京尼平苷微生物轉化生產京尼平的研究

趙 平，楊 光，鄒積宏

(1.黑龍江省質量監督檢測研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150010)

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京尼平苷微生物轉化生產京尼平的研究

趙 平1，楊 光1，鄒積宏2

(1.黑龍江省質量監督檢測研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150010)

[目的]以京尼平苷為原料，在自然pH下，通過產β-葡萄糖苷酶的鄔衣黑曲霉發酵將京尼平苷轉化為京尼平。[方法]通過單因素和正交試驗考察了京尼平苷液濃度、發酵溫度、發酵時間、鄔衣黑曲霉孢子的接入量、搖瓶裝量對京尼平生成量的影響。[結果]最終確定最佳工藝為：在自然pH條件下，以0.20%京尼平苷液為發酵培養基，按菌株孢子與發酵培養基3.0∶10.0(V/V)的比例接入鄔衣黑曲霉孢子，搖瓶裝量為100 mL/250 mL，28 ℃，200 r/min發酵66 h。發酵結束后高效液相色譜檢測京尼平，結果顯示京尼平苷的轉化率可達99%以上，轉化產物京尼平純度可達98%以上。[結論]該研究所用方法安全、高效，是生產京尼平的可行方法。

京尼平苷；京尼平；微生物；轉化率

梔子是我國大宗傳統中藥材，為茜草科植物梔子(Gardeniajasminoides)的成熟干燥果實，是中藥臨床治療黃疸型肝炎的首選中藥材[1]。梔子干果中含有梔子黃色素、京尼平苷和京尼平，京尼平在梔子果實中的含量相當低(0.005%～0.010%)，而京尼平苷的含量豐富(3.06%～4.12%)[2-3]。京尼平是一種環烯醚萜類物質，無毒[4]。近年來，由于京尼平在抗腫瘤[1，4]、治療肝硬化[1，4-5]等方面療效顯著，同時作為一種新興的藥物中間體具有很多重要的藥理價值，因此具有很好的應用前景。京尼平還作為一種新型的生物交聯劑被應用于生物材料中[6-9]，它不僅能形成穩定的交聯制品，且具有細胞毒性小、生物相容性好、抗降解能力強和應用領域廣泛等優點，是非常有前途的交聯材料。由于京尼平在自然界中的含量較少[10]，直接提取十分困難，目前國際市場價高達80萬元/kg(≥99%純度)，嚴重制約了京尼平的廣泛應用。但京尼平苷為易得的組分，是天然前體物，可利用其與β-葡萄糖苷酶反應生成京尼平[3，10]。而β-葡萄糖苷酶價格昂貴，且它很難將京尼平苷完全轉化為京尼平，所以未能應用于實際生產。

由于京尼平在自然界中的含量較低，直接提取困難，國際市場價高制約了京尼平的應用，然而京尼平苷以京尼平的糖苷形式大量存在于梔子中，提取工藝簡單，售價低。酸堿水解打斷糖苷鍵的方法導致京尼平遭到破壞，影響生物活性，酶解法成本過高，限制了工業化生產。所以微生物發酵轉化方法生產京尼平是必然趨勢。該研究利用一株產β-葡萄糖苷酶的真菌黑曲霉發酵京尼平苷，將其轉化為京尼平，并對發酵條件進行優化，從而最大程度地提高京尼平的產量，使其可以作為一種新的生物學和藥學材料被廣泛應用。

1　材料與方法

1.1試材京尼平苷(≥98%)，杭州臨安天鴻生物科技有限公司；宇佐美曲霉AS3.758，浙江微生物研究所。

1.2設備YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；THZ-C恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；TDL-40B型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；RE-52AAA型旋轉蒸發器，上海嘉鵬科技有限公司；SPD-20A高效液相色譜儀，日本島津。

1.3方法

1.3.1培養基與菌株孢子培養。

1.3.1.1培養基。種子培養基：馬鈴薯200 g/L；葡萄糖10 g/L；水。121 ℃滅菌30 min。發酵培養基：京尼平苷水溶液，自然pH。

1.3.1.2菌株孢子的培養。無菌操作，挑取菌種接種于種子培養基中，28 ℃，200 r/min，培養48 h，得菌株孢子，4 ℃保存備用。

1.3.1.3京尼平苷的發酵。將菌株孢子洗去表面培養基接入發酵培養基，200 r/min，一定溫度發酵。

1.3.2京尼平苷和京尼平的標準曲線建立。高效液相色譜法對發酵底物和產物進行分析，色譜條件：色譜柱(C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測波長238 nm，進樣20 L，流動相為甲醇∶水(45∶55，V/V)，流速0.8 mL/min。利用此條件對京尼平苷和京尼平進行含量分析，得出標準曲線的線性回歸方程分別為y= 245 203x-68 472(r= 0.999 8)、y= 5×107x-6200.6(r= 0.999 9)。

