金黃色葡萄球菌腺苷酰轉移酶耐藥基因的克隆及其原核表達*

陳洪升，周　帥，陳吟霜，謝永強，張詠莉，周珍文△

(1.廣東藥學院，廣州 510224;2.廣東省廣州市婦女兒童醫療中心　510000)

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·論著·

金黃色葡萄球菌腺苷酰轉移酶耐藥基因的克隆及其原核表達*

陳洪升1，周帥2，陳吟霜2，謝永強2，張詠莉1，周珍文2△

(1.廣東藥學院，廣州 510224;2.廣東省廣州市婦女兒童醫療中心510000)

目的在大腸桿菌中克隆表達金黃色葡萄球菌氨基糖苷類耐藥基因，即腺苷酰轉移酶基因，為其功能研究奠定基礎。方法按金黃色葡萄球菌腺苷酰轉移酶蛋白編碼序列設計引物，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，擴增腺苷酰轉移酶基因，所得片段與pGEX-4t-1(+)載體連接，轉化至感受態大腸桿菌BL21(DE3)，提取質粒進行雙酶切及測序鑒定，IPTG誘導重組蛋白表達，SDS-PAGE及Western-blot對重組蛋白作鑒定。結果使用金黃色葡萄球菌基因組為模板，成功擴增約800 bp目的片段，重組質粒雙酶切見目的片段，測序顯示腺苷酰轉移酶基因長783 bp,始于ATG，止于TAG，預測的等電點和相對分子質量分別為7.75和29×103，目的基因與Genbank腺苷酰轉移酶同源性為99%，SDS-PAGE及Western-blot顯示在55×103見重組蛋白表達。結論在大腸桿菌中成功克隆表達了金黃色葡萄球菌腺苷酰轉移酶基因。

金黃色葡萄球菌；腺苷酰轉移酶；耐藥基因

金黃色葡萄球菌是機體化膿感染中最常見的病原菌，隨著氨基糖苷類藥物的廣泛應用，耐藥性日益嚴重。腺苷酰轉移酶是一種跨膜多重藥物外排蛋白，介導葡萄球菌對氨基糖苷類藥物及多種結構上近似甚至無關的藥物耐藥[1-2]。本研究對腺苷酰轉移酶基因進行克隆及原核表達，為其功能研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1一般材料金黃色葡萄球菌菌株(111123035)分離自廣州市婦女兒童醫療中心內科病區，11歲兒童患者的全身多發軟組織感染膿液。

1.2儀器與試劑上海力申公司HF safe-1200型生物安全柜，德國Biometra公司PCR，英國Uvitec公司GAS7508-T20紫外凝膠成像分析系統，德國Sorvall公司micro 17R臺式高速冷凍離心機。pGEX-4t-1質粒載體購自法國馬來亞公司；質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、rTaq DNA聚合酶、EcoR Ⅰ和Xhol Ⅰ限制性內切酶、T4 DNA連接酶DNA marker等購自Takara公司。IPTG、丙烯酰胺、Tris堿、預染蛋白Marker和DAB顯色劑等購自鼎國生物公司。鼠抗GST標簽單克隆抗體購自北京康為世紀生物有限公司。

1.3方法

1.3.1最低抑菌濃度(MIC)按照美國臨床和實驗室標準化協會2012年發布的《抗微生物藥物敏感試驗的執行標準》，采用瓊脂2倍稀釋法進行MIC檢測。

1.3.2腺苷酰轉移酶基因PCR擴增根據GenBank金黃色葡萄球菌腺苷酰轉移酶基因序列(CP002120.1)，設計特異性引物1對。P1：5′-CGC GAA TTC ATG AGC AAT TTG ATT AAC GG-3′，P2：5′-CGC CTC GAG CTA ATT GAG AGA AGT TTC TA-3′。引物序列分別加入EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ酶切位點。挑取金黃色葡萄球菌單菌落于50 μL 水中，煮沸15 min，12 000r/min離心1 min，取上清液作為PCR模板。PCR反應條件：94 ℃熱變性5 min后，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環，最后72 ℃延伸15 min。

