豬鼻支原體表面可變脂蛋白vlpA黏附宿主細胞功能研究

張必雄，熊祺琰，王　佳，紀　燕，倪　博，韋艷娜，馮志新，劉茂軍，邵國青,3*

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室/國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京210014；2山西農業大學動物科技學院，太谷 0308003;3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，南京 210095)

?

豬鼻支原體表面可變脂蛋白vlpA黏附宿主細胞功能研究

張必雄1，2，熊祺琰1*，王佳1，紀燕1，倪博1，韋艷娜1，馮志新1，劉茂軍1，邵國青1,3*

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室/國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京210014；2山西農業大學動物科技學院，太谷 0308003;3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，南京 210095)

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis)可引起豬的多發性漿膜炎、關節炎、肺炎及中耳炎等多種慢性炎癥，感染率極高，且與人類腫瘤的發生有關，對人類健康構成威脅。已有研究表明豬鼻支原體表面可變脂蛋白(vlp)家族參與支原體黏附宿主細胞的過程，本試驗主要詳細研究vlp家族成員之一vlpA的黏附細胞功能，特別是其Ⅲ區重復片段重復次數變化對其黏附能力的影響。根據GenBank中已公布的vlpA的基因序列，設計引物，從菌體DNA中擴增獲得vlpA基因，或者人工合成Ⅲ區重復片段重復次數不等的一系列vlpA基因，均克隆至pET-32a(+)質粒中進行表達，獲得目的蛋白質。同時利用固相合成法制備含兩段Ⅲ區重復片段的多肽。利用間接免疫熒光試驗和微孔板黏附試驗檢測所制備的各種重組vlpA蛋白和多肽的黏附功能。通過誘導表達和鎳柱親和層析純化，成功獲得純度較高的各個目的蛋白質。利用間接免疫熒光試驗證實vlpA可以黏附宿主細胞；利用微孔板黏附試驗定量檢測不含Ⅲ區的重組vlpA0蛋白及Ⅲ區重復片段多肽的黏附能力，結果發現vlpA0可黏附細胞，而Ⅲ區重復片段多肽無明顯黏附能力；進一步利用微孔板黏附試驗檢測含Ⅲ區重復片段次數分別為3、6、9、12次的重組蛋白vlpA3、vlpA6、vlpA9、vlpA12的黏附能力，結果顯示四種重組蛋白質均可黏附細胞，但黏附水平均低于不含Ⅲ區的重組vlpA0蛋白，且隨著Ⅲ區重復片段重復次數的增加黏附能力下降。本研究結果提示vlpA為豬鼻支原體黏附因子之一，其Ⅱ區含有黏附位點，而整體分子的黏附能力隨著Ⅲ區重復片段重復次數的增加明顯減弱。本研究結果有助于進一步研究豬鼻支原體的黏附及致病機制。

豬鼻支原體；可變脂蛋白vlpA；細胞黏附；重復次數

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，M.hyorhinis)可引起豬的多發性漿膜炎、關節炎、肺炎及中耳炎等多種慢性炎癥[1-4]，通常由母豬或大豬經呼吸道傳染給小豬，進而從呼吸道侵染全身引發疾病。M.hyorhinis也是實驗室細胞培養的常見污染物[5]。同時近年來研究者在人胃癌組織中檢測到M.hyorhinis，并進而發現M.hyorhinis的感染與包括胃癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等在內的多種癌癥有明顯相關性，提示M.hyorhinis與腫瘤的發生有關，對人類健康構成威脅[6-13]。支原體一般不通過直接的毒力因子致病，而是通過長期持續性感染引發機體慢性炎癥應答而導致病變的發生。幾乎所有的人和動物支原體都通過最初的黏附宿主細胞從而實現后續在體內的增殖和感染，因此黏附因子在支原體感染致病的過程中起著極為重要的作用。到目前為止M.hyorhinis的黏附因子尚不清楚，這嚴重阻礙了其致病機制的深入研究。

