560例中國結直腸癌患者K-ras基因突變研究*

姚　暉，汪杰華，李　莉，龔金蘭，吳曉峰，陳風華

(上海市楊浦區市東醫院　200438)

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·論著·

560例中國結直腸癌患者K-ras基因突變研究*

姚暉，汪杰華，李莉，龔金蘭，吳曉峰，陳風華△

(上海市楊浦區市東醫院200438)

目的探討結直腸癌患者K-ras基因突變狀態并為個體化治療提供指導。方法采用嵌套和COLD-PCR的方法分析560例結直腸癌患者K-ras基因突變狀態。結果560例患者K-ras基因總體突變率27.08%，128例血漿標本突變率為0，432例組織標本突變率為27.08%。突變類型包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L，2種不同K-ras基因突變率比較，差異有統計學意義(P<0.000 1)。362例男性患者的突變率為20.44%，包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；198例女性患者的突變率為21.72%，包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13D，不同性別間K-ras基因突變率比較，差異無統計學意義(P=0.722 7)。80例年輕患者的突變率為20%，包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13D；127例中年患者的突變率為33.07%，包括G12S、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；353例老年患者的突變率為16.71%，包括G12C、G12D、G12V、G13R、G13D，不同年齡間K-ras基因突變率比較，差異有統計學意義(P=0.000 5)。結論560例結直腸癌患者K-ras基因突變類型主要為G12D、G12V、G13D，K-ras基因突變在不同標本類型、不同年齡間存在差異，不同性別間無差異。

結直腸癌；K-ras基因；基因突變

癌癥是全球性疾病，具有高發病率，高病死率的特點[1-2]。2012年結直腸癌的病死率高達69萬人[3]。科學家很早就發現結直腸癌患者存在表皮生長因子受體(EGFR)信號通路的突變，針對EGFR信號通路的靶向藥物(西妥昔單抗等)得到開發，其療效也在實踐中被證實[4]。EGFR下游信號激活通路中的RAS和RAF基因，而這些基因常包含致癌突變，其中K-ras突變率為30%～60%，B-raf為5%～20%，N-ras為1%～3%[5-7]。本研究采用嵌套和COLD-PCR方法研究560例中國人結直腸癌患者K-ras基因突變狀態，并比較不同標本、性別和年齡間K-ras基因突變頻率的差異，為西妥昔單抗藥物的使用提供參考依據。

1　資料與方法

1.1一般資料本研究使用的臨床標本來自全國上百家三級醫院的患者，包括128例血漿標本和432例組織標本。所有參與本研究的患者或其家屬均簽署授權上海賽安生物醫藥科技有限公司進行K-ras基因檢測的知情許可同意書。

1.2儀器與試劑PCR儀購自杭州博日科技有限公司，離心機購自湘儀離心機儀器有限公司。Pfu酶和dNTP均購自上海申能博彩生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購自Axygen Scientific Inc。PCR產物序列測定由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.3基因組DNA提取按照試劑盒說明書進行操作。

1.4COLD-PCR測序法檢測K-ras基因突變采用Primer 5進行引物設計，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，嵌套和COLD-PCR測序法用于檢測K-ras基因突變。(1)PCR擴增：常規PCR方法擴增465 bp大片段。所用引物：正向5′-GTC GAT GGA GGA GTT TGT AAA TGA AGT-3′，反向5′-TTC AGA TAA CTT AAC TTT CAG CAT AAT TAT CTT G-3′。10 μL PCR反應體系，包括0.25 mM的dNTP、0.5 μM的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和10 ng的模板DNA。95 ℃預變性3 min，32個擴增循環：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，然后72 ℃，保持5 min。(2)COLD-PCR：COLD-PCR方法用于擴增155 bp的小片段。所用引物：正向5′-GTC ACA TTT TCA TTA TTT TTA TTA TAA GG-3′，反向5′-TTT ACC TCT ATT GTT GGA TCA TAT TC-3′。50 μL的PCR反應體系，包括0.25 mM的dNTP、0.5μM的引物、0.5單位的Taq DNA聚合酶和1 μL的大片段PCR產物。95 ℃預變性3 min，40個擴增循環：80 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；15個擴增循環：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，然后72 ℃，保持5 min。(3)PCR產物純化測序：由上海鼎安生物科技有限公司完成。

1.5統計學處理采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計數資料組間比較使用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1PCR產物測序結果采用COLD-PCR測序方法，檢測K-ras基因突變狀態。見圖1。