1.3.3腺苷酰轉移酶基因克隆至pGEX-4t-1表達載體腺苷酰轉移酶基因 PCR產物純化后，經EcoRⅠ、XholⅠ酶切純化后，與相同酶切的pGEX-4t-1質粒連接，轉化至大腸桿菌BL21。挑取經氨芐霉素篩選的陽性菌落提取質粒進行PCR及雙酶切鑒定。

1.3.4腺苷酰轉移酶基因在大腸桿菌BL21/DE3的誘導表達將含有重組質粒的BL21/DE3工程菌接種至含氨芐霉素(50 μg/mL)的LB瓊脂板，培養過夜后挑單菌落于LB液體培養基中(含氨芐霉素50 μg/mL)，37 ℃培養至OD值0.4左右，加IPTG至終濃度1 mmol/L 30 ℃誘導表達6 h，8 000 r/min 4 ℃離心20 min,收集菌體,SDS-PAGE電泳鑒定。

1.3.5重組蛋白Western-blot分析重組蛋白表達產物經12% SDS-PAGE后轉移至PVDF膜，使用HRP標記的GST標簽鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，DAB顯色液顯色。

2　結　　果

2.1氨基糖苷類抗菌藥物的MIC金黃色葡萄球菌菌株(111123035)對慶大霉素、阿米卡星的MIC分別為18、16 μg/mL。均為耐藥。頭孢西丁MIC值為18 μg/mL,該菌株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株。

2.2腺苷酰轉移酶基因的PCR擴增以111123035菌株基因組DNA為模板，PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在800～1 000 bp間見明顯特異性條帶，與目的基因(783 bp)大小相似。見圖1。

圖1　　腺苷酰轉移酶基因的PCR擴增

2.3重組質粒的鑒定從轉化的大腸桿菌BL21提取的重組質粒，經EcoRⅠ和XholⅠ酶切后見目的條帶。見圖2。測序顯示腺苷酰轉移酶基因長783 bp，啟始于ATG，終止于TAG，預測的等電點為7.75，相對分子質量約為29×103，與GenBank中編號為NC_017341.1的基因同源性為99%。氨基酸比對結果顯示僅見第49位氨基酸D改變為Y。

2.4SDS-PEGE電泳及Western-blot0.5 mmol 的IPTG誘導8 h后，重組菌體經SDS-PEGE電泳后，在55×103可見明顯表達帶，這與融合重組蛋白的理論相對分子質量相符(26×103GST+29×103adenylyltransferase)。見圖3。

注：1表示DNA 標記；2表示重組質粒雙酶消化；3表示重組質粒；4表示雙親 pGEX-4T-1(+)重組。

圖2重組質粒雙酶切鑒定電泳圖

注：1表示蛋白質標記；2表示pEGX-4T-1(+)/BL21(DE3) 誘導IPTG；3表示質粒pEGX-4T-1(+)-腺苷酰轉移酶/BL21(DE3) 誘導 IPTG；4表示質粒 pEGX-4T-1(+)-腺苷酰轉移酶/BL21(DE3)無IPTG誘導。

圖3重組腺苷酰轉移酶12% SDS-PAGE電泳圖

2.5重組腺苷酰轉移酶 Western-blot分析鑒定使用鼠抗GST標簽單克隆抗體進行Western-blot，結果顯示在55×103左右見目的蛋白。見圖4。

注：1表示蛋白質標記；2表示質粒pEGX-4T-1(+)-腺苷酰轉移酶/BL21誘導。

圖4重組蛋白表達產物Western-blot檢測

3　討　　論

本研究從患者全身多發軟組織感染膿液標本分離出1株高耐藥菌株(111123035)，為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，對慶大霉素、阿米卡星的MIC分別為18、16 μg/mL，結果表明對氨基糖苷類藥物高度耐藥。對氨基糖苷抗菌藥物耐藥是因細菌產生氨基糖苷類雙功能修飾酶(AA C(6′)- APH(2")鈍化酶所致[3-5]。該種耐藥性的決定因子為PSK-1樣質粒[4]。Jordens 等研究報道金黃色葡萄球菌對慶大霉素的耐藥性并非質粒攜帶,而是染色體攜帶。

