后期酰基轉移酶編碼基因lpxL對禽致病性大腸桿菌菌株E058致病性的影響

許慧卿，高　璐，穆曉惠，高清清，凌潔露，高　崧

(1.揚州大學旅游烹飪(食品科學)學院，揚州 225127；2.揚州大學獸醫學院，揚州 225009)

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后期酰基轉移酶編碼基因lpxL對禽致病性大腸桿菌菌株E058致病性的影響

許慧卿1*，高璐1，穆曉惠2，高清清2，凌潔露2，高崧2

(1.揚州大學旅游烹飪(食品科學)學院，揚州 225127；2.揚州大學獸醫學院，揚州 225009)

本研究旨在探討禽致病性大腸桿菌后期酰基轉移酶編碼基因lpxL對其細胞膜結構、生物學特性的影響，揭示大腸桿菌的致病機制。通過構建大腸桿菌lpxL基因突變株，比較其與野生株的結構、生物學特性及致病性的差異。結果顯示lpxL基因突變株的細胞表面結構較平滑，生長速度、內毒素含量與野生株相比明顯下降；相應的LPS刺激HD11細胞后，細胞產生的NO及細胞因子表達量也較野生株LPS處理組有不同程度的下降；感染試驗顯示突變株對SPF雞的臟器損傷明顯減弱。綜上所述，后期酰基轉移酶編碼基因lpxL對禽大腸桿菌的生物學特性及致病性十分重要。

后期酰基轉移酶；lpxL；禽致病性大腸桿菌；致病性

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)能引起禽類局部或全身性感染[1]。自1894年首次報道以來，大腸桿菌病成為危害養禽業的重要疾病之一，且無論是在發病動物還是在發病時間以及發病率和發病嚴重程度上，其上升趨勢越來越明顯[2]。禽大腸桿菌病給養禽業造成了嚴重的經濟損失，已成為危害最嚴重的細菌性傳染病之一。

致病性大腸桿菌相關毒力因子分為外毒素和內毒素兩大類。內毒素(或稱為脂多糖，lipopolysaccharide，LPS)是所有革蘭陰性細菌細胞壁外膜上的主要結構成分，對細菌生長和活力十分重要，且是革蘭陰性細菌的主要致病因子[3]。越來越多的研究表明：LPS分子中真正具有內毒素活性的基團是類脂A(Lipid A)，類脂A的結構與其致病能力密切相關[4]。目前已有一些團隊開始研究通過改變LPS結構來降低其毒性，從而構建減毒細菌疫苗或疫苗載體[5]。但是，有許多相反的結果值得我們思考，比如，Neisseriaspp.產生六酰的類脂A，但其入侵黏膜下免疫系統卻沒有引發任何的局部炎癥；某些非六酰基類脂A的致病菌能延長在巨噬細胞內的生存時間。因此，關于LPS與天然免疫的機制還有不清楚的地方。

大腸桿菌中類脂A的合成和轉運途徑是美國科學家C.R.H.Raetz等于2002年提出的，共有10步反應，涉及到幾十個基因，最后2 步是由后期酰基轉移酶LpxL和LpxM分別在兼性分子DSMP上加了月桂酸和肉豆蔻酸，從而形成完整的lipid A[6-8]。關于缺失后期酰基轉移酶LpxL后禽大腸桿菌致病性的變化目前尚無報道。作者通過構建禽高致病性大腸桿菌后期酰基轉移酶LpxL的編碼基因lpxL缺失突變株，研究其生物學特性及致病性，來探討酶LpxL對致病性的影響。

1　材料與方法

1.1材料

禽致病性大腸桿菌O2分離株E058由作者實驗室保存，TaqDNA聚合酶，T4 DNA 連接酶和DNA Ladder Mix marker購自Fermentas公司，RNAiso Plus，PrimeScript RT-PCR Kit和DNA Marker購自大連TaKaRa公司，DMEM細胞培養基和胎牛血清購自Gibco公司，其他試劑均為國藥產品(分析純)。