支原體的基因組中常常含有可變基因家族，用于編碼大容量的可變抗原庫，使得菌體表面的抗原性發生變化，有效逃避宿主免疫系統實現長期感染[14-15]。M.hyorhinis中發現的可變蛋白質被稱為可變脂蛋白(variable lipoprotein，vlp)家族[16-18]。目前共發現有7個成員，即vlpA、vlpB、vlpC、vlpD、vlpE、vlpF和vlpG。M.hyorhinis可表達一種或多種vlp，構成不同的表達組合；同時每個vlp成員內部都含有“數目可變串聯重復(variable number of tandem repeats，VNTR)區”，可通過插入或缺失基因片段改變重復次數，從而使整個分子的長度發生變化。通過這兩種表達變異，幫助支原體改變表面抗原性，逃避宿主免疫系統。

在前期研究中作者已經證明vlp家族具有黏附細胞功能，本試驗主要針對vlp 7個成員之一的vlpA的黏附功能進行具體研究，包括黏附能力檢測、黏附功能區域鑒定、數目可變串聯重復區(即Ⅲ區)的片段重復次數對黏附能力的影響。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料

1.1.1材料與試劑質粒pET-32a(+)由江蘇省農業科學院獸醫研究所保存；大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。PCR各種試劑、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白質相對分子質量標準、XhoⅠ和HindⅢ均購自TaKaRa公司；引物由南京金斯瑞生物科技公司合成；HRP-羊抗兔IgG、FITC-羊抗兔IgG購自武漢博士德公司；兔抗硫氧還蛋白多抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；細胞裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒購自碧云天股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2PK-15細胞培養 PK-15細胞用含10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養液培養，待細胞匯合至90%以上時，胰蛋白酶消化。細胞以2×105·孔-1接種于96孔細胞板，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。

1.2vlpA基因的擴增及重組vlpA蛋白構建

vlpA基因結構如圖1所示，其中Ⅰ區編碼信號肽，Ⅲ區為數目可變串聯重復區。根據GenBank中已公布的豬鼻支原體vlpA基因序列，利用Oligo7軟件設計引物，從豬鼻支原體基因組中擴增vlpA基因(不含信號肽)。PCR引物序列如下：vlpA-F，5′-GACGGATCCTGTGGACAAACAGATAATA-A-3′；vlpA-R，5′-CGCAAGCTTCTATTGTG-TGTTTTCAGTTTTTG-3′，兩端分別添加BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。將擴增的PCR產物與pEASY-E1載體酶連接構建pEASY-E1/vlpA重組質粒。經PCR及測序驗證正確后以vlpA上下游引物擴增目的基因片段，經雙酶切后插入pET-32a(+)空載體質粒的多克隆位點中，構建得到重組質粒pET-32a(+)/vlpA。轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，以引物vlpA-F和T7終止子引物進行PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定序列的正確性。制備甘油管保存菌種，命名為vlpA。

1.3vlpA蛋白Ⅱ區重組蛋白構建

根據GenBank 上公布的豬鼻支原體vlpA基因序列，合成編碼vlpAⅡ區肽段的基因(圖1)，同時進行大腸桿菌偏愛密碼子的優化。合成基因的兩端添加EcoRⅠ和HindⅢ位點，通過雙酶切連入pET-32a(+)中，構建得到重組質粒pET-32a(+)/vlpA0。轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，以T7啟動子和T7終止子引物進行PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定序列的正確性。制備甘油管保存菌種，命名為vlpA0。

圖1　vlpA結構和試驗中用到的重組蛋白質、多肽結構示意Fig.1　Gene structure of vlpA and recombinant vlp proteins and peptides used in the present study

1.4vlpA蛋白Ⅲ區重復片段多肽的合成

采用固相化學合成的方法合成2次重復的vlpAⅢ區重復片段(圖1)，其N端添加一個半胱氨酸用于偶聯KLH(keyhole limpet hemocyanin)。具體序列為“NH2-CKTENTQQSEAPGTKTENTQQSEAPGT-COOH”，合成肽經高效液相色譜純化，純度大于85%。短肽的合成及偶聯由Synpeptide有限公司完成。

