GC-MS/MS法測(cè)定鐵皮石斛中19種農(nóng)藥殘留

王吉祥，王亞琴，牛之瑞，馮雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650223）

GC-MS/MS法測(cè)定鐵皮石斛中19種農(nóng)藥殘留

王吉祥，王亞琴，牛之瑞，馮雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650223）

建立固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鐵皮石斛中19種農(nóng)藥殘留的分析方法。石斛樣品經(jīng)乙腈提取，經(jīng)ENVI-Carb/Florisil固相萃取小柱進(jìn)行凈化后，采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下測(cè)定，外標(biāo)法定量。19種農(nóng)藥成分在10 μg/L～200 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.993 1～0.999 8范圍內(nèi)；19種農(nóng)藥成分在3個(gè)添加水平下（10、100、200μg/L），加標(biāo)回收率范圍為 82.83%～109.29%，RSD%（n=5）為1.43%～5.74%；各農(nóng)藥成分的檢出限均小于0.58μg/L。該方法可應(yīng)用于石斛中多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。

鐵皮石斛；氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法；農(nóng)藥殘留

石斛為蘭科石斛屬植物，因其獨(dú)特的滋陰益胃功效，鐵皮石斛長(zhǎng)期被視為奇貨可居的石斛精品。清代趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》大書鐵皮石斛為“滋陰補(bǔ)益”珍品，近代謝宗萬(wàn)盛贊鐵皮石斛“脂膏豐富，滋陰之力最大”。現(xiàn)代藥理試驗(yàn)證實(shí)，石斛具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血壓、降血糖以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多方面的藥理作用。因本品野生資源較少，目前市場(chǎng)上多為栽培品，受病蟲害的影響，難免使用農(nóng)藥防治病蟲害。如農(nóng)藥使用不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，從而危害人類健康。目前對(duì)鐵皮石斛農(nóng)殘檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少，因此，對(duì)鐵皮石斛中的多種農(nóng)藥殘留量進(jìn)行檢測(cè)具有十分重要的意義[1-2]。

目前，農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜或液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法等。中藥材成分復(fù)雜，常用的色譜方法根據(jù)待測(cè)農(nóng)藥的保留時(shí)間進(jìn)行定性，易受基質(zhì)干擾，且易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于其具有極高的選擇性、極強(qiáng)的抗干擾能力、高靈敏度和高通量離子傳輸效率及準(zhǔn)確定量的特點(diǎn)，這使得該技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)背景下仍能完成目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確鑒定。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式的串聯(lián)質(zhì)譜儀（MS/MS）正在迅速成為復(fù)雜食品基質(zhì)樣品中多殘留目標(biāo)化合物篩查分析的理想技術(shù)，在食品安全分析中具有非常廣泛的應(yīng)用[3-11]。本文建立了固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定石斛中19種農(nóng)藥殘留。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、實(shí)用，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)滿足檢測(cè)要求，能夠很好的應(yīng)用于石斛農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

GCMS-TQ8030氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本Shimadzu公司；GL-12B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；N-EVAP氮吹儀：美國(guó)Organomation公司；CPA225D電子天平：德國(guó)Sartorius公司；十二孔固相萃取裝置：美國(guó)Waters公司。

ENVI-Carb固相萃取小柱（3 mL）、LC-Florisil固相萃取小柱（6 mL）：美國(guó)Supelco公司；丙酮、乙腈、正己烷（均為色譜純）：美國(guó)Fisher Scientific公司。

六六六（α-666、β-666、γ-666、δ-666）、滴滴涕（p.p’-DDE、p.p’-DDD、o.p’-DDT、p.p’-DDT）、甲基毒死蜱、殺螟硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱、二甲戊樂靈、聯(lián)苯菊酯、氯菊酯、蠅毒磷、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯：均購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，質(zhì)量濃度為100μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷定容至10 mL，配成10.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)實(shí)際需要，梯度稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 氣相色譜—質(zhì)譜條件

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：Rtx-5MS（0.25 mm×0.25 μm×30 m）石英毛細(xì)管柱；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進(jìn)樣口溫度：250℃；柱溫：初始溫度50℃，保持1min，然后以25℃/min程序升溫到125℃，再以10℃/min程序升溫到300℃，保持 15 min；柱流速：1.69 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1 min后開閥。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度200℃；色譜-質(zhì)譜接口溫度250℃；溶劑延遲時(shí)間1.5 min；數(shù)據(jù)采集模式MRM。19種農(nóng)藥成分的保留時(shí)間及優(yōu)化的MRM參數(shù)見表1。