篩選用培養基中抗生素的質量濃度：氨芐青霉素為60 mg·L-1，氯霉素為170 mg·L-1。

1.2方法

1.2.1lpxL基因的擴增及克隆載體的構建根據GenBank公布的序列，設計擴增lpxL基因的特異性引物LLA/LLB(表1)，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

表1試驗所用PCR引物

Table 1PCR primers used in this study

名稱Name引物序列(5'-3')Primersquence(5'-3')長度/bpSize(bp)LLACTCTCTAGATGGTGCCATCATGATGCA27LLBCTCGAGCTCATTGTGCATCGCAACCTG27LLCCTCGAATTCCGGTCGAGCATCGATTTA27LLDCTCGATATCGCACCGGATCATGATTAC27LLECCAGTTTATAGGGGTGTC18LLFGGTTGTGTAACACTGGCA18CFEVCTCGATATCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCT27CRVICTCGAATTCATGGGAATTAGCCATGGTCC27IL-1AGCTCTACATGTCGTGTGTGATGAG24IL-1BTGTCGATGTCCCGCATGA18IL-6AAGGACGAGATGTGCAAGAAGTTC23IL-6BTTGGGCAGGTTGAGGTTGTT20IL-8ACTGCTCTGTCGCAAGGTAG19IL-8BTGAATGGATTTAGGGTGGAT20

用全菌裂解法進行細菌DNA模板的制備[9]，用普通PCR方法擴增lpxL基因，產物經0.7% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后用Agarose Gel DNA純化試劑盒純化回收DNA片段，-20 ℃保存。

1.2.2重組質粒pCRlpxLcat的構建將純化回收的lpxL基因片段與克隆載體pMD?18-T Simple Vector進行雙酶切連接，經測序鑒定正確的即為重組質粒pCRlpxL。以重組質粒pCRlpxL為模板，用引物LLC/LLD(表1)反向擴增；以pKD3質粒為模板，用引物CFEV/CRVI(表1)擴增氯霉素抗性基因。分別將上述片段雙酶切后用T4連接酶連接，鑒定正確的即為重組質粒pCRlpxLcat。

1.2.3E058株lpxL基因缺失突變株的構建按Q.Q.GAO等的方法[10]，用λ-Red重組系統構建E058株lpxL基因突變株。將質粒pKD46電轉入E058以表達重組酶，以重組質粒pCRlpxLcat為模板，用引物LLA/LLB(表1)擴增相應片段，然后將上述片段電轉入E058。挑取含氨芐青霉素和氯霉素雙重抗性的菌落，在42 ℃下去除pKD46，得到有氯霉素抗性的E058株lpxL基因缺失突變株，命名為E058ΔlpxL。1.2.4突變株表面結構的電鏡觀察將新鮮的細菌培養液離心，去上清，然后用PBS重懸，調整菌液至適當的濃度，制作超薄切片，用透射電鏡觀察[11]。1.2.5SDS-PAGE分析將所有待測菌株的新鮮培養物用PBS調節濃度至OD540 nm=1.0，取1 mL此菌液濃縮3倍，此時菌液的蛋白質質量濃度約為1 mg·L-1。SDS-PAGE按S.GAO等的方法進行[12]。

1.2.6細菌生長曲線的測定將待測菌株初始濃度調節OD600 nm=0.05，在30 ℃恒溫搖床中，以220 r·min-1搖振培養。連續4 h，每隔0.5 h測定培養物的OD600 nm值，并繪制細菌的生長曲線，比較野生株與突變株的生長速度。

