同時空氣氣氛中對甲基苯酚和對羥基肉桂酸的聚合物分別在575 ℃和600 ℃完全分解, 而在氮氣氣氛中超過1000 ℃時仍分別有30%和17%的聚合物存在.

2.2離子液體/季銨鹽對酚衍生物聚合反應的影響

Fig.4　Comparison of different phenols polymerization catalyzed by CPO in aqueous buffer in the presence of 0.08×10-3 mol/L TMABr to that in pure buffer aqueousa. p-Phenyl phenol; b. p-hydroxy-cinnamic acid; c. p-methyl phenol; d. p-ethyl phenol; e. p-propyl phenol.

由于受底物水溶性的制約, CPO催化H2O2氧化酚衍生物單體在水溶液中聚合的產率很低. 本文引入少量離子液體或季銨鹽可大大提高目標產物的產率. 對苯基苯酚、 對羥基肉桂酸、 對甲基苯酚、 4-乙基苯酚、 對異丙基苯酚等5種酚衍生物聚合物的產率(圖4)可分別提高81%(5.3%→86.5%), 55%(5.1%→60.22%), 45%(5%→50.67%), 32%(4.8%→37.4%)和25%(3%→28%).

離子液體與季銨鹽都具有“兩親”性結構, 即同時擁有親水性的“頭基”和疏水性的“尾”鏈(烴基), 因此在離子液體/季銨鹽的“介導”下, 親水性的CPO分子與疏水性的底物之間能夠有效接觸, 這是聚合物產率提高的原因之一; 此外, 反應體系中有離子液體/季銨鹽存在時, 聚合物能夠更好地成鏈并生長; 同時, 與有機溶劑相比, 兩親性的離子液體/季銨鹽對酶蛋白分子表面水化層的破環導致的酶活性損失也小得多, 因而酶分子對離子液體/季銨鹽的耐受性更強, 使其與有機溶劑相比較在反應體系中可以添加至較高的比例[20,21].

本文所選用的咪唑類離子液體包括溴化1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM][Br])、 溴化1-丙基-3-甲基咪唑([PMIM][Br])、 溴化1-丁基-3-甲基咪唑([BMIM][Br]). 季銨鹽包括四甲基溴化銨(TMABr)、 四乙基溴化銨(TEABr)、 四丙基溴化銨(TPABr)和四丁基溴化銨(TBABr)等. 陰離子皆為Br-而不是Cl-, 這是為了避免Cl-在CPO催化的氧化反應中與酚衍生物底物形成競爭.

聚酚的產率也受ILs/QAS添加量的影響. 本文在2%～20%的離子液體和0.02～0.2 mol/L季銨鹽的范圍內考察了添加劑含量的影響, 結果如圖5所示(以對苯基苯酚為例). 總體來看, QAS的效果要優于ILs, 但兩者都呈現“鐘罩”型的變化趨勢. 反應初期, 隨著添加劑含量的增加, 聚合物產率迅速增加, 到達一個極值后開始降低, 表明此時CPO的活性開始受損. 引入0.08 mol/L TMABr的反應體系中聚酚的產率可達到最大值86.5%. 在沒有酶存在的ILs/QAS體系中對苯基苯酚未發生聚合.

Fig.5　Effect of ILs/QAS content on the p-phenylphenol polymerization (A) Imidazolium ILs. a. [EMIM][Br], b. [PMIM][Br], c. [BMIM][Br]; (B) QAS. a. TMABr, b. TEABr, c. TPABr, d. TBABr.

同時ILs/QAS的結構也會影響底物的聚合產率. 離子液體中陽離子烴基鏈的長短影響著酶蛋白分子的穩定性, 較短的烴基鏈更有利于蛋白的二級結構的穩定. 本文聚合物的產率隨著ILs/QAS陽離子烴基鏈的增長而下降. 其中烴基鏈最短的季銨鹽四甲基溴化銨(TMABr)的效果最好, 反應體系中引入TMABr時可獲得最大的聚合物產率(86.5%).

但ILS或QAS加入前后, 聚合物的聚合度基本上沒有發生變化.

2.3反應微環境的影響

對反應體系的pH在2.0～6.5范圍內進行了考察. 因為CPO在弱酸性的環境中比較穩定, pH>6.0時酶基本失活; 同時pH<2.5時CPO活性中心的酸堿催化組分Glu183處于質子化的狀態, 會增加反應體系中陰離子的競爭反應從而影響目標產物的生成. 由圖6可以看出, 聚合反應適合的pH范圍為5.5～6.0.

Fig.6　Influence of pH on p-phenyl phenol polymerization in aqueous buffer in the presence of 0.08×10-3 mol/L TMABr

Fig.7　Effect of amount of enzyme on poly phenyl phenol

聚合物的產率隨CPO的用量的增大迅速提高, 但最終趨于平穩(圖7, 以對苯基苯酚聚合為例). 若考慮最大收率的, 同時保證CPO的用量最少, 則所需的酶用量在(1.34～1.61)×10-7mol/L的范圍內, 表明聚合反應的酶用量極少, 極具應用潛力.

2.4底物結構對聚合度的影響

底物結構與聚合度關系密切. 根據液質分析的結果, 對苯基苯酚、 對甲基苯酚、 4-乙基苯酚、 對異丙基苯酚、 對羥基肉桂酸等5種酚衍生物的單體聚合數分別達到4～7, 7～8, 10～13, 13～14以及3～4, 說明羥基對位的給電子基團比吸電子基團更有利于底物聚合. 同時, 給電子基團的烴基鏈越長, 聚合度也越高, 而吸電子基團的情況則正好相反, 隨著吸電子基團烴基鏈的增長聚合度下降. 本文還考察和比較了鄰位取代的甲基苯酚與對位取代的甲基苯酚的聚合情況, 發現鄰甲基苯酚幾乎不發生聚合.