有學者在大腸桿菌、酵母菌等進行了腺苷酰轉移酶耐藥基因的分離及鑒定，結果顯示腺苷酰轉移酶基因序列和蛋白相對分子質量與報道相符[6-7]。本研究首次對金黃色葡萄球菌腺苷酰轉移酶耐藥基因進行克隆表達，從基因組擴增出的腺苷酰轉移酶目的片段經雙酶切與質粒載體pGEX-4T-1(+)成功重組，測序結果表明目的基因片段與GenBank中金黃色葡萄球菌菌株腺苷酰轉移酶基因的一致性高達99.9%,僅第145位T堿基突變成G和第274位G堿基突變成A，說明該基因具有高度保守性。

構建表達系統時選擇了pGEX表達系統，該系統是目前廣泛使用的一種融合蛋白表達系統，可用于表達和純化，作為免疫原和生物、生化制劑的多肽，或構建cDNA表達文庫[8-10]。GST標簽體系具有蛋白表達產率高、表達產物純化方便，以及有利于GST抗體制備等特點。GST融合蛋白可溶于水溶液，可從細菌裂解液中提取，在不變性的條件下通過親和層析得到。GST融合蛋白可被位點特異性蛋白酶裂解，從而除去GST蛋白。融合蛋白又是一個良好的強免疫原，因此很容易制備抗新蛋白的抗體[11-12]。本組實驗結果顯示，在IPTG的誘導下，重組表達質粒表達出約55×103的融合蛋白，其中腺苷酰轉移酶蛋白約為29×103，與由核苷酸序列推導的蛋白質相對分子質量大小相符。

本研究成功對染色體介導的氨基糖苷耐藥基因腺苷酰轉移酶進行了克隆和原核表達，獲得腺苷酰轉移酶蛋白，為進一步進行腺苷酰轉移酶蛋白高級結構測定做好了準備，為了解腺苷酰轉移酶蛋白的特性和功能及其對細菌耐藥機制的深入研究奠定了基礎[13-14]。

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Clone and prokaryotic expression of staphylococcus aureus drug resistance adenylyltransferase gene*

CHENHongsheng1,ZHOUShuai2,CHENYinshuang2，XIEYongqiang2,ZHANGYongli1,ZHOUZhenwen2△

(1.GuangdongCollegeofPharmacy，Guangzhou,Guangdong510224,China;2.GuangzhouWomenandChildren′sMedicalCenter,Guangzhou,Guangdong510000,China)

ObjectiveTo clone and express Staphylococcus aureus drug resistance adenylyltransferase gene in E.coli BL21,and to make the foundation for its function research.MethodsPrimers were designed on the basis of adenylyltransferase gene in genbank,PCR was used to amplify adenylyltransferase gene using Staphylococcus aureus genomic DNA as template.The obtained PCR production was attatched with pGEX-4t-1(+) plasmid,and transformed into E.coli BL21 (DE3).The recombinant plasmid was digested by double enzyme digestion and identified by gene sequence.The recombinant protein was induced to expression by IPTG and identified by Western-blotting.ResultsUsing Staphylococcus aureus genome as a template,the target fragment about 800 bp was successful amplified.After enzyme-cutting and DNA-sequencing,the target fragment showed that the ORF begin with ATG,end with TAG,783 bp in length,the predicted isoelectric point and molecular weight were 7.75 and 29×103,and it was homology 99% homology with the reported sequence gene in genbank.SDS-PAGE and Western-blot showed the molecular weight of recombinant fusion protein was about 55×103.ConclusionAdenylyltransferase gene of Staphylococcus aureus was successfully cloned and expressed in E.coli as a fusion protein,which makes the foundation for the research of its function.

Staphylococcus aureus;adenosine acyl transferase;drug resistance gene

廣州市醫藥科技項目(20131A011053)。

陳洪升，男，在讀碩士，主要從事病原生物學研究。

，E-mail:861636726@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.003

A

1673-4130(2016)19-2667-03

2016-02-22

2016-04-17)