1.2.7鱟變形細胞溶解物(LAL)試驗用鱟試劑通過終點顯色法測定待測菌株的內毒素含量[12]。

1.2.8脂多糖的提取采用熱酚法提取E058及其突變株E058ΔlpxL的LPS[12]。

1.2.9雞巨噬細胞HD11 NO含量測定采用Griess分析法[13]。吸取100 μL巨噬細胞HD11(分別用5 000 mg·L-1提取的LPS刺激)培養上清液，然后加入等體積的Griess試劑，室溫反應20 min，540 nm處測定吸光度。同時按試劑盒說明書要求繪制標準曲線，并進行計算。每份樣品重復3次，取數據平均值。

1.2.10巨噬細胞細胞因子測定將LPS刺激過的巨噬細胞HD11按說明書方法提取的RNA，并反轉錄成 cDNA，按試劑盒要求，對巨噬細胞細胞因子進行用相對定量法進行熒光定量分析。相對定量的結果采用2-ΔΔct方法[13]進行處理。

1.2.11組織病理學觀察取30只21日齡的SPF雞(山東家禽所SPF種蛋，自行孵化后于隔離器內飼養)，隨機分為2組，每組15只，分別于左胸氣囊接種0.1 mL的E058野生株(攻毒量為1×107CFU)和突變株(攻毒量為1×1011CFU)，24 h后每組隨機選3只剖殺，取心、肝、脾、肺和腎于13 %的中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋后制備5 μm厚的切片，用蘇木精和伊紅染色，用顯微鏡進行組織病理學觀察。

2　結　果

2.1突變株E058ΔlpxL的構建

根據GenBank公布的APEC O1的基因序列，分析啟動子和開放性閱讀框，結果顯示基因lpxL(htrB)擁有獨立的單個開放閱讀框，含有921 bp的堿基對。

圖1　lpxL在 E.coli E058基因組中的位置及突變的位點Fig.1　The location of gene lpxL and the location of deletion in lpxL replaced by a cat gene loci in E.coli E058 genome

按圖1所示得到重組質粒pCRlpxPcat，測序結果顯示，插入片段大小為1 676 bp，與預期相符。將篩選到的lpxL基因缺失突變株與野生株用LLE/LLF擴增后分別得到2 363和1 371 bp的單一條帶(圖2)，說明氯霉素抗性基因已插入lpxL閱讀框，即成功構建突變株E058ΔlpxL。

2.2突變株表面結構的電鏡觀察及脂多糖的SDS-PAGE鑒定

在透射電鏡下，野生株E058細胞表面遍布細小突起(圖3A)，而E058ΔlpxL表面相對光滑，幾乎看不到突起(圖3B)。

E058及其突變株的粗提脂多糖經SDS-PAGE電泳，銀染結果如圖3C所示。所有菌株的LPS均分布于17～26 ku。野生株E058的LPS為三條帶，且17 ku附近的條帶染色結果呈黑色；而E058ΔlpxL只剩下17 ku附近淺棕色條帶，其他兩個條帶均消失。

M.200 bp DNA相對分子質量標準；1.突變株和野生株lpxL擴增片段；A.突變株的lpxL基因片段；B.野生株lpxL基因片段M.200 bp DNA marker；1.The amplified fragment of gene lpxL by primer LLE/LLF；A.The lpxL fragment of E058ΔlpxL；B.The lpxL fragment of E058圖2　基因lpxL缺失突變株的鑒定Fig.2　Identification of E058 lpxL gene by PCR

A.野生株E058；B.突變株E058ΔlpxL；C.E058及其突變株E058ΔlpxL脂多糖的SDS-PAGE(1.E058的脂多糖；2.E058ΔlpxL的脂多糖)A.Morphous of E058；B.Morphous of E058ΔlpxL；C.SDS-PAGE of LPS from E058 and E058ΔlpxL (1.LPS of E058；2.LPS of E058ΔlpxL)圖3　E058及其突變株E058ΔlpxL電鏡觀察和SDS-PAGE分析Fig.3　Morphous of E058 and E058ΔlpxL by electron microscope and SDS-PAGE