1.5Ⅲ區重復片段重復次數不等的系列vlpA重組蛋白的構建

根據GenBank 上公布的豬鼻支原體vlpA基因序列，采用基因合成方法獲得Ⅲ區重復片段重復次數分別為3、6、9、12次的vlpA基因，同時進行大腸桿菌偏愛密碼子的優化。合成的基因的兩端添加EcoRⅠ和HindⅢ位點，通過雙酶切裝入pET-32a(+)中，構建得到重組質粒pET-32a(+)/vlpAn(n為3、6、9或12)。同前轉化、篩選、鑒定，命名為vlpA3、6、9、12。

1.6重組蛋白質的表達及純化

接種100 μL重組工程菌甘油管菌液至5 mL氨芐抗性的LB液體培養基中，過夜培養，次日將菌液以2%的量接種至250 mL氨芐抗性的LB液體培養基中振蕩培養，當培養至OD630 nm值達0.6～1.0時加入IPTG(終濃度為1 mmol·L-1)進行誘導表達，5 h后收集菌體。同時設立轉化pET-32a(+)空載體的工程菌為陰性對照。收集菌液后超聲裂解菌體，離心收集上清并用鎳柱親和層析純化。

1.7間接免疫熒光檢測蛋白黏附功能

PK-15細胞以2×105·孔-1接種于96孔細胞培養板，100 μL·孔-1，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，PBS(pH 7.4)洗滌1次，每次5 min(以下簡稱洗滌)；用DMEM細胞培養液將vlpA蛋白稀釋至0.5 mg·mL-1，100 μL·孔-1，37 ℃孵育2 h后洗滌3次；每孔加入100 μL冰乙醇4 ℃固定30 min，洗滌3次；每孔加入200 μL 1%BSA于4 ℃封閉過夜，洗滌4次；加入1∶10倍稀釋的兔抗vlpA高免血清，100 μL·孔-1，于37 ℃孵育1.5 h，洗滌4次；加入1∶50倍稀釋的FITC-羊抗兔IgG抗體，50 μL·孔-1，于37 ℃避光孵育1 h，洗滌5次，于熒光顯微鏡下觀察結果，以PBS和空載體蛋白質為對照。

1.8微孔板黏附試驗定量檢測蛋白質黏附能力

收獲細胞后用試劑盒(細胞膜蛋白質與細胞質蛋白質抽提試劑盒，碧云天公司)抽提細胞膜蛋白質。BCA法測定蛋白質濃度后，用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol·L-1；pH9.6)將蛋白質稀釋至10 μg·mL-1，100 μL·孔-1包被酶標板，4 ℃過夜，次日用PBST(pH 7.4)洗4次，每次5 min(以下簡稱洗滌)；每孔加入200 μL 含5%BSA的PBS于37 ℃封閉1.5 h，洗滌；將重組蛋白質或多肽偶聯物稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.125、1 μg·mL-1，每孔加入100 μL于37 ℃黏附1.5 h，洗滌；加入1∶2 000倍稀釋的兔抗硫氧還蛋白多抗或兔抗KLH多抗，100 μL·孔-1，于37 ℃孵育1 h，洗滌；加入1∶15 000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG抗體，100 μL·孔-1，于37 ℃孵育1 h，洗滌；每孔加入TMB顯色液100 μL，避光孵育5 min；每孔加入2 mol·L-1H2SO4終止液50 μL終止反應，于450～630 nm波長測定OD值，以PBS、空載體蛋白或KLH為對照。

