兩步培養法測定厚垣孢普可尼亞菌產孢的最佳條件

石 妍，肖 順， 劉國坤， 張紹升

福建農林大學植物保護學院，福建福州 350002)

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兩步培養法測定厚垣孢普可尼亞菌產孢的最佳條件

石 妍，肖 順， 劉國坤， 張紹升*

福建農林大學植物保護學院，福建福州 350002)

[目的] 探討厚垣孢普可尼亞菌產厚垣孢子的條件。[方法] 采用兩步培養法測定碳源、氮源、碳氮摩爾比、pH等不同營養環境條件對厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株產厚垣孢子的影響。[結果]PC021120-152菌株的最佳產厚垣孢子條件為：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為蔗糖/NaNO3，培養基最佳pH為8.0。PC021120-152菌株的最佳產分生孢子條件為：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為D-果糖/NaNO3,最佳pH為5.0。[結論]該研究結果可為厚垣孢普可尼亞菌生防制劑的生產調控提供依據。

厚垣孢普可尼亞菌；產孢；營養條件

厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)是根結線蟲和胞囊線蟲卵及雌蟲的寄生菌[1]，是國內外目前研究較多的線蟲寄生真菌之一，在無性世代能產生大量磚格狀的、對高溫、干旱和營養貧瘠等不良環境具有強耐受力的厚垣孢子，使其易在土壤中存活[1-2]。此外，厚垣孢普可尼亞菌對植物不具有致病性[2]，是一種具有開發應用前景的線蟲生防真菌。研究表明，營養環境條件對真菌產孢的類型有較大的影響，可通過營養環境條件的改變來控制生產所需的孢子類型，以獲得耐受力(耐干燥、高溫)較強的孢子。筆者采用兩步培養法探討碳源、氮源、碳氮比、pH等不同營養環境條件對厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株產厚垣孢子的影響，以期為其固態擴大培養提供理論依據。

1　材料與方法

1.1供試菌株厚垣孢普可尼亞菌菌株PC021120-152，由福建農林大學植物線蟲學實驗室分離、鑒定并保存。

1.2真菌孢子懸浮液的制備PDA斜面菌種活化后，加入適量無菌水，用接種針刮取菌落表面，用微型旋渦混合儀振蕩使孢子均勻分散，使用血球計數板計數后，再用無菌水將孢子懸浮液濃度調至106個/mL，備用。

1.3營養環境條件對厚垣孢普可尼亞菌產孢的影響

1.3.1碳源。基礎培養基(Czapek培養基)[3]：蔗糖30.00 g/L、NaNO32.00 g/L、 K2HPO41.00 g/L、 FeSO4·7H2O 0.01 g/L、KCl 0.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.50 g/L、瓊脂18.00 g/L，pH自然。

用相同碳量的碳源代替基礎培養基中的蔗糖為碳源。供試碳源為：葡萄糖、乳糖、D-果糖、可溶性淀粉。以無碳源基礎培養基為對照(CK)，3次重復。

1.3.2氮源。用相同氮量的氮源代替基礎培養基中的NaNO3為氮源。供試氮源為：NH4Cl、脲(CH4N2O)、L-酪氨酸(C9H11NO3)、甘氨酸(C2H5NO2)。以無氮源基礎培養基為對照(CK)，3次重復。

1.3.3碳氮源組合。根據碳氮源單因素試驗，以可溶性淀粉、蔗糖、D-果糖為碳源，以NaNO3、L-酪氨酸為氮源，配成6種不同碳氮源組合的培養基。3次重復。

1.3.4碳氮比(摩爾比)。根據篩選出的最佳碳氮源，設定碳源起始濃度為3.00、6.00、12.00、24.00 g/L；氮源起始濃度為0.35、0.70、1.40、2.80 g/L；16種不同碳氮濃度組合所得的碳氮比范圍為:1.25∶1～80.00∶1。3次重復。

1.3.5pH。根據上述試驗結果配制培養基，滅菌前用1.0 mol/L HCl 和1.0 mol/L NaOH調節培養基的pH，分別為4、5、6、7、8、9。以不調整pH的培養基為對照(CK)，3次重復。

1.4試驗方法

1.4.1兩步培養法。參考Sun等[4]的方法，稍做改動。①在培養皿中倒入基礎培養基后，在培養基表面放無菌玻璃紙(φ7.5 cm)。將孢子懸浮液(接種量為100 μL)接種到玻璃紙上，用無菌玻璃刮鏟來回充分涂勻。正面靜置20～30 min，用parafilm封口。28 ℃下倒置黑暗培養，3次重復。②4 d后，將玻璃紙移至不同營養環境條件的新鮮培養基中進行產孢培養。培養7 d后，用鑷子輕刮玻璃紙上的菌落，然后將菌落放入裝有100 mL體積分數為0.15%的吐溫-80溶液的三角瓶中，置于微型旋渦混合儀上充分渦旋混合，稀釋成一定倍數后，取樣，計孢子數，3次重復。

