異肽鍵穩定的MERS-CoV融合蛋白S2亞基N端重復序列三股α螺旋的構建

鄭　汐, 梁國棟, 王　潮, 劉克良

(軍事醫學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

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異肽鍵穩定的MERS-CoV融合蛋白S2亞基N端重復序列三股α螺旋的構建

鄭汐, 梁國棟, 王潮, 劉克良

(軍事醫學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

通過在天然N肽的氨基端引入可以誘導螺旋三聚體形成的人工多肽序列, 并通過酰基轉移反應在上述嵌合肽所形成的三股α螺旋間引入異肽鍵, 構建了中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)的N-trimer模型, 為MERS-CoV融合抑制劑的設計奠定了基礎.

中東呼吸綜合征病毒; 融合蛋白; 多肽; 異肽鍵

2012年, 一名60歲的男性沙特籍患者死于多器官衰竭[1], Zaki等[2～4]在該患者體內分離出一種新型的人獸共患冠狀病毒, 并將其命名為中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV). MERS-CoV先后在中東及南韓地區爆發了大規模流行, 在全球范圍內共造成1600余例人類感染, 導致590人死亡[5,6]. 與2003年亞洲地區流行的嚴重急性呼吸窘迫綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)相比[7], MERS-CoV的致死率高達36%. 目前, 臨床的治療手段是利巴韋林與干擾素聯合治療, 尚無特異性治療方法[2,8～10].

Scheme 1　Structure of 6-helix bundle(6-HB)(A) Side view of MERS-CoV S2 subunit 6-HB structure(PDB:4mod), peripheral helix present the C-terminal heptad repeat(CHR) in MERS-CoV, while the central helix trimer are N-terminal heptad repeat(NHR); (B) top view of 6-HB show the amino acid in a, d site(cyan) and e, g site.

MERS-CoV所屬的冠狀病毒科具有包膜結構[11]. 融合是包膜病毒入侵宿主細胞時的重要環節. 通過抑制融合, 可以將包膜病毒阻止在宿主細胞膜外, 最終被身體的免疫防線清除[12]. 晶體學研究結果表明, MERS-CoV包膜上具有融合功能的棘突糖蛋白(Spike protein)為Ⅰ類融合蛋白[12,13]. 病毒發生膜融合時, S蛋白的S1亞基會首先識別細胞表面的特異性受體CD26(或稱DPP4)并與之結合, 然后在體內蛋白酶TMPRSS2的作用下暴露出S2亞基的膜融合肽FP片斷, 并插入宿主細胞膜中[12～16]. 失去支撐的S2亞基沿著勢能降低的方向發生折疊變構, 其中N端七重復序列(NHR)以α螺旋的形式形成同源三聚體并提供3個疏水溝槽; C端七重復序列(CHR)以α螺旋的形式結合至疏水溝槽內, 形成如Scheme 1所示的6-HB結構. 6-HB結構拉近了宿主細胞膜和病毒包膜之間的距離, 從而引發融合過程[17～20]. 6-HB結構是MERS-CoV入侵宿主細胞過程中的關鍵結構, 其中NHR三股螺旋位于其結構中心. 從MERS-CoV內源性6-HB晶體結構可知, NHR與CHR互為配基; 在藥物研發領域, NHR與CHR互為靶標. 因此, 體外重現N肽三螺旋結構, 一方面可以作為開發C肽類MERS-CoV融合抑制劑的分子靶標, 另一方面N肽三螺旋本身又可以作為N肽類融合抑制劑用于阻止MERS-CoV感染宿主細胞. HIV-1與MERS-CoV同屬I類包膜病毒, 具有相似的融合機制, 在融合過程中均經歷由NHR-CHR相互作用形成的6-HB結構[21～23]. 因此, MERS-CoV肽類融合抑制劑的研究可以參考HIV-1融合抑制劑. Jiang等[24～26]報道了衍生于HIV-1 CHR的第一個HIV-1融合抑制劑多肽(C肽) T20, T20的上市開辟了利用C肽類融合抑制劑阻止Ⅰ類包膜病毒與宿主細胞融合的新領域. Jiang等[13]發現衍生于MERS-CoV融合蛋白S2亞基CHR區的36肽HR2P對MERS-CoV的半數抑制濃度達到1 μmol/L. 與此相反, 衍生于MERS-CoV融合蛋白NHR的多肽片段(N肽)HR1P(S蛋白第998～1039位)雖與HR2P互為靶點, 但因其長度縮短后結構不穩定, 從而其在離體狀態下難以重現螺旋三聚體核心結構, 進而難以發揮生物學活性[27～32]. 因此, 如何按照已闡明的晶體結構和作用機制在體外重現MERS-CoV的NHR三螺旋結構, 成為開發N肽類MERS-CoV融合抑制劑的難點. 目前, 尚未見有關穩定MERS-CoV N肽方法的報道.