1.9統計學分析

利用SPSS軟件對各組數據進行one-Way ANOVA分析，P<0.05判定為具有明顯統計學差異。

2　結　果

2.1重組 vlpA黏附宿主細胞

從豬鼻支原體基因組中成功擴增vlpA基因，構建重組質粒pET-32a(+)/vlpA，轉化大腸桿菌，PCR鑒定結果如圖2A所示，DNA測序結果正確。重組菌用IPTG誘導表達，SDS-PAGE檢測可見與空載體對照菌相比重組菌誘導后在34與43 ku之間出現一條明顯的表達條帶(圖2B，泳道2)。菌體超聲破碎后取上清和沉淀檢測發現目的蛋白質主要以可溶性形式表達，重組蛋白質經Ni-柱純化后，得到單一的目的蛋白質條帶(圖2B，泳道3)。

A.重組質粒pET-32a(+)/vlpA的PCR鑒定[M.DNA相對分子質量標準；1.陰性對照；2.pET-32a(+)/vlpA的PCR產物]；B.vlpA重組蛋白質的表達及純化[M.蛋白質相對分子質量標準；1.pET-32a(+)空載體對照菌誘導后；2.pET-32a(+)/vlpA重組菌誘導后；3.純化的vlpA重組蛋白]A.PCR identification of pET-32a(+)/vlpA[M.DNA molecular weight marker 1.Negative control；2.PCR product of pET-32a(+)/vlpA]；B.Expression and purification of the recombinant vlpA protein[M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+) after induction；2.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+)/vlpA after induction；3.Purified pET-32a(+)/vlpA protein]圖2　vlpA重組蛋白的構建、表達與純化Fig.2　Construction，expression and purification of recombinant vlpA protein

向培養有PK-15的細胞孔中加入vlpA蛋白共同孵育，用間接免疫熒光法檢測黏附情況，顯微鏡觀察，結果如圖3A所示，vlpA蛋白可黏附細胞板中培養的細胞，空載體對照蛋白質無明顯黏附。

用細胞膜蛋白質包被酶標板，加入不同質量濃度的vlpA蛋白，定量檢測vlpA的黏附功能，結果見圖3B。在3.125～100 μg·mL-1蛋白質量濃度區間，vlpA可黏附到PK-15細胞膜蛋白質上(P<0.01)，呈現劑量依賴性。

2.2vlpA黏附細胞功能區域初步鑒定

構建僅含有Ⅱ區結構的vlpA0重組蛋白質，克隆及蛋白質表達純化結果見圖4A泳道1，圖4B泳道2、3。用該重組蛋白鑒定Ⅱ區的黏附功能，微孔板黏附試驗結果見圖5A。結果顯示vlpA0可黏附PK-15細胞膜蛋白質(P<0.01)，在12.5～100 μg·mL-1蛋白質質量濃度區間呈現劑量依賴性。

化學合成含有2次重復的Ⅲ區重復片段的多肽，并與KLH偶聯，用微孔板黏附試驗檢測其黏附功能，結果顯示與未偶聯的KLH相比，Ⅲ區重復片段多肽-KLH沒有明顯的黏附功能(圖5B)。

A.vlpA重組蛋白黏附細胞能力間接免疫熒光檢測(a.vlpA；b.陰性對照；c.空載體蛋白質)；B.微孔板黏附試驗測定vlpA重組蛋白黏附PK-15細胞(與陰性對照相比，** 表示差異極顯著，P<0.01)A.The result of vlpA adhere to PK-15 cells (a.vlpA；b.Negative control；c.Blank vector protein control)；B.Identification of cytoadhesion function of recombinant vlpA protein by the microtiter plate adhesion test (compared with the negative control，** indicates statistical significance at P<0.01 level)圖3　vlpA重組蛋白黏附PK-15細胞檢測結果Fig.3　The adhesion of recombinant vlpA protein to PK-15 cells

