新疆產桑屬植物HPLC指紋圖譜研究

楊 璐， 范少麗， 程 平， 李 宏

新疆林業科學院，新疆烏魯木齊 830054)

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新疆產桑屬植物HPLC指紋圖譜研究

楊 璐， 范少麗， 程 平， 李 宏*

新疆林業科學院，新疆烏魯木齊 830054)

[目的]采用HPLC建立新疆產桑屬植物指紋圖譜。[方法]采用SunFire C18(4.6 mm×150.0 mm，5.0 μm)色譜柱；以甲醇-0.2%磷酸為流動相進行梯度洗脫，檢測波長330 nm，流速0.8 mL/ min，柱溫25℃，進樣體積10 μL。[結果]對13批新疆不同來源的桑葚、桑葉進行檢測，結果表明，建立的桑葚、桑葉指紋圖譜精密度、穩定性和重復性良好。[結論]桑葚、桑葉HPLC指紋圖譜可作為新疆桑屬植物鑒別與質量控制的科學依據。

新疆；桑屬植物；指紋圖譜；高效液相色譜

桑屬(MorusLinn.)植物是桑科多年生落葉喬木或灌木，新疆作為古絲綢之路的重要通道，擁有豐富的桑樹資源[1]。桑屬植物是重要的藥用植物資源，其根皮、莖、果實和葉子均可入藥，其果實(桑葚)具有補血滋陰、生津潤燥的功效[2]，其葉(桑葉)具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的功效[3]。現代藥理研究表明，桑葚與桑葉均具有抗氧化[4-5]、降血糖[6]、降血脂[7-8]等藥理活性。指紋圖譜是國內外廣泛采用的一種藥材質量評價模式，而HPLC指紋圖譜具有分離效能高、分析速度快等優點[9-10]。研究者對廣西、陜西等地產桑葚、

桑葉藥材的指紋圖譜進行研究[11-13]，但對于新疆產桑葚、桑葉的指紋圖譜系統研究鮮見報道[14]。筆者采用高效液相色譜法，建立新疆產桑葚、桑葉的指紋圖譜，并對不同來源的13批新疆產桑葚、桑葉HPLC色譜圖進行分析，以期為更好地評價新疆桑屬植物的綜合質量提供參考。1材料與方法

1.1試驗材料桑葚(鮮果)、桑葉(干燥葉)采自新疆吐魯番地區，共采集13批桑葚、桑葉樣品(表1)，采集時間為2015年5月。

表1　桑葚、桑葉樣品來源

1.2試劑對照品：蕓香葉苷(批號：C10027472，上海麥恪林生化科技有限公司，含量≥98%)；桑色素(批號：C10031384，上海麥恪林生化科技有限公司，含量≥98%)；甲醇(色譜純，Fisher Scientific)；磷酸(分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)；水為超純水。

1.3儀器高效液相色譜儀(美國Waters，Alliance E2695，包括自動進樣器、Empower色譜工作站等)；紫外檢測器(美國Waters，Alliance 2998)，數控超聲清洗器(KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4色譜條件色譜柱：SunFire C18(4.6 mm×150.0 mm，5.0 μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸；檢測波長：330 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2　梯度洗脫程序

1.5供試品溶液制備精密稱取桑葚(鮮果勻漿0.50 g)、桑葉(干燥粉末1.00 g)樣品，分別加入10 mL 70%的甲醇超聲提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液全量，氮吹，再定容至2 mL，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

1.6混合對照品溶液制備分別精密稱定蕓香葉苷、桑色素對照品，各加甲醇制成對照品濃度分別為0.600、0.400、0.200、0.100、0.060、0.010、0.002 mg/mL的混合對照品溶液，再用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得混合對照品溶液。0.4 mg/mL的混合對照品溶液色譜見圖1。

注：1.蕓香葉苷；2.桑色素。Note: 1.Rutin hydrate; 2.Morin hydrate. 圖1　混合對照品的HPLC色譜 Fig.1　HPLC chromatogram of mixed reference substances