2.3生長曲線及LAL試驗結果分析

LAL試驗結果顯示，當細菌濃度為OD600 nm=0.1時，E058ΔlpxL(5.59×103EU·mL-1)與野生株(6.02×103EU·mL-1)之間的內毒素含量差異顯著(P<0.05)。

圖4　大腸桿菌野生株E058和突變株E058ΔlpxL的生長曲線分析Fig.4　Growth curves of wild type strain E058 and mutant E058ΔlpxL

2.4一氧化氮與細胞因子產量分析

LPS刺激后導致NO產量的變化如圖5所示。對照組與試驗組產生的NO產量均隨著刺激時間的推移而不斷地增加。但與對照組相比，試驗組產生的NO量在6 h(P<0.05)和8 h(P<0.01)顯著減少。

LPS刺激細胞免疫系統后可以產生多種致炎性和抗炎性的細胞因子，這些炎性因子在炎癥反應過程中起著重要的作用。如圖5所示，LPS刺激HD11以后，HD11產生各種炎性細胞因子，包括IL-1β、IL-6和IL-8等白細胞介素。本研究結果顯示，試驗組及對照組的IL-1β和IL-6 mRNA轉錄量均在2 h左右達到最大，然后逐漸下降，但到達峰值時對照組的表達量顯著高于試驗組(P<0.01)。對照組的IL-8 mRNA轉錄量在1 h時上升，然后逐漸下降，但隨后又上升，到8 h時到達高峰，而試驗組從1 h以后IL-8轉錄量就逐漸下降。野生株E058來源的LPS刺激細胞產生炎性因子的能力顯著高于突變株E058ΔlpxL來源的LPS，其mRNA轉錄量在峰值時差異極顯著(P<0.01)。

A.NO含量；B.IL-1β轉錄量變化；C.IL-6轉錄量變化；D.IL-8轉錄量變化；DH11分別用E058和E058ΔlpxL來源的LPS刺激，*表示 P<0.05，**表示P<0.01A.Nitric oxide production；B.mRNA transcription of cytokines IL-1β；C.mRNA transcription of cytokines IL-6；D.mRNA transcription of cytokines IL-8.The DH11 cells were treated by LPS from E058 and E058ΔlpxL，respectively.Significant differences between mutant and parental strain are indicated with asterisks；*.P<0.05；**.P<0.01)圖5　LPS誘導HD11產生NO和白細胞介素量Fig.5　LPS-induced nitric oxide and interleukin productionin the HD11 cell line

2.5組織病理學觀察

對照組(E058感染)SPF雞出現明顯的心包膜增厚，肝部分有較厚的黃色纖維素膜包裹，且表面有散在的白色壞死點(圖6)，而試驗組(E085ΔlpxL感染)未發現明顯變化。

經試用，該導航能在選定導航路線的時候提示該路線上的天氣影響情況以及目的地的能見度、溫度、風速等。但功能比較簡單，缺少使用說明，信息的預報準確度有待驗證。

E058及其突變株對SPF雞各臟器的病理學損傷如圖7所示。E058感染組SPF雞出現中度心包炎，肝周炎，脾淋巴細胞變性、壞死，肺間質內可見少量異嗜性粒細胞浸潤，腎小管上皮細胞核發生濃縮、碎裂和溶解；而試驗組僅出現輕微的肝周炎。結果提示禽大腸桿菌E058的lpxL基因與其對SPF雞的致病力有關。

圖6　E058感染SPF雞后心(A)和肝(B)的病理變化Fig.6　Heart sections (A) and liver sections (B) pathological change from chickens infected with the virulent wild-type strain E058

圖7　E058及其突變株E058ΔlpxL感染SPF雞后各臟器病理損傷Fig.7　Organ sections from chickens infected via air sac inoculation with the virulent wild-type strain or the mutant E058ΔlpxL