1.4.2孢子計數。分生孢子使用血球計數板計數；厚垣孢子由于其直徑(20～25 μm)較大，不易用血球計數板計數，故用以下方法計數：用移液槍吸取20 μL孢子懸浮液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學顯微鏡下逐一計數，3次重復。1.5數據處理采用Excel 2010進行數據統計與繪圖，使用DPS軟件進行數據處理，方差分析采用Duncan’s新復極差法。2結果與分析

2.1不同碳源對厚垣孢普可尼亞菌產孢的影響從圖1、2可以看出，5種碳源對菌株PC021120-152產孢有顯著影響。可溶性淀粉最有利于產厚垣孢子，培養結束時產孢量達到3.04×106個/菌落，其中α-乳糖的產孢量少于對照。就產分生孢子而言，以蔗糖為碳源的培養基中產孢量最大，達到2.17×109個/菌落。5種碳源產分生孢子量均高于對照。由此可見，供試菌株PC021120-152產分生孢子和產厚垣孢子所需的最佳碳源不同。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖1　不同碳源對厚垣孢普可尼亞菌產厚垣孢子的影響Fig.1　Effects of carbon sources on chlamydospore production of P.chlamydosporia

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖2　不同碳源對厚垣孢普可尼亞菌產分生孢子的影響Fig.2　Effects of carbon sources on conidiophore production of P.chlamydosporia

2.2不同氮源對厚垣孢普可尼亞菌產孢的影響從圖3可以看出，厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152在以NaNO3為氮源的培養基中產厚垣孢子量最大，為3.50×106個/菌落，其次為L-酪氨酸，其他3種氮源的產孢量均低于對照。就產分生孢子而言，也是NaNO3最利于產分生孢子，以脲、NH4Cl、甘氨酸為氮源的處理產分生孢子量低于對照(圖4)。由此可見，以NaNO3為氮源，既有利于產厚垣孢子，又有利于產分生孢子。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖3　不同氮源對厚垣孢普可尼亞菌產厚垣孢子的影響Fig.3　Effects of nitrogen sources on chlamydospore production of P.chlamydosporia

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖4　不同氮源對厚垣孢普可尼亞菌產分生孢子的影響Fig.4　Effects of nitrogen sources on conidiophore production of P.chlamydosporia

2.3最佳碳氮源組合的確定由表1可知，產厚垣孢子量最大的碳氮源組合為蔗糖/ NaNO3，其次為可溶性淀粉/ NaNO3和D-果糖/ NaNO3，與其他碳氮源組合差異顯著；D-果糖/ NaNO3的碳氮源組合分生孢子產量最大，其次為蔗糖/ NaNO3組合。2.4碳源濃度和碳氮摩爾比對厚垣孢普可尼亞菌產孢的影響從表2可以看出，碳源濃度、碳氮摩爾比對菌株PC021120

表1　不同碳氮源組合對厚垣孢普可尼亞菌產孢的影響

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

-152產厚垣孢子量有顯著的影響。當碳源起始濃度為3.00 g/L時，碳氮摩爾比為2.5∶1的處理的產孢量是所有處理中最大的，達24.00×105個/菌落。當碳源濃度較低時(3.00和6.00 g/L)，碳氮摩爾比小的處理(碳氮摩爾比為2.5∶1)厚垣孢子產量較大。當碳源濃度較高時(12.00和24.00 g/L)，碳氮摩爾比大的處理(碳氮摩爾比為20∶1)厚垣孢子產量較大。當碳源濃度為24.00 g/L時，所有處理的產孢量開始減少。

碳源濃度和碳氮摩爾比對菌株VC021120-152產分生孢子也有顯著的影響。當碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1的處理產孢量也最大，達到31.80×108個/菌落，與其他處理差異達到顯著水平(P<0.05)。

表2碳源濃度和碳氮比對厚垣孢普可尼亞菌產分生孢子的影響

Table 2Effects of carbon concentration and carbon-nitrogen molar ratio on sporulation ofP.chlamydosporia

碳源濃度Carbonconc-entrationg/L碳氮摩爾比Carbon-nitrogenmolarratio厚垣孢子產量Chlamydosporeproduction×105個/菌落分生孢子產量Conidiophoreproduction×108個/菌落3.010∶17.33±0.16bh7.35±0.90def3.05∶19.08±0.04f6.43±0.26efg3.02.5∶124.00±0.21a31.80±2.71a3.01.25∶110.80±0.29d9.07±0.18c6.020∶11.30±0.08j13.70±0.08b6.010∶114.30±0.22c8.73±0.06cd6.05∶10.92±0.01ki5.63±0.71fg6.02.5∶115.50±0.15c6.66±0.29fg12.040∶111.00±0.21d4.35±1.36g12.020∶116.30±0.23b7.36±0.70def12.010∶110.00±0.16e4.67±0.58g12.05∶18.73±0.07g6.54±0.26efg24.080∶10.67±0.02i4.97±0.12g24.040∶10.34±0.02m9.73±1.79c24.020∶17.00±0.02h15.30±0.77b24.010∶11.08±0.03jk7.72±1.41cde

