轉PRL基因小鼠遺傳性狀分析

任艷萍，謝亮亮，李海艷，石德順*，李湘萍*

(1.廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004； 2.遵義醫學院基礎醫學院，遵義 563003)

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轉PRL基因小鼠遺傳性狀分析

任艷萍1，2，謝亮亮1，李海艷1，石德順1*，李湘萍1*

(1.廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004； 2.遵義醫學院基礎醫學院，遵義 563003)

本研究以原核注射法生產的乳腺特異性表達PRL基因小鼠為模型，從外源基因遺傳完整性、拷貝數和插入位點3方面對其進行遺傳性狀分析，為今后大型轉基因動物的選育提供基礎。采用基因組DNA PCR方法篩選發生外源基因片段部分缺失的小鼠，并進行Southern blot驗證，以檢測外源基因的遺傳完整性；用絕對熒光定量PCR方法測定外源基因拷貝數，用Genome walking方法分析外源基因整合位點。結果顯示，外源基因片段部分缺失率為1.91%；整合十幾個拷貝外源基因的小鼠在便攜UV燈下可見綠色熒光，整合2個拷貝的小鼠無綠色熒光；在NW_001073945.1序列的2 025～2 026 bp和NW_001030574.1序列的10 760 020～10 760 021 bp處插入的外源基因可正常表達。以上結果說明，外源PRL基因在原核注射法生產的轉基因小鼠中可穩定遺傳；在一定范圍內，外源基因的表達量與拷貝數呈正相關；附近無其他基因的外源基因插入位點有利于外源基因的表達。

轉基因動物；遺傳性狀；原核注射；外源基因插入位點；拷貝數

轉基因動物技術在基礎生物學、醫學、發育生物學、藥物開發及繁殖育種等領域中應用較廣泛，常用的轉基因動物方法包括原核注射法[1]、體細胞核移植法[2]、精子載體法[3]、逆轉錄病毒感染法[4]等。原核注射法由于可導入大基因片段、無體細胞核移植中的重編程不徹底[5]、無精子載體法中重復性差[5]、亦無逆轉錄病毒感染法中存在病毒DNA序列整合等問題，其在轉基因動物，特別是轉基因小鼠生產中得到了廣泛的應用。

原核注射法所生產的轉基因動物，外源基因的整合位點存在隨機性，因此外源基因在轉基因動物體內是否表達以及表達水平的高低受遺傳完整性[6-8]、外源基因拷貝數[9-10]和外源基因插入位點[11]等諸多遺傳性狀的影響。因此，在轉基因動物后代的選育中，有必要對其遺傳性狀進行分析。但大型轉基因動物存在選育周期長，費用高等問題。為此，本研究以原核注射轉基因小鼠為模型，從外源基因遺傳完整性、外源基因拷貝數以及外源基因插入位點3方面，對已建立的乳腺特異性表達PRL基因小鼠模型的遺傳性狀進行了分析。為今后轉基因水牛等大型轉基因動物后代的選育奠定基礎。

1　材料與方法

1.1轉基因小鼠的擴繁

挑選經基因組DNA PCR鑒定的轉PRL基因小鼠，定為F0代。將F0代轉基因小鼠與野生型同種FVB小鼠雜交得到F1代，并在出生后3 d用便攜式長波UV燈觀測子代小鼠綠色熒光表達情況。

1.2轉基因小鼠PCR鑒定

將出生21 d的小鼠用4%苦味酸進行編號，用酚/酚仿/氯仿依次抽提法，提取小鼠尾尖組織的基因組DNA。分別以T-PRL和CMV 為引物擴增外源PRL基因和cmv啟動子；mACTB為引物擴增內參基因β-actin片段(表1)。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，35個循環；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。

表1轉基因小鼠檢測引物

Table 1Primers used in the transgenic mice detection

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence使用目的AimT-PRLF:ACCCCCGTCTGTCCCAATR:GATTTTGACATCGCTACAGAGT檢測PRL基因mACTBF:CATCCGTAAAGACCTCTATGCR:ACATCTGCTGGAAGGTGGAC檢測β-actin基因CMVF:GTTATCCCCTGATTCTGTGGR:ATAGACCTCCCACCGTACAC檢測cmv啟動子

1.3Southern blot分析

利用Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit對轉基因小鼠基因組DNA進行Southern blot鑒定。首先，用BamH I和KpnI酶切pPRL質粒，膠回收純化PRL片段，地高辛標記后作為探針貯存在-20 ℃備用。用BamH I酶切20 μL小鼠基因組DNA，乙醇沉淀后按試劑盒中所述步驟進行Southern blot操作。