2　結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1精密度。取同一批次的樣品(亞亞長黑1號)，按“1.5”供試品溶液的制備方法處理后，在已確定的HPLC色譜條件下連續進樣6次，記錄圖譜，考察主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，結果各色譜峰的相對保留時間RSD在0.01%～0.02%；各峰相對峰面積RSD在0.2%～1.2%。應用相似度軟件對色譜峰進行自動匹配，結果表明，各指紋圖譜的相似度均等于1。表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.1.2重復性。取同一批次的樣品(亞亞長黑1號)，按“1.5”供試品溶液的制備方法處理后，平行6份，在已確定的色譜條件下進行檢測，記錄圖譜，考察試驗方法的重復性。結果表明，6 份樣品中各色譜峰的相對保留時間RSD在0.01%～0.02%，共有峰相對峰面積RSD在1.2%～0.2%，應用相似度軟件對色譜峰進行自動匹配，結果表明，各指紋圖譜的相似度均大于0.999，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.1.3穩定性。取同一批次的樣品(亞亞長黑1號)，按“1.5”供試品溶液的制備方法制備一份供試品，在已確定的色譜條件下分別在 0、 2、 4、 8、16、 24 h 進行檢測，記錄圖譜，考察樣品溶液的穩定性。結果各色譜峰的相對保留時間RSD在0.03%～0.08%，各峰相對峰面積RSD在0.2%～0.8%，應用相似度軟件對色譜峰進行自動匹配，結果表明，各指紋圖譜的相似度均大于0.9。表明樣品在24 h內穩定，符合指紋圖譜的檢測要求。

圖2　5批黑桑HPLC指紋圖譜Fig.2　HPLC fingerprint overlapping of 5 batches of black mulberry

圖3　7批白桑HPLC指紋圖譜Fig.3　HPLC fingerprint overlapping of 7 batches of white mulberry

圖4　13批桑葉HPLC指紋圖譜Fig.4　HPLC fingerprint overlapping of 13 batches of mulberry leaves

2.2指紋圖譜的建立2.2.1共有峰的確定。精密稱定13批桑葚、桑葉樣品，分別按“1.5”方法制備供試品溶液，按“1.4”色譜條件分析，記錄色譜圖，桑葚、桑葉樣品HPLC圖譜見圖2～4。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)》，以均值法生成指紋圖譜共有模式，生成的對照指紋圖譜R1、R2、R3見圖5～7。按照峰面積的大小，13批桑葉樣品共標示出9個共有峰，5批黑桑樣品共標示出5個共有峰，7批白桑樣品則標示出2個共有峰。經對照品保留時間定位及色譜峰紫外光譜分析，鑒別出2個共有峰。圖5的峰2、圖6的峰2與圖7的峰5為蕓香葉苷，圖5的峰5與圖7的峰8則為桑色素。

注：2.蕓香葉苷；5.桑色素。Note: 2.Rutin hydrate; 5.Morin hydrate圖5　5批黑桑HPLC特征指紋圖譜的共有模式R1Fig.5　Common pattern R1 of HPLC fingerprints of 5 batches of black mulberry

圖6　7批白桑HPLC特征指紋圖譜的共有模式R2Fig.6　Common pattern R2 of HPLC fingerprints of 7 batches of white mulberry

注：5.蕓香葉苷；8.桑色素。Note: 5.Rutin hydrate; 8.Morin hydrate.圖7　13批桑葉HPLC特征指紋圖譜的共有模式R3Fig.7　Common pattern R3 of HPLC fingerprints of 13 batches of mulberry leaves

2.2.2各共有峰相對保留時間與相對峰面積的測定。由HPLC色譜圖可以看出，蕓香葉苷是13批桑葚、桑葉共有的主要藥效成分。選擇圖5的峰2、圖6的峰2與圖7的峰5(蕓香葉苷)作為參照峰，分別計算各指紋圖譜共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果13批桑葉樣品各共有峰的相對保留時間RSD在0.01%～0.30%，各峰相對峰面積RSD在0.204%～0.839%。5批黑桑樣品各共有峰的相對保留時間RSD在0.02%～0.04%，各峰相對峰面積RSD在49.22%～100.51%。7批白桑樣品各共有峰的相對保留時間RSD為0.02%，相對峰面積RSD為19.55%。13批桑葚、桑葉樣品的蕓香葉苷含量見表3。由表3可知，各批樣品之間共有指紋峰的相對保留時間具有較好的重現性，但各桑葚、桑葉樣品中共有指紋峰的相對峰面積與蕓香葉苷含量均有很大差異。

表3　樣品中蕓香葉苷含量

2.2.3相似度分析。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)》將13批桑葉、5批黑桑與7批白桑樣品色譜圖與相應的對照指紋圖譜進行相似度分析，結果表明，桑葉樣品S1～S13與對照指紋圖譜R的相似度均大于0.900(表4)，符合指紋圖譜的要求，可建立共有模式。但桑葚色譜圖與對照指紋圖譜有一定差異，可見桑葚品種與種植環境對桑葚質量的控制有重要影響。