2.2不同類型結直腸癌患者K-ras基因突變560例患者K-ras基因總體突變率為27.08%，包括128例血漿標本和432例組織標本，血漿標本突變率為0，組織標本突變率為27.08%，突變類型包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L，2種不同標本K-ras基因突變率比較，差異有統計學意義(P<0.000 1)。見表1。

注：COLD-PCR產物測序的代表性圖譜，表示K-ras基因第13位密碼子由GGC突變為GAC。

圖1K-ras基因突變狀態

2.3不同性別結直腸癌患者K-ras基因突變362例男性患者的突變率為20.44%，突變類型包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；198例女性患者的突變率為21.72%，包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13D，不同性別K-ras基因突變率比較，差異無統計學意義(P=0.722 7)。見表1。

2.4不同年齡結直腸癌患者K-ras基因突變80例年輕患者的突變率為20%，突變類型包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13D；127例中年患者的突變率為33.07%，包括G12S、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L；353例老年患者的突變率為16.71%，包括G12C、G12D、G12V、G13R、G13D，不同年齡患者K-ras基因突變率比較，差異有統計學意義(P=0.000 5)。見表1。

表1　　COLD-PCR測序法檢測患者不同標本類型、性別、年齡的K-ras基因突變頻率[n(%)]

3　討　　論

ras家族包括H-ras、N-ras、K-ras,這些基因是人類癌癥中變化最頻繁的群組之一[8]。K-ras癌基因參與PI3K/PTEN/AKT和RAF/MEK/ERK的信號通路[9-10]。因此K-ras突變占人類癌癥中ras突變的85%，N-ras占15%，H-ras僅占0.12%～1%[11]。

目前檢測EGFR信號通路下游的癌基因(如K-ras)突變狀態是必需的，目的是區分患者，并讓一部分患者從抗-EGFR的療法中獲益[12-14]。此外，一些具有預后價值的基因(如B-raf)也會一起被檢測，除了測序法，MALDI MS方法因高靈敏度、高特異性、檢測時間短和樣品處理容易而受到關注[15]。由于免疫組織化學方法對標本的要求低、費用低，也受到部分學者的應用，但由于無法區分突變型和野生型K-ras腫瘤患者而受到一定的限制，設計針對突變型K-ras的單克隆抗體也就成為將來發展的一個方向[16]。

致謝：本研究受到上海賽安生物醫藥科技有限公司彭南求及趙新泰教授的技術支持。

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Analysis of K-ras gene mutation status in 560 Chinese colorectal cancer patients*

YAOHui,WANGJiehua,LILi,GONGJinlan,WUXiaofeng，CHENFenghua△

(ShanghaiShidongHospital,Shanghai200438,China)

ObjectiveTo analyze the mutation status of K-ras gene in colorectal cancer patients,further more,to provide guidance for personalized therapy for colorectal cancer.MethodsNested and COLD-PCR were used to detect the K-ras mutations in 560 patients with colorectal cancer.ResultsIn 560 colorectal cancer patients,the total positive rate of K-ras gene mutations was 27.08%,the mutation rate was 0 in 128 plasma samples and it was 27.08% in 432 tissue samples.The mutate sites were G12S,G12C,G12D,G12A,G12V,G13R,G13C,G13D,Q61K,Q61L,there were significant differences existed in different samples (P<0.000 1); the mutation rate of 362 male patients was 20.44% and the types of mutation include G12S,G12C,G12D,G12V,G13R,G13C,G13D,Q61K and Q61L.The mutation frequency was 21.72% in 198 female patients,the mutation points were G12S,G12C,G12D,G12A,G12V,G13R and G13D.There were no significant difference between different sex (P=0.722 7); the mutation frequency was 20% in 80 youth patients including G12S,G12C,G12D,G12V,G13D and the mutation rate was 33.07% in 127 middle age patients,the points of mutation were G12S,G12D,G12A,G12V,G13R,G13C,G13D,Q61K,Q61L,the mutation frequency was 16.71% in 353 old age patients,the types of mutation include G12C,G12D,G12V,G13R,G13D,the difference was significant among different age patients (P=0.000 5).ConclusionThe total rate of mutations is 27.08% in 560 colorectal cancer patients,and the main points of mutation is G12D,G12V,G13D.There are significant differences in different type of samples as well as in different ages,but no statistical significance in different sex patients.

colorectal cancer;K-ras;gene mutation status

上海市衛計委重點項目(201540032)。

姚暉，男，主任醫師，主要從事臨床腫瘤放射治療研究。

，E-mail:13761246568@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.022

A

1673-4130(2016)19-2715-03

2016-02-24

2016-04-19)