本文從MERS-CoV S蛋白S2亞基的NHR區域分段選取含有21個殘基的N肽片段作為模板, 借鑒HIV-1 N肽的研究思路[33～35], 通過在N肽的氨基端引入人工設計的具有形成三股α螺旋能力的輔助序列, 改善N肽的水溶性, 并使N肽能自發組裝成三聚體[36～38], 通過硫酯轉移反應在特定氨基酸殘基側鏈間形成異肽鍵[39～41][Scheme 2(A)], 進一步穩定三聚體, 構建了MERS-CoV S2亞基N肽三聚體(N-trimer)模型. N-trimer模型的構建方法可以為MERS-CoV融合蛋白NHR三聚體的構建提供思路, 并為其它螺旋三聚體模型的構建提供參考.

Scheme 2　N-helix trimer stabled by isopeptide(A) Isopeptide bond was formed between lysine in e site and glutamic acid in g′ site of adjacent peptide chain; (B) schematic representation of isopeptide bond formation via an interhelical acyl transfer reaction.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

Rink酰胺樹脂(載量0.46 mmol/g)購自天津南開和成科技有限公司;N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-天冬酰胺[Fmoc-Asn(Trt)-OH]、N-芴甲氧羰基-N′-三苯甲基-L-谷氨酰胺[Fmoc-L-Gln(Trt)-OH]、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-谷氨酸[Fmoc-Glu(OtBu)-OH]、N-芴甲氧羰基-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N-芴甲氧羰基-L-異亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、N-芴甲氧羰基-L-亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N-α-芴甲氧羰基-N′-叔丁氧羰基-L-賴氨酸[Fmoc-Lys(Boc)-OH]、N-芴甲氧羰基-L-甲硫氨酸(Fmoc-Met-OH)、N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-絲氨酸[Fmoc-Ser(tBu)-OH]、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-蘇氨酸[Fmoc-Thr(tBu)-OH]、N-芴甲氧羰基-L-纈氨酸(Fmoc-Val-OH)、N-芴甲氧羰基-O-烯丙基-L-谷氨酸[Fmoc-Glu(OAll)-OH]、 苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和1-羥基苯并三唑(HOBt)購自上海吉爾生化有限公司; 雙甲酮(Dimedone)、 四三苯基膦零價鈀鹽[Pd(PPh3)4]、 二乙基二硫代氨基甲酸鈉鹽(或稱銅試劑)、 芐硫醇(HSBn)和N,N-二異丙基乙基胺(DIEA)購自J & K百靈威試劑公司;N-甲基吡咯烷酮(NMP)購自Acros試劑公司; 乙二硫醇(EDT)和間甲酚(m-Cresol)購自Alfa Aesar試劑公司; 三氟乙酸(TFA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF, 必要時CaH2浸泡過夜后減壓蒸餾)購自北京博邁杰科技有限公司; 二氯甲烷(DCM)用無水K2CO3干燥處理, 避光靜置24 h后使用; 哌啶與NaOH回流后重蒸或直接使用; 所用試劑均為分析純.

CEM LibertyTM微波多肽合成儀(美國CEM公司); Shimadzu 10A型高效液相色譜儀(HPLC, 日本島津株式會社); Venusil ASB C8液相色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm,天津博納艾杰爾公司); Free-Zone 18 L型冷凍干燥機(美國Labconco公司); 9.4 T混合型串聯傅里葉質譜儀(MS, 德國Bruker公司); REFLEX Ⅲ型MALDI-TOF質譜儀(MS, 德國Bruker公司); Waters Delta Prep-4000型高壓制備液相色譜儀(HPLC, 美國Waters公司); X-Bridge C8高壓制備液相色譜柱(19.5 mm×250 mm, 美國Waters公司); Milli-Q純水機(美國MilliPore公司).