A.重組質粒pET-32a(+)/vlpA(0、3、6、9、12)的PCR鑒定[M.DNA相對分子質量標準；1～5.pET-32a(+)/vlpA(0、3、6、9、12)的PCR產物]；B.vlpA(0、3、6、9、12)重組蛋白質的表達及純化[M.蛋白質相對分子質量標準；1.pET-32a(+)空載體對照菌誘導后；2、4、6、8、10.重組菌誘導后；3、5、7、9、11.純化的vlpA(0、3、6、9、12)重組蛋白質]A.PCR identification of recombinant plasmids pET-32a(+)/vlpA(0，3，6，9，12)[M.DNA molecular weight marker；1-5.PCR products of pET-32a(+)/vlpA(0，3，6，9，12) amplified by T7 promoter and T7 terminator primers]；B.Expression and purification of the recombinant vlpA (0，3，6，9，12) proteins[M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+) after induction；2，4，6，8，10.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+)/vlpA (0，3，6，9，12) after induction；3，5，7，9，11.Purified recombinant vlpA (0，3，6，9，12) proteins]圖4　Ⅲ區重復片段重復次數不等的系列vlpA重組蛋白質的構建、表達和純化Fig.4　Construction，expression and purification of recombinant vlpA proteins containing different repeats of repetitive unit in region Ⅲ

A.vlpA0重組蛋白黏附PK-15細胞；B.vlpAⅢ區重復片段多肽黏附PK-15細胞。與陰性對照相比，** 表示差異極顯著(P<0.01)A.The adhesion of recombinant vlpA0 protein to PK-15 cells；B.The adhesion of peptide of repetitive unit in region Ⅲ to PK-15 cells.Compared with PBS，** indicates statistical significance at P<0.01 level圖5　vlpA黏附功能區域鑒定Fig.5　Adhesion area identification of vlpA

2.3數目可變串聯重復區的重復次數對vlpA黏附能力的影響研究

設計構建Ⅲ區數目可變串聯重復區重復次數分別為3、6、9、12的系列重組vlpA蛋白，其鑒定與表達純化結果見圖4。利用微孔板黏附法對這四種蛋白的細胞黏附能力進行了檢測，并與不含Ⅲ區的vlpA0蛋白進行了比較，結果見圖6。在3.125～100 μg·mL-1蛋白質質量濃度區間，與空載體對照蛋白相比，四種vlpA重組蛋白均可明顯黏附PK-15細胞，呈現劑量依賴性；但這四種蛋白質的黏附能力均低于不含Ⅲ區的vlpA0蛋白，且隨著重復次數的增多，黏附能力下降。

與空載體對照蛋白組相比較，* 表示差異顯著(P<0.05)，** 表示差異極顯著(P<0.01)；與vlpA0蛋白組相比較，# 表示差異顯著(P<0.05)，## 表示差異極顯著(P<0.01)Compared with the group of blank vector protein control，* indicates statistical significance at P<0.05 level，** indicates statistical significance at P<0.01 level；Compared with the group of vlpA0，# indicates statistical significance at P<0.05 level，## indicates statistical significance at P<0.01 level圖6　Ⅲ區重復片段重復次數不等的系列vlpA重組蛋白黏附細胞檢測Fig.6　Cytoadhesion detection of recombinant vlpA proteins containing different repeats of repetitive unit in region Ⅲ

3　討　論

M.hyorhinis在豬場的臨床感染率極高，PCR檢出率可達50%～70%以上，并與多種人類腫瘤的發生有關，屬于人獸共患性病原。同時M.hyorhinis可污染各種體外培養細胞，研究發現其可黏附甚至侵入細胞內部。黏附是支原體感染的前提，而M.hyorhinis的黏附因子至今仍未有報道。在前期的研究中作者發現M.hyorhinis表面的vlp家族參與介導支原體對細胞的黏附。vlp家族共有7個成員，M.hyorhinis可以僅表達一種或者同時表達多種vlp成員。根據文獻中vlp家族表達情況的報道，vlpA是較為常見的表達成員之一，作者對vlpA的具體黏附能力進行了更加深入的研究。

vlpA的基因編碼區可分為三個部分，見圖1：Ⅰ區編碼30aa的高度同源的信號肽，末端為A/T-I-S-C四肽的前脂蛋白信號肽酶識別切割位點，前脂蛋白經酶切割產生由N端Cys殘基連接脂質基團的脂蛋白產物，其脂質基團嵌入細胞膜中，將vlp蛋白部錨定于細胞表面；Ⅱ區編碼的主要為不帶電荷的氨基酸，序列中有一定的重復性，在vlp各成員之間也呈現一定同源性，特別是包含一段8 aa的公共肽段；Ⅲ區為編碼重復肽段，由長12～13個氨基酸的肽段串聯重復構成，各個vlp的重復序列具有特異性，vlp重復序列基因的重復次數容易發生突變，導致vlp產物的大小發生變化[16]。