1.3.3京尼平苷轉化率的計算。發酵前發酵培養基中京尼平苷的含量減去發酵結束后發酵所得京尼平液中京尼平苷的含量與發酵前培養基中京尼平苷的含量之比。

1.3.4發酵條件的優化。

1.3.4.1單因素試驗。稱取一定量的京尼平苷配成京尼平苷水溶液，自然pH，搖瓶裝液量為50 mL/250 mL，121 ℃滅菌30 min，按菌株孢子與發酵培養基2.0∶10.0(V/V)的比例接入宇佐美曲霉孢子，轉速200 r/min，28 ℃進行微生物發酵轉化。在此基礎上對京尼平苷濃度、發酵轉化溫度、時間、菌株孢子接入量、搖瓶裝液量進行單因素考察，確定最佳的發酵轉化條件。

1.3.4.2正交試驗。通過單因素試驗的考察確定正交試驗因素水平，采用L16(45)進行正交試驗(表1)，優化發酵條件。

1.3.5發酵過程的監控。250 mL三角瓶中，加入0.20%京

表1　正交試驗因素及水平設計

尼平苷溶液50 mL，無菌操作以2.0∶10.0的比例接入接種物，在自然pH條件下，28 ℃，200 r/min，搖床發酵120 h。發酵12 h后，每隔4 h取一次發酵菌液，發酵結束后過濾除去菌絲，然后以HPLC峰面積法來測定京尼平苷和京尼平的含量。

1.3.6京尼平液凍干。發酵結束后過濾除去菌絲，將所得京尼平液減壓濃縮后，凍干得白色結晶狀粉末。

2　結果與分析

2.1發酵條件的優化

2.1.1單因素試驗。

2.1.1.1時間對發酵的影響。從圖1可以看出，轉化66 h后京尼平苷的轉化率即可達95%以上，72 h達99%以上且隨轉化時間的增加，轉化率不再增加，而培養基顏色會逐漸加深，因為所得京尼平與發酵培養基中游離氨基酸發生反應，生成了梔子藍色素，且反應不可逆。為了減少損失，反應時間應控制在84 h以內。

圖1　發酵時間對京尼平苷轉化率的影響Fig.1　Effects of fermentation time on the transformation rate of geniposide

2.1.1.2發酵培養基中京尼平苷含量對發酵的影響。由圖2可見，當京尼平苷含量高于0.20%時京尼平苷轉化率并不高，由于反應不徹底京尼平苷的損失量較大，且所得京尼平不純；當京尼平苷含量低于0.20%時，京尼平苷轉化率可達99%以上，且所得京尼平純度較高。

圖2　京尼平苷含量對京尼平苷轉化率的影響Fig.2　Effects of geniposide content on the transformation rate of geniposide

2.1.1.3發酵溫度對發酵的影響。由圖3可見，當發酵溫度為28～30 ℃時，京尼平苷轉化率達99%以上，而溫度升高轉化率反而下降，這是由于溫度升高酶活受到抑制，且發酵培養的顏色有所加深。溫度高導致轉化生成的京尼平易與培養基中的游離氨基酸反應生成梔子藍色素，反應不可逆，造成京尼平損失。

2.1.1.4菌株孢子接入量對發酵的影響。由圖4可見，當菌株孢子接入量達2.0∶10.0(V/V)時,京尼平轉化率可達98%以上，接入量再增加時京尼平轉化率無明顯增加，且會增加發酵培養基中游離氨基酸的機會。

2.1.1.5搖瓶裝量對發酵的影響。由圖5可見，當搖瓶裝量為50 mL/250 mL時,京尼平苷轉化率可達99%以上，隨著搖瓶裝量的增加京尼平苷轉化率逐級降低。搖瓶裝量與轉化環境的溶氧量有直接關系，增大溶氧量有利于菌株孢子生長、產酶，促進京尼平苷的轉化。

圖3　發酵溫度對京尼平苷轉化率的影響Fig.3　Effects of fermentation temperature on the transformation rate of geniposide

圖4　菌株孢子接入量對京尼平苷轉化率的影響Fig.4　Effects of inoculation quantity of strain spores on the transformation rate of geniposide

圖5　搖瓶裝量對京尼平苷轉化率的影響Fig.5　Effects of bottled liquid volume on the transformation rate of geniposide