1.2實驗過程

1.2.1多肽序列的固相合成使用CEM微波多肽合成儀, Rink酰胺樹脂, 0.25 mmol規模. 采用標準的氨基芴甲氧羰基保護(Fmoc)固相方法合成多肽樹脂載體, 以10 mL DMF和10 mL DCM作為溶脹溶劑, 以10 mL哌啶(體積分數20%)的DMF溶液作為脫保護試劑, 以HBTU/HOBt/DIEA作為縮合劑, 以0.5 mL乙酸酐與20 mL DCM溶液(含0.5 mL DIEA)作為封端試劑, 經[樹脂溶脹-脫Fmoc保護-氨基酸縮合-]循環, 期間用DMF洗滌樹脂殘留溶液, 從C端依次向N端合成氨基酸, 必要時縮合2次. 最末端氨基酸脫除Fmoc后乙酰化封端保護, 得到側鏈正交保護的多肽樹脂載體.

采用側鏈由烯丙氧羰基保護的L-型谷氨酸參與多肽序列的合成, 如Scheme 2(B)所示. 將Rink酰胺樹脂同上述封端后, 用5 mmol零價鈀Pd(PPh3)4和5 mmol雙甲酮在避光條件下正交脫除谷氨酸的保護基團作為反應位點. 暴露的—COOH與5 mmol芐硫醇在EDC/HOBt催化下縮合形成硫脂鍵. 以B裂解液[V(三氟乙酸)∶V(間甲酚)∶V(苯甲醚)∶V(乙二硫醇)∶V(水)=16∶1∶1∶1∶1]與樹脂以10 mL/g的比例裂解凍干得粗肽. 利用高壓制備液相色譜純化后凍干得到純肽, 純度大于95%(HPLC). 用ESI-Q-FT-MS或MALDI-TOF-MS鑒定多肽. 將凍干粉精密稱量至每份約1 mg并于4 ℃保存[13].

1.2.2用異肽鍵交聯成三聚體將上述硫酯化多肽在純化、 濃縮、 凍干后溶解于pH=7.4的PBS緩沖液中(含15%體積分數乙腈), 濃度為1 mg/mL, 置于37 ℃培養箱中避光孵育. 在該條件下, IZ片段與N肽片段自發組裝為三聚體的驅動力使多肽單體相互靠近, 使硫酯化修飾的Glu活潑酯與對應位點的Lys側鏈發生酰基轉移反應, 用分析型RP-HPLC監測形成異肽鍵的反應動力學RC-HPLC條件:A相V(TFA)∶V(H2O)=1∶1000, B相V(TFA)∶V(H2O)∶V(MeCN)= 1∶300∶700, 梯度0 min B相(體積分數10%), 5 min B相(體積分數50%), 20 min B相(體積分數100%); 流速1 mL/min.

2　結果與討論

RP-HPLC動力學檢測結果如圖1(A)～(C)所示, 硫酯化修飾的單體由于非極性基團的引入, 原料峰保留時間最長, 均大于17.5 min. 在PBS緩沖液提供的弱堿離子環境下, 多肽發生自組裝, 目標反應位點在空間距離和方向的限制下相互靠近, 發生緩慢的酰基轉移反應形成異肽鍵. 由于形成的三聚體脫去了硫酯非極性基團, 極性增大; 形成三聚體時, 共價交聯將多肽a,d位形成的疏水面包裹在分子內側, 降低了與反相柱填料的作用概率; 形成三聚體時, 分子量增大, 使柱填料保留能力減弱, 故產物色譜峰出現在保留時間為11～12 min的位置. 由圖1(D)～(I)可見, 經ESI-Q-FT-MS驗證, 與多肽單體相比, 該產物為N-trimer共價交聯三聚體. 結果表明, 經過修飾的N肽在生理條件下具有自組裝成三螺旋的傾向, 并以這一驅動力為空間結構基礎, 發生定點酰基轉移反應, 生成了異肽鍵穩定的N-trimer.