1.4外源基因拷貝數分析

表2外源基因拷貝數分析引物

Table 2Primers used in detecting the copy number of exogenous gene

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence使用目的AimFabpiF:TGGACAGGACTGGACCTCTGCTTTCCTAGAR:TAGAGCTTTGCCACATCACAGGTCATTACG定量檢測Fabpi基因Q-PRLF:GCTGCCATACCTCCTCCR:GGTGACTAGGTGATACAGAGG定量檢測PRL基因

1.5外源基因整合位點分析

用Genome walking方法分析外源基因整合位點。首先在距轉基因載體5′端約500 bp處，由內向外依次設計3條退火溫度為65 ℃的下游引物(表3)。按照Genome walking試劑盒說明書步驟(圖1)，以小鼠基因組DNA作為模板，用cmvSp1、cmvSp2、cmvSp3引物與隨機引物進行3次曹氏PCR擴增并將擴增產物經膠回收純化后、TA克隆到pMD-18T載體中測序。所得序列先與轉基因載體行同源性比對，并將未對比上的序列與小鼠基因組序列進行Blast比對，以確定外源基因的整合位點。

圖1　Genome walking方法及引物示意圖Fig.1　Sketch map of Genome walking method and primers

表3外源基因整合位點分析引物

Table 3Primers used in Genome Walking analysis

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence使用目的AimcmvSp1CGTGAGTCAAACCGCTATCCcmv端引物cmvSp2ACCGCATCACCATGGTAATAGcmv端引物cmvSp3CCTATTGGCGTTACTATGGGAAcmv端引物

2　結　果

2.1外源基因在F1代轉基因小鼠中的遺傳完整性分析

將F0代轉PRL基因小鼠與野生型FVB小鼠雜交得到F1代小鼠。以野生型小鼠DNA為陰性對照，ddH2O為空白對照，基因組PCR分別擴增目的基因PRL以及標記基因啟動子cmv片段。結果顯示，2、3、4和5號樣品可擴增得到 752 bp的PRL片段；2、3、4、5和7號樣品可擴增得到599 bp的cmv片段(圖2A)。其中7號小鼠基因組外源PRL片段缺失，僅有cmv片段。為驗證PCR結果的準確性，以PRL基因為探針，通過Southern blot方法檢測這幾只小鼠。結果顯示，2、3、4和5號小鼠有外源PRL片段整合(圖2B)，與基因組PCR結果一致，表明基因組PCR的結果準確可信。對16窩共157只F1代小鼠基因組進行基因組PCR分析，共發現3只小鼠基因組中存在外源基因片段部分缺失，且缺失片段均為PRL，缺失發生率為1.91%(表4)。以上結果表明，外源基因在遺傳過程中有一定的概率發生片段缺失，但概率較低；多數情況下，外源基因可完整地遺傳給后代。

2.2轉PRL基因小鼠外源基因拷貝數分析

比對轉基因小鼠的熒光檢測結果與基因組PCR結果發現，部分攜帶外源基因的小鼠在便攜UV燈下無綠色熒光，推測這可能與外源基因的拷貝數有關。為此，選擇3只經鑒定攜帶外源基因的小鼠，UV燈下1號和2號有明顯的綠色熒光，3號無綠色熒光。采用絕對定量熒光PCR法分析外源PRL基因的整合數。分別對pPRL和pFabpi的標準品做回歸曲線，R2分別為0.995和0.998，擴增效率分別為105.154%和105.191%(圖3)，表明本次熒光定量PCR結果可信。定量分析結果顯示，1號和2號小鼠的外源基因拷貝數較高，分別為14.0和12.1個，3號小鼠的外源基因拷貝數較低，為1.9個拷貝(表5)。結果表明，外源基因的表達情況與外源基因拷貝數呈正相關。

A.基因組PCR結果；B.Southern blot結果；M1.DNA相對分子質量標準；M2.DNA相對分子質量標準；1、18.野生型小鼠；2、11.F1代1號小鼠；3、12.F1代2號小鼠；4、13.F1代3號小鼠；5、14.F1代4號小鼠；6、15.F1代5號小鼠；7、16：F1代6號小鼠；8、17：F1代7號小鼠；9.空白對照；10.陽性對照A.PCR results of the genome DNA；B.Results of Southern blot detection；M1.DNA Marker III；M2.1 kb DNA Ladder；1，18.The wild-type mouse；2，11.The mouse No.1 in the F1 generation；3，12.The mouse No.2 in the F1 generation；4，13.The mouse No.3 in the F1 generation；5，14.The mouse No.4 in the F1 generation；6，15.The mouse No.5 in the F1 generation；7，16.The mouse No.6 in the F1 generation；8，17.The mouse No.7 in the F1 generation；9.The blank control；10.The positive control圖2　外源基因遺傳穩定性分析Fig.2　The genetic stability analysis of exogenous gene