表1 19種農(nóng)藥成分的保留時(shí)間及優(yōu)化的MRM參數(shù)Table 1 Retention time and optimized MRM conditions of 19 pesticides

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取10.0 g制好的石斛試樣放入勻漿機(jī)中，加入20.0 mL乙腈，在勻漿機(jī)中高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有適量氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。吸取2 mL上清液，低溫氮吹至凈干，用2.0 mL正己烷-丙酮（2∶1，體積比）溶解，待凈化。

將ENVI-Carb小柱用2.0 mL正己烷-丙酮（2∶1，體積比）預(yù)淋洗，條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用10 mL比色管接收洗脫液約8 mL，低溫氮吹至約1 mL，用正己烷-丙酮（9∶1，體積比）2 mL溶解，待下一步凈化。然后將Florisil小柱用 2.0 mL 正己烷-丙酮（9∶1，體積比）預(yù)淋洗，條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用10mL比色管接收洗脫液約8mL，低溫氮吹至凈干，用正己烷定容至1.0 mL，待測(cè)[12-13]。

圖1 19種農(nóng)藥3種凈化方法的回收率Fig.1 Recoveries of 19 pesticide residues obtained by three purification methods

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化方法的選擇

參照現(xiàn)行農(nóng)藥殘留測(cè)定有關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法及國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，主要考察以下幾種方式：①石墨化碳／氨基串聯(lián)固相萃取柱，②PSA固相萃取柱，③ENVICarb/Florisil柱凈化，結(jié)果ENVI-Carb/Florisil柱的凈化效果最好，供試品溶液顏色最淺，總離子流中干擾峰較少，回收率最好，基質(zhì)效應(yīng)也較低，最終選用ENVICarb/Florisil固相萃取柱凈化，見圖1。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

中藥材成分復(fù)雜，對(duì)于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)也有一定的影響，有些可能有基質(zhì)增強(qiáng)作用，有些可能有基質(zhì)減弱效應(yīng)。對(duì)于氣質(zhì)農(nóng)藥殘留分析，通常會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，具體表現(xiàn)為使用農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品定量時(shí)會(huì)出現(xiàn)某種農(nóng)藥的回收率低于或高于可接受范圍。為了避免藥材本身帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)，采取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方法消除和減弱基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)利用選擇離子定量檢測(cè)也可以大大提高分析方法的選擇性，排除一些雜質(zhì)的干擾，最終獲得較滿意的試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法選擇MRM下的2對(duì)離子對(duì)進(jìn)行各農(nóng)藥的分析，其中1對(duì)離子對(duì)用于定量分析。為了獲得最佳的質(zhì)譜條件以保證對(duì)分析物定量和定性的準(zhǔn)確性，對(duì)待測(cè)物的前級(jí)離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等一系列質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用全掃描（Full Scan）方式獲取待測(cè)物的前級(jí)離子，之后采用產(chǎn)物離子掃描方式（Product Scan）通過優(yōu)化碰撞能量獲得產(chǎn)物離子，最后采用MRM模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量分析。經(jīng)過方法優(yōu)化可以得到較為理想的質(zhì)譜條件和分離效果。優(yōu)化條件下10 μg/mL基質(zhì)加標(biāo)工作液的總離子流（TIC）色譜圖見圖2。

圖2 19種農(nóng)藥的總離子流色譜圖Fig.2 Chromatogram of MRM for 19 pesticide residues

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取19種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，配制成5個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，在所確定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，分別對(duì)19種農(nóng)藥成分的峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以S/N≥3確定每種農(nóng)藥成分的檢出限。線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.1 mg/L的19種農(nóng)藥對(duì)照品溶液，按上述色譜-質(zhì)譜條件和檢測(cè)方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。19種農(nóng)藥峰面積的RSD（n=6）介于1.43%與5.74%之間，表明儀器精密度良好，測(cè)定結(jié)果見表3。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取不含農(nóng)藥的石斛樣品，精確添加10、100、200μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一分析條件下進(jìn)行5次試驗(yàn)，計(jì)算各濃度下平均回收率及RSD，測(cè)定結(jié)果見表3。