表4　樣品HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜R的相似度

3　討論

3.1色譜條件的優化該試驗對不同提取溶劑(體積分數分別為60%、70%、80%、100%甲醇)的超聲提取效果進行比較，結果表明，以70%甲醇提取效果較優。孫蓮等[15]、譚振鵬[16]研究表明，桑葉指紋圖譜的檢測波長為蘆丁的最大吸收波長280 nm。該試驗對供試品進行全波長掃描，結果表明，在330 nm處檢測的峰數目較多，多數峰響應值較大，因此，選擇330 nm作為桑葚、桑葉HPLC指紋圖譜的檢測波長。為了保證色譜圖能從總體上反映桑葚的化學信息，各化學成分盡可能出峰，并達到基線分離，有良好的分離度，不斷優化流動相的比例[17]，最終確定色譜條件，可實現圖譜各峰較好分離，出峰時間適宜，峰形正態分布。

3.2共有峰的標定指紋圖譜共有峰的標定，按照《重要注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》，根據13批供試品的檢測結果，采用相對保留時間標定指紋共有峰，色譜峰的相對保留時間根據參照峰的保留時間計算[18]。該研究借助《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版)》自動匹配色譜圖相關參數，13批桑葉樣品共標示出9個共有峰，5批黑桑樣品共標示出5個共有峰，7批白桑樣品則標示出2個共有峰，避免人工判斷的盲目性與誤差。

從該試驗得出的指紋圖譜可看出，對于不同批次的新疆桑葉，共有指紋峰數量較多，其相對保留時間一致，且HPLC色譜圖譜相似；相似度均較高(﹥0.900)，說明不同來源、批次桑葉的質量相對較穩定。7批白桑HPLC色譜圖相似度有一定差異，可以反映不同批次白桑樣品的內在質量差別。5批黑桑HPLC指紋圖譜中，各批次樣品間共有指紋峰的相對保留時間比較吻合，但不同批次的部分峰面積比值差別很大。

蕓香葉苷為桑葚及其有關制劑的主要藥效成分，在桑葚藥品開發過程中，蕓香葉苷為其制劑的主要質量控制標準[19]。該試驗結果表明，蕓香葉苷含量由高到低依次為桑葉、黑桑、白桑，尤其是桑葚樣品，不同果實顏色的桑葚樣品，蕓香葉苷含量具有明顯差異，推測這也是新疆黑桑藥用價值高于白桑的原因之一[20]。該試驗樣品是于相近時間在新疆吐魯番不同種植區采收的樣品，且采收后使用統一前處理方法和保存條件，故認為品種因素與種植環境造成樣品中各組分含量比例差異，在以后的研究中，將進一步累積樣品，著重考慮品種因素的影響深入研究。該研究建立的HPLC指紋圖譜方法精密度、穩定性、重復性良好，可為評價新疆桑葚、桑葉質量提供方法依據，爭取優選出新疆產藥效含量高的優質桑屬植物品種，實現新疆桑屬植物的規范化種植以保持其產品質量的穩定。

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Study on Fingerprints ofMorusalbafrom Xinjiang by HPLC

YANG Lu,FAN Shao-li,CHENG Ping,LI Hong*

Xinjiang Academy of Forestry Sciences,Urumqi,Xinjiang 830054)

[Objective] To establish the fingerprints ofMorusalba. from Xinjiang by HPLC.[Methods] The samples were separated on SunFire C18 (4.6 mm×150.0 mm,5.0 μm) with methanol-0.2% phosphoric acid as the mobile phase to conduct gradient eluent at the flow rate of 0.8 mL/min at 30 ℃,and the detection wavelength was 330 nm.The sample injection was 10 μL.[Results] 13 samples of mulberry and mulberry leaves from different origins of Xinjiang were detected.The results showed that the fingerprints had good accuracy,repeatability and stability.[Conclusion] The HPLC fingerprints can be used as the scientific evidence for identification and quality control ofM.albafrom Xinjiang.

Xinjiang;Morusalba; Fingerprint; HPLC

自治區公益性科研院所基本科研業務經費資助項目(KY201521)。

楊璐(1985- )，女，新疆烏魯木齊人,助理研究員，碩士，從事植物資源化學與生物活性物質研究。*通訊作者，研究員，博士，從事林果栽培和綜合利用研究。

2016-07-20

S 188

A

0517-6611(2016)26-0111-04