2.1.2正交試驗。從表2可看出，發酵培養基中各因素對發酵產物產量的影響從大到小依次為A、D、E、B、C，即京尼平苷含量對發酵產物的產量有很大影響。發酵最佳條件為A1B3C1D4E1，即發酵培養基中京尼平苷含量為0.15%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為66 h，菌株孢子接入量為3.0∶10.0(V/V)，搖瓶裝量為50 mL/250 mL。但實際操作過程中，搖瓶裝量過少會影響最終的京尼平產量，溫度高既浪費能源又會導致轉化生成的京尼平與培養基中的游離氨基酸反應造成京尼平的損失，而增加搖瓶裝量的同時需增加京尼平苷含量來提供發酵所需的原料。通過單因素試驗與正交試驗的綜合分析，將京尼平苷含量確定為0.20%，發酵溫度確定為28 ℃，搖瓶裝量確定為100 mL/250 mL。因此，最終確定發酵的最佳條件為A2B2C1D4E3，即發酵培養基中京尼平苷含量為0.20%，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為66 h，菌株孢子接入量為3.0∶10.0(V/V)，搖瓶裝量為100 mL/250 mL。

按優化方案進行平行發酵試驗3次，發現京尼平苷的轉化率為99.24%，京尼平的純度可達99.01%。然而在發酵工藝可行性的確定上，培養基的成本是關鍵因素，該試驗中所用京尼平苷可以通過梔子的提取獲得，且梔子中京尼平苷含量相對較高，而在發酵培養基中沒有其他營養物的加入，所以產品的價值可觀。

表2　正交試驗結果

2.2發酵工藝的特點從圖6可看出，在發酵過程中京尼平苷的轉化隨β-葡萄糖苷酶的活性一起增長，但在72～84 h京尼平苷的轉化率幾乎不再增長。隨著發酵時間的延長，京尼平濃度開始下降，可能由于京尼平和游離氨基酸反應造成。因此，京尼平苷完全轉化時發酵應停止，京尼平應立即提取，避免降低產率。

圖6　發酵時間與京尼平濃度的關系Fig.6　Relations of fermentation time with genipin and geniposide concentration

發酵所得京尼平樣品與標準品對比(圖7)發現，京尼平苷標準品保留時間為6.8 min，京尼平標準品的保留時間為10.5 min；發酵進行60 h時發酵體系中產物在6.8 min有色譜峰產生，京尼平苷轉化不完全；發酵結束后產物京尼平在10.5 min處有色譜峰產生，且6.8 min處無明顯峰產生。表明京尼平苷和宇佐美曲霉菌株進行發酵可完全將京尼平苷轉化為京尼平。

注：a.京尼平苷標準品；b.京尼平標準品；c.發酵60 h時發酵體系中產物；d.發酵結束后產物京尼平。Note：a.Standard of geniposide；b.Standard of genipin；c.Products in the fermentation system 60 h after the fermentation；d.Genipin after the ending of the fermentation.圖7 　發酵樣品與標準品對比Fig.7　Comparison of fermentation samples and standards

3　結論

該試驗利用一株黑曲霉菌種通過單因素和正交試驗考察了京尼平苷液濃度、發酵溫度、發酵時間、宇佐美曲霉孢子的接入量、搖瓶裝量對京尼平生成量的影響。結果表明，最佳工藝為：在自然pH條件下，以0.20%京尼平苷液為發酵培養基，按菌株孢子與發酵培養基3.0∶10.0(V/V)的比例接入宇佐美曲霉孢子，搖瓶裝量為100 mL/250 mL，28 ℃，200 r/min發酵66.0 h，并成功地將京尼平苷轉化為京尼平且轉化率可達99%，轉化產物京尼平的純度可達98%以上。在發酵培養基中不需加入其他的物質且pH自然，因此，這種方法成本低、轉化率高，轉化液中不含其他雜質，所得京尼平純度高且可控性好，具有工業化生產的潛力。

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Research on Transformation of Geniposide to Genipin by Microorganism Fermentation

ZHAO Ping1, YANG Guang1, ZOU Ji-hong2

1. Quality Supervision and Testing Institute of Heilongjiang Province, Harbin, Heilongjiang 150028; 2. College of Life Science, Heilongjinag University, Harbin, Heilongjiang 150010)

[Objective] To transform geniposide to genipin by fermentation ofAspergillususamiithat can produce β-glucosidase under the condition of natural pH. [Method] Through a single factor experiment and orthogonal design experiment, the effects of geniposide concentration, fermentation temperature, fermentation time, inoculation quantity ofA.usamiispores, and bottled liquid volume on the production of genipin were analyzed. [Result] The optimum process is shown as follows: under the condition of natural pH, 0.20% geniposide was as the fermentation medium, and the proportion of the spores to the fermentation medium was 3.0∶10.0 (V/V); bottled liquid volume was 100 mL/250 mL; the fermentation was conducted for 66 h at 28 ℃ at the rotating speed of 200 r/min. Under the optimum conditions, the purity of genipin was more than 98% ,and the conversion rate of geniposide reached more than 99% through HPLC testing. [Conclusion] The method is safe, efficient and feasible to produce genipin.

Geniposide; Genipin; Microorganism; Conversion rate

趙平(1985- )，男，黑龍江哈爾濱人，助理研究員，碩士，從事食品微生物檢測與研究。

2016-07-08

S 567

A

0517-6611(2016)26-0098-04