表2 19種農(nóng)藥成分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equation，linearity range，correlation coefficient and limit of detection of 19 pesticide residues

表3 石斛中19種農(nóng)藥精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 19 pesticides precision and recovery test results in dendrobium devoninum paxt

續(xù)表3 石斛中19種農(nóng)藥精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 19 pesticides precision and recovery test results in dendrobium devoninum paxt

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過優(yōu)化檢測(cè)條件，利用氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀，建立了對(duì)鐵皮石斛中19種農(nóng)藥同時(shí)進(jìn)行分析的方法。本方法條件下19種農(nóng)藥完全基線分離，每種化合物選擇特征離子的兩個(gè)二級(jí)離子，降低干擾，提高了靈敏度，特別對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)中假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行排除。該方法具有簡(jiǎn)單快速，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，能有效地消除假陽(yáng)性的可能，適用于鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)和確證，保證了該方法對(duì)鐵皮石斛中的多種農(nóng)藥同時(shí)分析的準(zhǔn)確性，檢出限滿足目前國(guó)內(nèi)的檢測(cè)要求。

[1] 陳曉梅,郭順星．石斛屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2001,13(1)：70-75

[2] 林萍,畢志明,徐紅,等．石斛屬植物藥理活性研究進(jìn)展[J]．中草藥,2003,34(11)：1073-1076

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2000：75

[4] 施家威,李繼革,王玉飛,等.固相萃取-氣相色譜/三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜分析蔬菜中 42 種農(nóng)藥殘留[J]．色譜,2010,28(12)：1137－1143

[5] 沈偉健,余可垚,桂茜雯,等.分散固相萃取－氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中 107 種農(nóng)藥的殘留量[J]．色譜,2009,27(4)：391－400

[6] 孫磊麗,李曉玉,隋濤．氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定菠菜中有機(jī)氯殘留量[J]．廣州化工,2010,38(11)：155－157

[7] 易盛國(guó),侯雪,韓梅,等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蔬菜農(nóng)藥殘留基質(zhì)效應(yīng)與基質(zhì)分類的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,25(2)：537-543

[8] 王連珠,周昱,陳泳,等．QuEChERS樣品前處理－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中66種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量方法評(píng)估[J]．色譜,2012,30(2)：146

[9] 宋淑玲,李重九,馬曉東,等.蔬菜中殘留農(nóng)藥的石墨化碳黑凈化和氣相色譜－質(zhì)譜檢測(cè)方法[J]．分析化學(xué),2008,36(11)：23

[10]LehotaY SJ,de Kok A,Hiemstra M,et al．Validation of a fast and easY method for the determination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatographY and mass spectrometric detection[J]．J AOAC Int,2005,88(2)：595

[11]Anastassiades M,LehotaY SJ,Stajnbaher D,et al．Fast and easY multiresidue method emploYing acetonitrile extraction/partitioning and“dispersive solid － phase extraction”for the determination of pesticide residues in produce[J]．J AOAC Int,2003,86(2)：412

[12]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.NY/T 761-2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2008

[13]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 19648-2006水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006

Determination of 19 Kinds of Pesticide Residues in Dendrobium officinale Prescription by Gas Chromatography－Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry

WANG Ji-xiang，WANG Ya-qin，NIU Zhi-rui，F(xiàn)ENG Lei
（Yunnan Product Quality Supervision and Testing Academy，Kunming 650223，Yunnan，China）

To develop an analysis method based on gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）for the determination of 19 kinds of pesticide residues in Dendrobium officinale prescription.Dendrobium officinale prescription samples were extracted with acetonitrile，and then purified through ENVI-Carb/Florisil solid phase extraction（SPE）cartridge.The prepared samples were then analyzed by GCMS/MS in MRM mode，and the external standard method was applied to quantify the pesticides.All the 19 pesticides showed good linearity in the range of 10 μg/L to 200 μg/L（r=0.993 1-0.999 8），the average recoveries of all the pesticides were in the range of 82.83%to 109.29%at three spiked levels of 10，100，200 μg/L，the RSD（n=5）were in the range of 1.43%to 5.74%；and the limits of detection（LOD）were all below 0.58 μg/L.The method is suitable for the multiresidues analysis of pesticides in Dendrobium officinale prescription.

Dendrobium officinale prescription；GC-MS/MS；pesticide residues

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.034

王吉祥（1983—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：農(nóng)藥殘留檢測(cè)。

2015-08-03