2.3轉PRL基因小鼠外源基因整合位點分析

選擇2只在便攜UV燈下有明顯綠色熒光的轉基因小鼠，以其基因組DNA為模板，用Genome walking法分析外源基因整合位點。電泳結果顯示，經過3次PCR，2個小鼠基因組均可擴增出一條2 000～3 000 bp的特異性片段(圖4A為1號小鼠，2號小鼠圖片未給出)。回收純化該片段(1號小鼠如圖4B，2號小鼠圖片未給出)并TA克隆到pMD-18T載體中，得到5 026～6 133 bp的pMD-18T-cmvSp3質粒(1號小鼠如圖4C，2號小鼠圖片未給出)。經測序，將得到的序列分別與轉基因載體5′端cmv序列進行比對，發現1號和2號小鼠的序列中有210 bp的cmv同源序列，同源率100%(1號小鼠如圖4D，2號小鼠的圖片未給出)。去除cmv同源序列，將剩余未知序列與小鼠基因組進行Blast對比，結果發現1號和2號小鼠分別與小鼠基因組中的NW_001073945.1和NW_001030574.1序列同源性較高，分別為99%和84%(1號小鼠如圖4E，2號小鼠的圖片未給出)。其中，NW_001073945.1序列全長2 464 bp，尚未定位到染色體中，未發現該段序列中存在基因編碼，外源基因于2 025～2 026 bp處反向插入；NW_001030574.1位于15號染色體中，外源基因于10 760 020～10 760 021 bp處反向插入，該位點上下游20 kb內無基因編碼。以上結果說明，這2只表達外源基因的轉基因小鼠，外源基因插入位點附近均無其他基因編碼。

表4外源基因部分片段缺失率

Table 4The losing rate of exogenous gene fragment

代數Generation窩數Nest總只數Number片段缺失只數Thenumberoflosingfragment缺失率/%ThelosingrateF16615731.91

表5外源基因整合數分析結果

Table 5The copy number of exogenous gene in transgenic mice genome

編號Number基因Gene平均Ct值TheCtaveragevalue拷貝數Thecopynumber整合數Theintegrationnumber1PRLFapbi16.61920.537221945115818514.02PRLFapbi17.45021.24712213289497112.13PRLFapbi19.32720.5113168741612181.9

圖3　外源基因整合數分析的標準曲線Fig.3　The standard curve for the copy number analysis of exogenous gene in transgenic mice genome

A.Genome walking PCR；B.第三次PCR產物膠回收；C.質粒pMD-18T-cmvSp3；D.同源性分析；E.NCBI Blast結果；M1.DNA相對分子質量標準；M2.DNA相對分子質量標準；1.cmvSp3引物PCR產物；2.cmvSp2引物PCR產物；3.cmvSp1引物PCR產物；4.cmvSp3片段；5.質粒pMD-18T-cmvSp3A.Genome walking PCR；B.The third PCR fragment after purification；C.The pMD-18T-cmvSp3 vector；D.Homology analysis；E.Blast analysis with mouse genome from NCBI；M1.DNA Marker III；M2.Supercoiled DNA Ladder Marker；1.The third PCR results with cmvSp3 primer；2.The second PCR results with cmvSp2 primer；3.The first PCR results with cmvSp1 primer；4.cmvSp3 fragment；5.pMD-18T-cmvSp3 vector圖4　外源基因整合位點分析結果Fig.4　The results of exogenous gene integration site in transgenic mice

3　討　論

原核注射法生產的轉基因動物中，外源基因隨機插入基因組[12]。與外源基因插入位點相對應的同源染色體上對應序列，在同源染色體配對時，插入位點附近可能發生重組或修復，出現外源基因片段全部或部分丟失的現象。A.R.Migliaccio等在細胞水平上研究發現，僅有少數幾個特定位點上的外源基因能夠穩定遺傳，絕大多數整合位點上的外源基因會在傳代過程中發生丟失[13]。在轉基因動物的研究中，外源基因可以穩定地遺傳給后代[6-7]。顏景斌等利用多對引物PCR檢測F0至F4代轉基因小鼠，未發現外源基因片段丟失[8]。B.Aigner等研究發現，即使拷貝數高達73的轉基因小鼠在與野生型小鼠雜交也未發現拷貝數丟失；但在插入位點不同轉基因小鼠間雜交時，高拷貝轉基因位點存在較低概率的拷貝數丟失的問題[14]。本研究對157只PRL轉基因小鼠進行了外源基因完整性分析，發現 1.91%的位于轉基因載體6.9 kb后的PRL片段缺失，表明外源基因在很大程度上可以穩定遺傳給后代，但也存在一定的丟失概率，其丟失率可能受外源基因長度的影響。