雖然酚衍生物的酶催化聚合反應也可在有機溶劑-緩沖溶液中進行, 如二氧六環、 丙酮以及DMF等, 但有機溶劑的加入對酶活性有所抑制, 所需要的酶用量較大; 同時有機溶劑的大量使用也不符合綠色化學的要求[24,25]; 在緩沖溶液中加入水溶性的模板劑, 如聚乙二醇(PEG), 可以得到聚合度較高的酚聚合產物, 但將模板劑與聚合產物分離很困難, 而且, 使用模板劑后酶用量并沒有明顯下降[26]. 而本文中采用ILS/QAS-緩沖溶液體系酶促合成聚酚不僅提供了一條綠色合成路線, 而且CPO酶用量極少.

2.5CPO催化的苯酚衍生物聚合機理

Scheme 1是以對乙基苯酚的聚合為例闡明底物的自由基聚合機理.

Scheme 1　Polymerization of phenol through oxidation catalyzed by CPO

CPO活性中心結構非常獨特, 其血紅素的“近端”與細胞色素P-450相似, 是以半胱氨酸(Cys29)的巰基硫原子作為鐵的第五軸向配體, 而在其它的過氧化物酶中占據這一位置的是組氨酸的咪唑氮原子; 但與P-450不同的是CPO分子中血紅素的“遠端”是親水性環境; 同時CPO的血紅素活性中心并沒有暴露在酶蛋白分子表面, 底物不易直接接近CPO的血紅素邊緣, 需要先通過一個疏水性通道才能到達活性中心, 但這個通道對底物的大小有限制, 即碳原子數超過9的直鏈烴無法通過底物通道[27]. 這一結構特點提示聚合反應不可能在CPO活性中心完成(否則聚合產物無法穿過底物通道進入溶液), 因此推測聚合過程是一個自由基反應, 首先CPO催化H2O2氧化酚衍生物單體產生自由基, 生成的自由基經過底物通道從活性中心進入溶液主體, 并完成聚合過程.

3　結　　論

采用CPO催化H2O2氧化苯酚衍生物單體制備聚酚, 通過引入少量的咪唑類離子液體或季銨鹽可有效提高聚合物的產率并改善聚合物的熱穩定性, 其中以反應體系引入0.08 mol/L的季銨鹽四甲基溴化銨(TMABr)的效果最好, 產率可提高80%以上(產率由不加季銨鹽的5%提高到86.5%), 且產物的熱穩定性優于純水相合成的聚酚; 對位取代苯酚遠比鄰位取代有利于聚合反應, 且對位取代基中烷基類給電子基團相比芳香基取代更有優勢, 但取代基的空間位阻不利于聚合反應. 聚合反應屬于自由基機理, 聚合過程是在溶液主體中而并非在CPO活性中心完成. 酶促制備過程一步完成, 產物提純簡便, 反應溫和高效, 環境友好, 且酶用量極少.

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(Ed.:D, Z)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21176150) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities of China(No.GK201505007).

Enzymatic Polymerization of Phenols Catalyzed by Chloroperoxidase in the Presence of Ionic Liquids/Quaternary Ammonium Salts?

WANG Shengjie1, LIU Lixia1, JIANG Yucheng1,2*, HU Mancheng1,2,LI Shuni1,2, ZHAI Quanguo1,2

(1. School of Chemistry & Chemical Engineering,2.KeyLaboratoryofMacromolecularScienceofShaanxiProvince,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710119,China)

A green enzymatic approach for the synthesis of phenol polymersfrom substituted phenols monomer by chloroperoxidase(CPO)-catalyzed H2O2-oxidation was proposed in this paper. The yield and thermal stabi-lity of polymers ofp-methyl phenol,p-ethyl phenol,p-propyl phenol,p-phenyl phenol andp-hydroxy-cinnamic acid were studied based on the presence of imidazolium-based ionic liquids(ILs) or quaternary ammonium salts(QAS), the effect of structure of the substrates and the reaction microenvironment. The results showed that the introduction of little amount of ILs/QAS can improve the production of polymerization of phenols efficiently, in which ILs/QAS with bigger cation group and shorter hydrophobic chain was much more effective, while the influence of ILs/QAS amount on polymerization of phenols showed a “ball type” pattern. Moreover, it was found thatp-substituted phenol and electron-donating group were more beneficial to the increase of yield and thermal stability of phenol polymers compared too-substituted phenol and electron-withdrawing group. However, the steric hindrance was increased with the increasing size of substituent group, which was not beneficial to the polymerization of phenols. The pH value should be controlled as weak acid or even near-neutral to avoid competitive side reaction, while the adding of H2O2should be in a batch type to suppress the oxidative damage of heme caused by the instantaneous concentrated H2O2. The mechanism of polymerization was also analyzed and proposed based on the characteristics of structure of CPO active site.

Chloroperoxidase; Polyphenol; Ionic liquid/Quaternary ammonium salt; Structure of substrate; Reaction microenvironment

10.7503/cjcu20160236

2016-04-13. 網絡出版日期:2016-08-23.

國家自然科學基金(批準號:21176150)和中央高校專項基金(批準號:GK201505007)資助.

O632.7

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聯系人簡介:蔣育澄, 女, 博士, 教授, 主要從事酶工程研究. E-mail:jyc@snnu.edu.cn