不同類型牛GPR54基因啟動子變異與其表達水平的關聯性

王學故，鄧丹妹，程　晉，王　揚，李　彤，陳宏權，2*

(1.安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036； 2.安徽畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，合肥230036)

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不同類型牛GPR54基因啟動子變異與其表達水平的關聯性

王學故1，鄧丹妹1，程晉1，王揚1，李彤1，陳宏權1，2*

(1.安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036； 2.安徽畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，合肥230036)

旨在研究不同類型牛GPR54基因啟動子的變異對其表達水平的影響，以揭示牛GPR54基因多態性與牛早熟性之間的關聯性。提取荷斯坦牛、皖東黃牛及江淮水牛3種牛血液白細胞總RNA，通過PCR、測序、RT-PCR和雙熒光素酶報告基因的方法，檢測不同牛GPR54基因啟動子區的多態性，啟動子效率以及GPR54基因的表達水平，分析啟動子變異在牛品種、年齡和性別間對GPR54基因表達的效應。結果表明，GPR54基因啟動子存在多個SNP位點，3種牛的啟動子型存在明顯的差異，其中荷斯坦牛GPR54基因啟動子效率是江淮水牛的4.44倍，是皖東黃牛的1.99倍，而皖東黃牛啟動子效率是江淮水牛的2.24倍。RT-PCR顯示，青年牛GPR54基因表達水平高于成年牛；荷斯坦牛高于皖東黃牛和水牛，水牛的GPR54表達水平最低；母牛的GPR54基因表達水平極顯著高于公牛(P<0.01)。綜上表明，不同牛的早熟性與GPR54啟動子存在密切的關聯性。

牛；早熟性；GPR54基因；啟動子效率

初情期(Puberty)是動物性器官發育成熟度的標志，其出現的早晚作為牛的一個重要性狀，與繁殖、生產壽命、經濟效益等密切相關[1]。研究證實，初情期是在GnRH神經網絡產生的促性腺激素脈沖分泌模式下啟動[2]，此后生殖器官和附屬性腺發育成熟，達到性成熟(Sexual maturatity)，此時機體生長發育等重要經濟性狀的發育已進入成熟階段，為其經濟利用奠定了基礎。不同類型牛的性成熟時間存在較大差異，生產性能千差萬別，很大程度上依賴于初情期的啟動與調控模式[1-2]。

KISS-1/GPR54系統在哺乳動物生殖內分泌的調節中起著中樞調控作用，其對青春期啟動意義引起研究者的高度關注[3-5]。研究表明，GPR54與kisspeptin結合，活化GnRH表達，打開下丘腦—垂體—性腺軸，啟動青春期發育[6]。GPR54是G蛋白偶連受體，包含7個跨膜的疏水結構域和N-端的3個糖基化作用位點，kisspeptin為其內源性配體[7-8]。GPR54基因的表達水平直接決定與Kisspeptin的結合，影響性成熟。GPR54基因表達受其啟動子的調控，研究表明，不同類型牛GPR54基因啟動子GPR54-973區域存在3個特異SNP位點，形成不同類型牛的啟動子基因型，如地方黃牛啟動子型為AATTCC、荷斯坦牛和西門塔爾牛的啟動子型為CCCCTT，以及地方水牛為CCTTCC[9]。但不同類型牛啟動子差異與GPR54基因表達水平的關聯性卻鮮有報道，有關不同類型牛GPR54基因表達水平及其規律的研究也不多見。本研究基于不同類型牛GPR54基因的啟動子變化，構建其表達載體，利用雙報告基因檢測和qPCR等方法，研究不同類型牛血液白細胞GPR54基因的表達水平以及啟動子效率，探討不同類型牛啟動子與GPR54基因表達的關聯性。

1　材料與方法

1.1試驗牛與樣品采集

依據不同類型牛GPR54-973啟動子基因型，采集中國地方皖東黃牛(16頭)和江淮水牛(7頭)、荷斯坦牛(15頭)血液樣品。采集試驗牛血液樣品8 mL(分裝2管，Trizol保護)和適量耳組織樣品，置于干冰保存，帶回實驗室。