已有研究發現，外源基因表達情況受插入位點附近基因的干擾，即轉錄干擾[11]。當一定空間內存在兩個基因時，這兩個基因表達量均顯著低于僅有一個基因時的表達量[15]。轉錄干擾的強弱與兩個基因的轉錄方向有關，相向型高，背離型最弱，順勢串聯型居中[15]。本研究分析轉基因小鼠的外源基因插入位點時發現，有明顯綠色熒光蛋白表達的小鼠，其外源基因的插入位點附近上下20 kb無其他基因，不存在轉錄干擾問題，而本研究所驗證的這兩個基因插入位點NW_001073945.1序列的2 025～2 026 bp處和NW_001030574.1序列的10 760 020～10 760 021 bp處，可作為今后外源基因定點插入的候選插入位點。

外源基因表達水平除會受到其遺傳穩定性和插入位點的影響外，還受外源基因拷貝數的影響。原核注射法生產的轉基因動物，外源基因在同一個位點往往存在多個拷貝[16]。在一定范圍內，外源基因的表達水平與其拷貝數成正比[10]，但拷貝數過高時，外源基因的表達會被抑制甚至沉默。B.Aigner等發現轉基因小鼠中外源基因的拷貝數與基因表達量在一定程度內呈正相關[9]。D.Garrick等研究表明，高拷貝致使外源基因甲基化程度增加，基因表達水平下降[17]。本試驗用雙酶切對轉基因載體進行線性化，粘性末端不互補，所得轉基因小鼠外源基因的拷貝數為2～14個，未發現高拷貝數轉基因小鼠，外源標記基因的表達水平與拷貝數呈正相關，該結果與上述文獻報道結果一致。

4　結　論

綜上，本研究從外源基因的遺傳穩定性、插入位點和拷貝數3個方面分析了轉PRL基因小鼠的遺傳性狀。結果顯示，在遺傳穩定性上，存在較低的外源基因片段丟失率，在絕大多數情況下，外源基因可以穩定遺傳給后代；在外源基因插入位點上，附近無其他基因存在的外源基因插入位點有利于外源基因的正常表達，而本研究所驗證的兩個插入位點可作為今后外源基因定點插入的候選位點；在一定的拷貝數范圍內，外源標記基因的表達水平與拷貝數呈正相關，10個拷貝數以上的轉基因小鼠方可用便攜UV燈檢測綠色熒光蛋白的表達。以上結果可為今后大型轉基因動物的選育奠定基礎。

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(編輯郭云雁)

The Genetic Traits Analysis ofPRLTransgenic Mice

REN Yan-ping1，2，XIE Liang-liang1，LI Hai-yan1，SHI De-shun1*，LI Xiang-ping1*

(1.StateKeyLaboratoryofSubtropicalBioresourceConservationandUtilization，GuangxiUniversity，Nanning530004，China；2.SchoolofBasicMedicalSciences，ZunyiMedicalUniversity，Zunyi563003，China)

In order to provide the foundation for breeding large transgenic animals in futher，in this study，the genetic traits of mammary gland-specificPRLtransgenic mice produced by pronuclear microinjection，were analyzed from the genetic integrity，the copy number and the inserting site of exogenous gene.The transgenic mice deleted partially exogenous gene were screened by genomic DNA PCR method，and were verified by Southern blot to detect the genetic stability of exogenous gene.The copy number of exogenous gene in transgenic mice was detected by absolute real-time fluorescence quantitative PCR method.The inserting site of exogenous gene in transgenic mice was analyzed by Genome walking method.The results showed that the losing rate of exogenous gene fragment was 1.91%.The green fluorescence signal was observed under the long-wave UV lamp in the transgenic mice integrated higher copies of exogenous gene，while not observed in the transgenic mice integrated 2 copies of exogenous genes.The exogenous gene expressed normally in the 2 025-2 026 bp site of NW_001073945.1 gene and the 10 760 020-10 760 021 bp site of NW_001030574.1 gene.The result indicated that the exogenous gene could be inherited stablely in the transgenic mice produced by pronuclear microinjection，the expression level was positively correlated with the copy number of exogenous gene in certain range，and it was beneficial for the exogenous gene expression while there was no other genes nearby the inserting site.

transgenic animal；genetic traits；pronuclear microinjection；the inserting site of exogenous gene；copy number

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.015

2015-12-17

國家轉基因重大專項(2014ZX08007-001)；國家自然科學基金(31560632)；廣西自然科學基金項目(2014GXNSFAA118084)

任艷萍(1986-)，女，河南人，博士，主要從事胚胎工程研究，E-mail：ypren@foxmail.com

石德順，博士，研究員，主要從事胚胎工程研究，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn；李湘萍，博士，研究員，主要從事胚胎工程研究，E-mail：xiangpingli@163.com

S865.13

A

0366-6964(2016)09-1861-07