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

2.5pH對厚垣孢普可尼亞菌產孢的影響從圖5可以看出，弱堿性條件有利于厚垣孢子的產生。當pH為8.0時，厚垣孢子產量最大，與其他處理差異顯著。就產分生孢子而言，當pH為5.0時產孢量較大(圖6)，與Gao等[5]報道的結果相似。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖5　不同pH對厚垣孢普可尼亞菌產厚垣孢子的影響Fig.5　Effects of different pH on chlamydospore production of P.chlamydosporia

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖6　不同pH對厚垣孢普可尼亞菌產分生孢子的影響Fig.6　Effects of different pH on conidiophore production of P.chlamydosporia

3　結論與討論

真菌生長和產孢所需的營養條件不同，適合其營養生長的條件并不一定適合其產孢。兩步培養法是指使待測真菌在適宜該真菌生長的培養基中進行營養生長至產孢前，然后將獲得的產孢前的營養菌絲體轉移至不同營養成分或不同環境條件的新鮮培養基中，進行產孢培養[4]。筆者采用兩步培養法確定了厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株的最佳產厚垣孢子條件：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為蔗糖/NaNO3，最佳pH為8.0。PC021120-152菌株的最佳產分生孢子條件為：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為D-果糖/ NaNO3，最佳pH為5.0。由此可見，厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株的最佳產分生孢子和厚垣孢子的營養條件不同，在該生防菌劑的發酵調控中根據需要選擇最適合的產孢條件。

培養基的組成和配比合適與否對微生物的生長、繁殖、代謝和產物形成都會產生相當大的影響。影響真菌產孢的因素主要有培養基的營養、pH、濕度、無機鹽。培養基的營養成分不能太豐富，碳源、氮源不宜過多，尤其是有機氮源含量要少一些，否則不易形成孢子，而無機鹽的用量會影響孢子的顏色和數量[6]。關于營養、pH、溫度、光照、水活度等條件對厚垣孢普可尼亞菌產分生孢子的影響已有報道[5，7-10]，但這些條件對其產厚垣孢子的影響卻鮮有報道。厚垣孢子的產生是菌株應對營養缺失或者其他環境壓力(如高溫、高壓、干燥等)的一種方式[11]，使其易在土壤中存活。孢子是真菌殺蟲劑的主要成分，能否在人工培養基上產生大量孢子是評價菌株作為是否有潛力的重要標準。液固雙相發酵在微生物大批量培養中應用廣泛，它是指經液體深層發酵培養出菌絲或孢子后接入固體培養基上產生孢子的方法，此過程與兩步培養法相似。Sun等[4]研究表明采用兩步培養法獲得的最佳碳氮源產孢量比連續培養法相應的碳氮源產孢量多。在連續培養中，菌絲營養生長會改變培養基的成分，降低其營養，無法確定真菌產孢階段的起始濃度。采用兩步培養法確定的真菌產孢營養環境條件對于指導真菌生防菌劑的生產、提高固態發酵的產孢量具有一定的意義。

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Optimum Conditions for Sporulation ofPochoniachlamydosporiain Two-stage Cultivation

SHI Yan,XIAO Shun,LIU Guo-kun,ZHANG Shao-sheng*

(College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)

[Objective] To discuss the nutritional conditions for sporulation ofPochoniachlamydosporia. [Method] A two-stage cultivation method was used to determine the effects of various nutritional and environmental conditions (carbon sources,nitrogen sources,carbon-nitrogen molar ratio,and pH) on the sporulation ofP.chlamydosporiaPC021120-152.[Result] Chlamydospore production of PC021120-152 strains was the highest when the initial carbon concentration was 3.00 g/L; the carbon-nitrogen molar ratio was 2.5∶1; sucrose/NaNO3was as the carbon/nitrogen source,and the pH was 8.Conidiophore production of PC021120-152 strains was the highest when the initial carbon concentration was 3.00 g/L; the carbon-nitrogen molar ratio was 2.5∶1; D-fructose/NaNO3was as the carbon/nitrogen source,and the pH was 5.0.[Conclusion] The research provides

for industrialization of biocontrol agents ofP.chlamydosporia.

Pochoniachlamydosporia; Sporulation; Nutritional conditions

中國煙草總公司福建公司科技項目(閩煙2012[041]號)。

石妍 (1986- )，女，福建三明人，助理實驗師，碩士，從事微生物發酵方面的研究。*通訊作者，教授，博士生導師，從事植物病理學方面的研究。

2016-07-11

S 432.4+4

A

0517-6611(2016)26-0016-04