1.2血液白細胞收集培養和總RNA提取

取3 mL抗凝血加入3倍體積的PBS緩沖液混勻，450 g離心15 min，棄上清，留下白細胞沉淀，再用1 mL PBS緩沖液沖洗1～2次。用含有10%胎牛血清的DEME Basic(Gibco)培養基重懸白細胞沉淀，轉移到25 cm2細胞培養瓶中，于37 ℃，5.0% CO2培養箱中培養。

取1 mL血樣加入3 mL紅細胞裂解液，4 ℃，450 g離心15 min，去除紅細胞，留下白細胞沉淀，利用RNA提取試劑盒(Biomega)提取牛血液白細胞RNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的品質，并用核酸蛋白測定儀測定其濃度及純度。

1.3白細胞GPR54基因表達量測定

利用反轉錄試劑盒(Qiagen公司)，合成cDNA，反應體系為20 μL。另取每頭牛的耳組織，用試劑盒(天根)提取耳組織DNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的品質。

根據牛GPR54 mRNA序列(GenBank登錄號：NC-007305)和牛的β-actinmRNA序列(GenBank登錄號：NM_173979.3)利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，由上海生工生物有限公司進行合成，PAGE純化。引物WXG-1擴增片段長度為222 bp，上游序列：5′-GGACGAAGAGGGTGGCAAT-3′，下游序列：5′-GGCAGATGACGAAGATGACC-3′；β-actin擴增片段長度167 bp，上游序列：5′-CCAACGTGTCTGTTGTGGAT-3′，下游序列：5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。使用Qiagen公司的SYBR Green PCR Kit 試劑盒進行定量試驗，20 μL反應體系：2×SYBR Green PCR Master 10 μL，QN ROX reference dye 2 μL，cDNA 1 μL，引物(F+R) 2.8 μL，RNase-free water 4.2 μL。熒光定量反應條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個循環，每個樣品重復4次。

1.4啟動子區擴增與SNP檢測

用WXG-2引物(上游序列：5′-GGCAGGCAGATTCCTAACCACTAG-3′，下游序列：5′-TCAACCTTCCCAAGACTCTGATGC-3′)擴增GPR54基因的啟動子區(GPR54-973)，PCR反應體系：ddH2O 34 μL，dNTPs 4 μL，10×Easy Taq Buffer 5 μL，Taq1 μL，WXG-2(上下游)共4 μL，DNA 2 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min，35個循環(95 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存產物。對PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠，緩沖液為1×TBE電泳檢測。PCR產物送華大生物有限公司進行測序，并分析其SNPs。

1.5啟動子雙熒光素酶報告基因分析

1.5.1重組質粒的構建與鑒定根據牛5′啟動子區序列(GenBank登錄號：GU289736.1)，用WXG-3引物克隆下含有酶切位點的牛5′啟動子區片段，與空白質粒連接，同時對陽性重組質粒測序，鑒定重組質粒。WXG-3引物序列：上游：5′-CGA-CGCGTGGCAGGCAGATTCCTAACCACTAG-3′，下游：5′-GCCTCGAGATTGCCACCCTCTTCGT-CCTGA-3′。

1.5.2重組質粒轉染細胞及雙熒光素酶檢測用FuGENE?6 Transfection Reagent(Promega)轉染試劑將鑒定正確的重組質粒導入293T細胞內，在培養24～48 h，用Dual-Glo?Luciferase Assay System(Promega)試劑檢測雙熒光素酶活性。

1.6數據處理

通過ABIStepOneTMSoftware V2.2 軟件以及SPSS 17.0軟件對定量結果和雙熒光素酶報告基因檢測數據進行差異分析，同時利用最小二乘法建立GPR54基因表達量與性別、年齡和種屬(品種)的線性建模：Yijkl=μ+Bi+Aj+Sk+eijkl。其中Y為表達水平RQ值，μ為群體平均值，Bi為牛的類型效應值，Aj為牛年齡的效應值，Sk代表牛性別的效應值，eijkl為誤差。統計分析不同牛的啟動子效率與GPR54基因的關聯性。