目前，牛支原體的表面可變脂蛋白(variable surface protein，vsp)已被證實為牛支原體的黏附因子。K.Sachse等證實了vsp參與牛支原體的細胞黏附過程，后來又進一步鑒定出了vsp重復肽段區中與黏附有關的黏附位點，同時發現這些重復區也是vsp主要抗原位點所在[19-21]。由此，試驗前作者推測vlpA的Ⅲ區重復片段中可能包含黏附位點。但從Ⅲ區重復片段多肽-KLH偶聯物對細胞的黏附試驗結果可以看出，2段重復的Ⅲ區重復片段不能黏附細胞。而從僅含Ⅱ區的vlpA0蛋白的黏附試驗結果可以看出Ⅱ區含有黏附位點。同時，通過對Ⅲ區不同重復次數的系列vlpA重組蛋白的黏附試驗結果比較，顯示重復次數越多對細胞的黏附能力下降。結合相關文獻報道，作者認為有兩種可能：第一，vlpA分子的Ⅱ區為黏附功能區，而Ⅲ區不具有黏附位點，Ⅲ區可在空間位阻上一定程度地遮蔽Ⅱ區的黏附位點，所以出現了Ⅲ區重復次數越多，對細胞的黏附能力下降的結果。同樣的現象也出現在肺支原體上，報道顯示當肺支原體上的表面可變脂蛋白基因編碼重復區串聯重復次數為35或40時，其黏附細胞能力要小于串聯重復次數為3、4或5時[22]。第二，Ⅲ區有可能也具有黏附能力，但需要更多的重復次數才能體現。如豬肺炎支原體的黏附因子P97的R1重復區重復次數必須大于8次才具有黏附能力，重復數目越多，黏附能力越強[23，24]。本試驗用于直接檢測Ⅲ區重復片段黏附能力的重復次數為2次，鑒定發現其不具有黏附能力，而后試驗利用不同重復次數的VlpA0、3、6、9、12進行比較，發現重復次數越多黏附能力下降，在此并沒有單獨鑒定Ⅲ區的重復能力，而是鑒定整個分子的黏附能力，可能受到Ⅱ區的影響。同時本試驗設計的Ⅲ區最大重復次數為12次，Ⅲ區重復12次以上才具有黏附細胞功能的可能性也不能完全排除。

本研究證實了vlpA參與介導M.hyorhinis黏附宿主細胞，鑒定發現vlpAⅡ區中含有明顯的黏附位點，并發現隨著Ⅲ區重復片段重復次數的增加，vlpA黏附細胞的能力明顯下降，該研究結果可有助于M.hyorhinis黏附因子的研究，也為進一步研究M.hyorhinis感染及免疫逃逸機制提供數據基礎。

[1]LIN J H，CHEN S P，YEH K S，et al.Mycoplasmahyorhinisin Taiwan：diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen[J].VetMicrobiol，2006，115(1-3)：111-116.

[2]MORITA T，FUKUDA H，AWAKURA T，et al.Demonstration ofMycoplasmahyorhinisas a possible primary pathogen for porcine otitis media[J].VetPathol，1995，32(2)：107-111.

[3]KIM B，LEE K，HAN K，et al.Development of in situ hybridization for the detection ofMycoplasmahyorhinisin formalin-fixed paraffin-embedded tissues from naturally infected pigs with polyserositis[J].JVetMedSic，2010，72(9)：1225-1227.

[4]JAYAGOPALA REDDY N R，WILKIE B N，BORGS P，et al.Cytokines inMycoplasmahyorhinis-induced arthritis in pigs bred selectively for high and low immune responses[J].InfectImmun，2000，68(3)：1150-1155.