3　討　論

作為高致病性的革蘭陰性菌，禽致病性大腸桿菌優勢血清型O2∶K1分離株E058外膜上的LPS對其致病性和感染能力具有重要的作用。其中，lipid A是LPS的疏水基團，同時也是細菌外膜外層的主要組成部分。對后期酰基轉移酶LpxM及糖基轉移酶WaaL等LPS合成相關酶的研究顯示，lipid A的完整性影響大腸桿菌的一系列生物學特性，如生長速度、內毒素含量、對某些疏水試劑的敏感性以及對宿主的致病性等[13-15]。然而關于后期酰基轉移酶LpxL對致病性的影響研究較少。

本研究結果顯示lpxL基因編碼的后期酰基轉移酶LpxL同樣影響大腸桿菌細胞表面結構，同時lpxL基因缺失突變株的一些生物學特性與野生株相比，也有顯著差異，提示與lpxM基因類似，lpxL基因同樣對大腸桿菌細胞膜結構的完整性，及與此相關的一系列生物學特性密切相關。

M.K.Vorachek-Warren等認為lpxL基因缺失會影響高溫下大腸桿菌在豐富培養基中的生長[14]。在本研究中，突變株E058ΔlpxL能在30 ℃ LB培養基中緩慢地生長。生長速度的變化和LAL試驗結果提示lpxL基因與革蘭陰性菌生物學特性及致病性密切相關，這與S.Gao等對莫拉菌的研究結果一致[12]，但LAL作用究竟是對lipid A的核心部位還是次級鏈，需要進一步研究。基因突變后生長速度與內毒素含量的變化也提示細菌中存在多種調控機制調節菌體的生命活動以適應不斷變化的外界環境。與無毒菌株或低毒菌株相比，一些高致病性的病原細菌，它們往往通過調節毒力基因的表達和毒力蛋白的作用來適應生存環境的變化。

單核巨噬細胞是天然免疫系統的主要效應細胞，它可以通過分泌多種細胞因子來調節機體對入侵病原體的炎癥反應[16]。LPS作為革蘭陰性菌細胞外膜的重要組成部分，在誘導天然免疫反應的過程中起著關鍵作用，其致病機制主要是LPS通過持續刺激機體單核巨噬細胞系統，被巨噬細胞的模式受體TLR4識別，使巨噬細胞產生大量的細胞因子、活性氧、溶酶體酶、NO等活性物質，引起細胞損傷和凋亡，最終導致失控性炎癥反應[17]。因此被LPS感染后機體死亡率較高。

類脂A是LPS的主要成分，研究表明類脂A的致病性及誘導產生的細胞因子種類和數量取決于受體對類脂A結構的識別[18-19]。E.V.Voloshina等研究發現，非六酰基的LPS不能被人類黏膜內皮細胞識別，因而含非六酰基LPS這類菌大多為非致病性的[20]。比如，鼠疫桿菌(Yersiniapestis)在跳蚤體內(21～27 ℃)合成含有6 個脂肪酸鏈的類脂A，而在人體內(37 ℃)卻合成含有4個脂肪酸鏈的類脂A。帶6個脂肪酸鏈的類脂A能夠通過TLR4激活人體的免疫系統，而帶4個脂肪酸鏈的類脂A卻不能[21]。最新研究顯示，lipid A后期酰基轉移酶的位置特異性決定了宿主細胞對相應LPS的識別及免疫反應[22]。本研究中，在對表面模式受體分子TLR4及一系列下游分子的活化過程中，由于E058ΔlpxL來源的類脂A酰基鏈的缺失使TLR4對其識別能力降低，導致下游一系列分子的活化程度在mRNA水平均低于野生株，最后導致部分白細胞介素及NO的產量也明顯降低。在哺乳動物中，這些白細胞外介素對于激活天然免疫反應和合成急性期蛋白是必需的，也是對LPS刺激所誘導的天然免疫反應所必需的[23]。本研究結果進一步證明了缺失了次級酰基鏈的禽致病性大腸桿菌LPS在刺激天然免疫能力上明顯弱于野生株的六酰基LPS。但也有研究發現，酰基鏈減少后，LPS對黏膜免疫免疫系統的刺激能力削弱了，不利于機體的免疫保護[24]。因此關于天然免疫系統如何辨別不同數量和不同來源的脂肪酸鏈以及對于非六酰基的LPS，宿主天然免疫系統的工作機制還有許多不清楚的地方。