2　結　果

2.1不同類型牛GPR54基因啟動子變異

預測3種牛GPR54基因啟動子，結果發現在CDS上游973 bp片段(記為GPR54-973)中存在2個啟動子區域Promoter 1和Promoter 2，其中皖東黃牛和荷斯坦牛的2個啟動子區域均分別位于-888～-638 bp和-379～-130 bp，江淮水牛分別位于-885～-636 bp和-379～-130 bp；不同類型牛Promoter 1之間存在多處核苷酸差異，而Promoter 2中僅江淮水牛發生1處核苷酸替換。如果連接變異點作為基因型的話，則(小寫字母位于啟動子區域，帶下劃線的核苷酸是皖東黃牛樣本群體內SNP位點，帶*號為缺失)：皖東黃牛基因型為AATTtgccgacggcgCTGACTTCGTcGACAA，荷斯坦牛基因型為ACTTcgccgatagcgCTGACTTCGTcGACAA，江淮水牛基因型為CC**ta*ttgctaaaA**TGGGACCaAGGGC。

比較牛群內部的多態性發現，皖東黃牛GPR54-973片段存在3個多態性位點，檢測出3種基因型CCCCTT、AATTCC和ACTCCT，分別位于-946、-816和-754 bp，荷斯坦牛(CCCCTT)和江淮水牛(CCTTCC)均為純合子。結果顯示皖東黃牛GPR54含有西門塔爾牛的遺傳背景。

2.2不同類型牛啟動子的啟動效率分析

根據檢測出的基因型，利用皖東黃牛的3種基因型的SNP位點進行雙熒光素酶檢測，其結果如表1。CCT基因組合啟動效率是ATC組合的3倍，是ATC/CCT型的1.39倍。雜合型的啟動子表現為中間效應。該項啟動子效率的測定與牛白細胞GPR54基因表達RQ值一致。

表1 皖東黃牛不同SNP型啟動子對熒光素酶的啟動效率

Table 1The efficiency of the promoters with different SNP genotypes to the luciferase expression in Wandong cattle

SNP-type報告基因Reportergene熒光值(螢火蟲/海腎)Fluorescencevalue(firefly/seakidney)相對ATC型/%RelativetoATCtype基因型Genotype白細胞GPR54基因表達RQ值ExpressionlevelofGPR54geneinleukocytes(RQvalue)ATC1.58±0.16C100.00AATTCC0.59±0.05CCCT4.74±0.08A300.00CCCCTT2.18±0.17AATC/CCT3.42±0.07B216.46CACTTC1.30±0.14B

A、B、C表示組間差異極顯著

A，B and C showed that the differences between SNP-types were very significant(P<0.01)

檢測3種類型牛GPR54基因啟動子的雙熒光素酶檢測結果見表2。表2表明，3種牛啟動子的啟動效率存在著極顯著的差異，其中荷斯坦牛GPR54基因啟動子效率是江淮水牛的4.44倍，是皖東黃牛的1.99倍；皖東黃牛啟動子效率是江淮水牛的2.24倍。

表2不同類型牛GPR54基因啟動子效率比較

Table 2Efficiency comparison ofGPR54 gene promoters to the luciferase expression in different types of bovines

GPR54-973熒光值(螢火蟲/海腎)1Fluorescencevalue(firefly/seakidney)相對江淮水牛/%RelativetoJianghuaibuffalo荷斯坦牛Holstein6.54±0.79A444.90皖東黃牛2Wandongcattle3.29±1.18B223.81江淮水牛Jianghuaibuffalo1.47±0.10C100.00

1.字母A、B、C表示組間差異極顯著；2.混合啟動子型

1.A，B and C showed that the differences between types of bovines were very significant(P<0.01)；2.Mixed promoter types

2.3不同類型牛白細胞GPR54基因的表達水平

利用線性模式分析荷斯坦牛、皖東黃牛和江淮水牛血液白細胞GPR54基因的表達水平，結果見圖1。所有牛GPR54基因表達的群體RQ均值為1.48，荷斯坦牛、皖東黃牛和江淮水牛的遺傳效應分別為0.70、0.17和-0.87。荷斯坦牛和皖東黃牛的GPR54基因的表達水平分別是江淮水牛的4.34和2.25倍(P<0.01，圖1A)，表明不同類型牛啟動子差異對GPR54基因的表達具有顯著的影響，并且與所發現的3個SNP位點存在明顯的關聯性。

年齡和性別對GPR54基因的表達水平也具有明顯的影響。<24月齡和>24月齡年齡效應分別為0.39和-0.39；<24月齡牛表達水平比>24月齡牛高出90.84%(P<0.01，圖1B)，顯示年輕牛GPR54基因表達水平較年長牛高。公牛和母牛的效應分別為-0.28和0.28；在不同性別牛間，母牛的表達水平是公牛的3.75倍(P<0.01，圖1C)。