[5]ZIN?CKER S，WANG M Y，GAUSTAD P，et al.Mycoplasma contamination revisited：mesenchymal stromal cells harboringMycoplasmahyorhinispotently inhibit lymphocyte proliferationinvitro[J].PLoSOne，2011，6(1)：e16005.

[6]YUAN S，QU L，SHOU C.N-Terminal polypeptide of annexin A2 decreases infection ofMycoplasmahyorhinisto gastric cancer cells[J].PLoSOne，2016，11(1)：e0147776.

[7]GEDYE C，CARDWELL T，DIMOPOULOS N，et al.Mycoplasma infection alters cancer stem cell propertiesinvitro[J].StemCellRev，2016，12(1)：156-161.

[8]GOMERSALL A C，PHAN H A，IACUONE S，et al.TheMycoplasmahyorhinisp37 protein rapidly induces genes in fibroblasts associated with inflammation and cancer[J].PLoSOne，2015，10(10)：e0140753.

[9]DUAN H，QU L，SHOU C.Mycoplasmahyorhinisinduces epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer cell MGC803 via TLR4-NF-κB signaling[J].CancerLett，2014，354(2)：447-454.

[10]YANG H，QU L，MA H，et al.Mycoplasmahyorhinisinfection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells[J].BMCGastroenterol，2010，10：132.

[11]NAMIKI K，GOODISON S，PORVASNIK S，et al.Persistent exposure to Mycoplasma induces malignant transformation of human prostate cells[J].PLoSOne，2009，4(9)：e6872.

[12]URBANEK C，GOODISON S，CHANG M，et al.Detection of antibodies directed atM.hyorhinisp37 in the serum of men with newly diagnosed prostate cancer[J].BMCCancer，2011，11：233.

[13]MARIOTTI E，GEMEI M，MIRABELLI P，et al.The percentage of CD133+ cells in human colorectal cancer cell lines is influenced byMycoplasmahyorhinisinfection[J].BMCCancer，2010，10：120.

[14]RAZIN S，YOGEV D，NAOT Y.Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas[J].MicrobiolMolBiolRev，1998，62(4)：1094-1156.

[15]TULMAN E R，LIAO X，SZCZEPANEK S M，et al.Extensive variation in surface lipoprotein gene content and genomic changes associated with virulence during evolution of a novel North American house finch epizootic strain ofMycoplasmagallisepticum[J].Microbiology，2012，158(Pt 8)：2073-2088.

[16]CITTI C，WATSON-MCKOWN R，DROESSE M，et al.Gene families encoding phase-and size-variable surface lipoproteins ofMycoplasmahyorhinis[J].JBacteriol，2000，182(5)：1356-1363.

[17]ROSENGARTEN R，THEISS P M，YOGEV D，et al.Antigenic variation inMycoplasmahyorhinis：increased repertoire of variable lipoproteins expanding surface diversity and structural complexity[J].InfectImmun，1993，61(5)：2224-2228.

[18]YOGEV D，ROSENGARTEN R，WATSON-MCKOWN R，et al.Molecular basis of Mycoplasma surface antigenic variation：a novel set of divergent genes undergo spontaneous mutation of periodic coding regions and 5’regulatory sequences[J].EMBOJ，1991，10(13)：4069-4079.

[19]SACHSE K，HELBIG J H，LYSNYANSKY I，et al.Epitope mapping of immunogenic and adhesive structures in repetitive domains ofMycoplasmabovisvariable surface lipoproteins[J].InfectImmun，2000，68(2)：680-687.

[20]THOMAS A，LEPRINCE P，DIZIER I，et al.Identification by two-dimensional electrophoresis of a new adhesin expressed by a low-passaged strain ofMycoplasmabovis[J].ResMicrobiol，2005，156(5-6)：713-718.