涂健等究發現大腸桿菌內毒素可誘發雞多臟器損傷以及能引起肝TLR4表達水平變化[25]。LPS(0.1、1 μg·mL-1)可誘導豬小腸上皮細胞TLR4及其信號通路相關基因(CD14、MyD88，TNF-α、IL-Iβ和IFN-α)轉錄量上調[26]。作者研究發現，對于突變株E058ΔlpxL，基因lpxL的缺失導致類脂A次級酰基鏈的缺失，從而使突變株對宿主臟器損傷程度明顯下降，僅對肝有輕微的病理性損傷，這一結果提示lpxL基因缺失會導致突變株致病力的缺失，這種現象與沙門菌類似。次級酰基鏈缺失的沙門菌LPS對SPF雞的致病力也明顯下降[27]，且TLR4在不同組織中有不同的表達量，差異與所用的雞的品種有關[28-29]。這些結果提示脂質A的次級酰基鏈對APEC對動物的致病力有重要的作用，而類脂A結構的變化影響APEC的致病力。

4　結　論

禽致病性大腸桿菌后期酰基轉移酶編碼基因lpxL的缺失會導致大腸桿菌表面突起減少，生長速度減慢，內毒素含量顯著減少，一氧化氮、細胞因子的表達量明顯降低，致病性明顯減弱。這些結果說明lpxL基因對禽致病性大腸桿菌的生物學物性和致病性有明顯影響。

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[29]周作勇.雞Toll樣受體對Eimeriatenella的識別及信號通路研究[D].重慶：西南大學，2012.

ZHOU Z Y.Recognization of chicken toll like receptors onEimeriaTenellaand signaling pathway[D].Chongqing：Xinan University，2012.(in Chinese)

(編輯白永平)

Effect of thelpxLLipid A Biosynthesis Pathway Gene on Pathogenicity of Avian PathogenicEscherichiacoliStrain E058 to Chicken

XU Hui-qing1*，GAO Lu1，MU Xiao-hui2，GAO Qing-qing2，LING Jie-lu2，GAO Song2

(1.CollegeofTourismandCulinaryScinece(FoodScienceandEngineering)，YangzhouUniversity，Yangzhou225127，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

The contribution of the genelpxLto cell membrane structures and bionomics of avian pathogenicEscherichiacoli(APEC) was studied to reveal the pathogenic mechanism of APEC to avian.An isogeniclpxLmutant was constructed from APEC O2 strain E058,and then compared its structure，biological characteristics，and pathogenicity with E058.The results showed that compared with E058，thelpxLmutant had a smoother surface，slower growth rate and reduction of endotoxin.Nitric oxide production reduction and cytokine gene transcription downregulation also were observed in HD11 treated with mutant-derived LPS relative to that in cells treated with E058-derived LPS at different times.The histopathological lesions in visceral organs of birds challenged with the wild-type strain were more severe than in birds infected with the mutant.These results indicated that thelpxLgene is important for the pathogenicity and biological activity of APEC strain E058.

late acyltransferases；lpxL；avian pathogenicEscherichiacoli；pathogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.018

2016-03-22

國家自然科學基金(31101305)；江蘇省自然科學基金(BK2010319)

許慧卿(1972-)，江蘇太倉人，主要從事動物性食品安全研究，Tel：86-0514-87978133; E-mail:yzuxhq@126.com

許慧卿

S852.612

A

0366-6964(2016)09-1888-09