Fig.1　RP-HPLC traces(A—C) and mass spectrometry(D—I) of isopeptide bond forming reactionRP-HPLC traces for the acyl transfer reaction of (IZN21L)3(A), (IZN21M)3(B) and (IZN21R)3(C) from t=2.5 to 150 h. Absorbance was monitored at 210 nm. (A—C):a. The reaction material; b. the reaction product; c. by-products. Mass spectrometry of monomer peptide, the reaction materal of (IZN21L)3(D), (IZN21M)3(E), (IZN21R)3(F) and reaction products, the trimeric peptide (IZN21L)3(G), (IZN21M)3(H) and (IZN21R)3(I).

螺旋間的酰基轉移反應是一個定點特異的交聯反應. Lai等[32,33,41]利用該反應在螺旋間的e/g′位定點特異性地形成異肽鍵用于穩定超螺旋結構. 本文序列中的Glu-11和Lys-16分別處于e/g′位(見表1), 因此可以確定Glu-11可以與相鄰螺旋的Lys-16發生特異性反應形成異肽鍵交聯的N-trimer. Lai等報道了雜質峰中的中間產物隨著反應時間延長會逐漸減少, 本實驗中也觀察到相似的現象. 但由于MERS-CoV N肽高級結構的穩定性比HIV-1更差, 因此交聯反應更困難, 不僅所需時間更長, 而且副產物更多. 本文交聯反應的副產物主要是多肽在生理條件下的降解碎片; 從化學反應特性的角度推測, 其它副反應如硫酯基團的水解和非特異氨基位點反應也不可避免. 用人工序列修飾MERS-CoV融合蛋白跨膜亞基S2的NHR衍生肽, 使之不易聚集并具有自組裝傾向, 再通過硫酯活化的酰基轉移反應, 將螺旋間的一對谷氨酸-賴氨酸側鏈以異肽鍵的方式連接在一起, 構建了由共價鍵穩定的N-trimer結構. 在進一步結構研究的指導下, 該模型可為中東呼吸綜合征冠狀病毒融合蛋白跨膜亞基體外N端三螺旋的構建提供參考.

Table 1　Designed peptide sequences derived from HR1P

*Lower-case letters(a—g) above indicate the amino acids sites in heptad repeat. Italic letters represent auxiliary sequence. IZm:IKKE IEAIKKE QEAIKKK IEAI. Isopeptide bonds are formed between Glu-11 and Lys-16 (underlined).

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(Ed.:P, H, W, K)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.81373266, 81573266).

Construction of Isopeptide Bridge-tethered NHR-trimeric Coiled-coil in MERS-CoV Membrane Fusion Protein?

ZHENG Xi, LIANG Guodong, WANG Chao*, LIU Keliang*

(Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, State Key Laboratory of Toxicology andMedicalCountermeasures,Beijing100850,China)

In Middle East respiratory syndrome coronavirus(MERS-CoV) infection, the formation of a coiled-coil six-helical bundle(6-HB) between three C-terminal heptad repeats(CHRs) and an N-terminal heptad repeat(NHR) trimer of the MERS-CoV spike protein S2 subunit provided the energy necessary for virus-cell membrane fusion. Mimicry of the NHR-helical trimers in the MERS-CoV membrane fusion protein for the discovery of antiviral therapeutics hampered because of the strong aggregation properties of synthetic NHR-based peptides taken out of their parent protein structure. Herein, the article presents an efficient strategy to recapi-tulate MERS-CoV NHRα-helical trimersviacombining the concepts of grafting the NHR-derived peptides onto an exogenous trimerization motif with stabilization of the trimeric oligomers through isopeptide bonds. The covalent bridge was introduced by an acyl transfer reaction between lysine and glutamic acid in specific amino acid sites with thio-easter modified. The designed isopeptide bridge-stabilized chimeric trimers has strong potential for the development potent MERS-CoV fusion inhibitors.

Middle East respiratory syndrome coronavirus; Fusion protein; Peptide; Isopeptide bond

10.7503/cjcu20160237

2016-04-13. 網絡出版日期:2016-08-26.

國家自然科學基金(批準號:81373266, 81573266)資助.

O629.72

A

聯系人簡介:劉克良, 男, 博士, 研究員, 博士生導師, 主要從事多肽藥物、 核酸化學及藥用高分子材料研究.E-mail:keliangliu55@126.com

王潮, 男, 博士, 助理研究員, 主要從事多肽藥物研究. E-mail:chaow301@gmail.com