[21]LYSNYANSKY I，SACHSE K，ROSENBUSCH R，et al.The vsp locus ofMycoplasmabovis：gene organization and structural features[J].JBacteriol，1999，181(18)：5734-5741.

[22]BOLLAND J R，DYBVIG K.MycoplasmapulmonisVsa proteins and polysaccharide modulate adherence to pulmonary epithelial cells[J].FEMSMicrobiolLett，2012，331(1)：25-30.

[23]HSU T，MINION F C.Identification of the cilium binding epitope of theMycoplasmahyopneumoniaeP97 adhesin[J].InfectImmun，1998，66(10)：4762-4766.

[24]MINION F C，ADAMS C，HSU T.R1 region of P97 mediates adherence ofMycoplasmahyopneumoniaeto swine cilia[J].InfectImmun，2000，68(5)：3056-3060.

(編輯白永平)

The Function of the Variable Lipoprotein A ofMycoplasmahyorhinisin Adherence to Host Cell

ZHANG Bi-xiong1，2，XIONG Qi-yan1*，WANG Jia1，JI Yan1，NI Bo1，WEI Yan-na1，FENG Zhi-xin1，LIU Mao-jun1，SHAO Guo-qing1，3*

(1.InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，Nanjing210014，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030800，China；3.JiangsuCollaborativeInnovationCenterforMeatProduction，ProcessingandQualityControl，Nanjing210095，China)

Mycoplasmahyorhinis(M.hyorhinis) is a swine pathogen that can cause multiple chronic inflammation including polyserositis，pneumonia，arthritis and otitis media.It is also a potential pathogen for human beings，associated with various human cancers.In previous study，vlp family has been revealed to play a role in mediating cytoadhesion ofM.hyorhinis.Herein，we furtherly studied the cytoadhesion function of vlpA，one of the vlp family member，particularly how the repeat time of repetitive unit impact the function.According to the sequence published on GenBank，thevlpAgene was amplified from bacterial genome.Furthermore，vlpAgenes containing 0，3，6，9 and 12 times of repetitive unit in region Ⅲ were artificially synthesized.The genes were inserted into pET-32a(+) and expressed inEscherichiacoli.At the same time，a peptide containing 2 times of repetitive unit in region Ⅲ was artificially synthesized.All the recombinant proteins，as well as the peptide were detected for their adherence to PK-15 cell by using the indirect immunofluorescence assay and microtiter plate adherence assay.All the recombinant proteins have been successfully induced for expression and purified by affinity chromatography.Adherence of vlpA to PK-15 cell was observed by the indirect immunofluorescence assay.vlpA0 could bind PK-15 cell in the microtiter plate adherence assay，but not the peptide containing 2 times of repetitive unit in region Ⅲ.Furthermore，we detected the adherence of recombinant proteins vlpA3，vlpA6，vlpA9，vlpA12 containing 3，6，9 and 12 times of repetitive unit in region Ⅲ by using the microtiter plate adherence assay，the results showed that all of the four recombinant proteins could adhere to the cell，but the adherence was lower than the recombinant protein vlpA0.Additionally，as the repeat times increased，the adherence significantly decreased.The results of this study suggest that vlpA is one of the adhesion factors ofM.hyorhinis.The region Ⅱof VlpA contains cytoadhesion site.The adhesion ability of the whole molecule significantly decreased as the times of repetitive unit in region Ⅲ increased.The results of this study laid the foundation for further study on the pathogenic mechanism ofM.hyorhinis.

M.hyorhinis；variable lipoprotein vlpA；cytoadhesion；the number of repeat times

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.019

2016-04-01

國家自然科學基金項目(31300155)；江蘇省自然科學基金項目(BK20130702)

張必雄(1989-)，男，湖北天門人，碩士生，主要從事免疫化學與分子免疫學研究，E-mail：zhangbixiongadc@163.com

邵國青，研究員，Tel:025-84391973，E-mail:gqshaojaas@163.com；熊祺琰，副研究員，Tel:025-84390880，E-mail:qiyanxiongnj@163.com

S852.62

A

0366-6964(2016)09-1897-08