**.P<0.01圖1　不同類型牛血液白細胞GPR54基因表達水平Fig.1　Changes of GPR54 gene expression in the blood leukocytes of different types of bovines

3　討　論

牛的早熟性是一個重要生產性狀，通過其初情期早晚來體現。初情期受到營養、年齡和遺傳因素的影響，其中遺傳因素決定著早熟性的一系列激素調控過程[1]，環境因素的改變可能會影響初情期正常來臨的具體時間，但這種生理變化只是性狀變異的一種環境組分。早熟性是不同類型牛種質特性的重要組成部分，不同類型牛通過進化形成了特定的早熟性，其中乳牛早于肉牛，水牛較晚[10]，基于比較基因組學研究早熟性的物種間差異對探明性狀形成的原因具有重要意義。已經證實青春期啟動在物種間存在相同的機制，包括KISS1、GPR54、GnRH1和GnRHR等在內的多種激素及受體是青春期啟動的關鍵基因[11]，其中GPR54的激活能觸發GnRH的釋放[12]。有關相同的啟動機制在不同類型牛間產生青春期早晚差異問題，有研究證實與GPR54啟動子多態性有關[13-14]。

GPR54基因多態性在動物中廣泛存在，豬[15]和羊[16-17]等具有幾乎與牛相同的啟動子多態位點，這種多態性已經由選擇的作用加以固定，成為物種的一個特性。如本研究GPR54啟動子3個SNP位點分別在荷斯坦牛(CCCCTT)和江淮水牛(CCTTCC)表現為純合型，而皖東黃牛存在3種基因型可能與其形成過程混雜地方純種黃牛(AATTCC)和西門塔爾牛(CCCCTT)[14]血緣有關。調控試驗證實，荷斯坦牛GPR54啟動子型增加GPR54表達的效率最高，本地黃牛次之，水牛最低，顯示在超越牛種屬間早熟性差異仍然與GPR54基因的多態性密切相關。

本研究的結果同時也揭示GPR54的調控作用不僅僅發生在牛的初情期，與后期性狀的發育存在很大的關聯性。在小鼠、大鼠、猴和豬等多種動物的研究中，GPR54基因在下丘腦中的表達量在初情期是明顯增加的，且體內注射Kisspeptin能促進LH的分泌[18-19]；小尾寒羊母羊發情期其下丘腦GPR54基因表達量顯著高于發情周期的其他階段[20]。這表明GPR54的表達在生長發育的不同階段雖然存在差異，但對促進GnRH、FSH和LH的釋放[21]仍然具有重要意義。在本研究結果中，牛血液白細胞中GPR54基因表達水平與年齡和性別存在顯著關聯性，其中，2歲以下牛顯著高于2歲以上牛，母牛高于公牛。

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(編輯 程金華)

The Relationship between the Expression Variations ofGPR54 Gene and the Polymorphisms ofGPR54 Promoters in Different Types of Bovines

WANG Xue-gu1，DENG Dan-mei1，CHENG Jin1，WANG Yang1，LI Tong1，CHEN Hong-quan1，2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China；2.KeyLaboratoryofAnhuiLocalLivestockandPoultryGeneticResourcesConservationandBiobreedingofAnhuiProvince，Hefei230036，China)

The aim of the study is to investigate the impact of the variations ofGPR54 promoter on the expression levels ofGPR54 gene in Holstein (HT)，Wandong cattle (WD) and Jianghuai buffalo (JH)，therefore further unveil the association between the polymorphisms ofGPR54 gene promoter and the sexual precocity.Total RNAs in leukocytes of HT，WD and JH were extracted and the polymorphism of the promoter region were detected by PCR and sequencing.Furthermore，the efficiency of the promoters were determined via RT-PCR and luciferase expression from the fusion reporter gene.Various SNPs were detected in the promoter regions ofGPR54 genes in HT，WD and JH with significant difference.Moreover，it was shown that the promoter efficiency of HT was 4.44 times and 1.99 times higher compared to JH buffalo and WD respectively.Meanwhile the promoter efficiency of WD was 2.24 times higher than JH.Notably，the RT-PCR results showed thatGPR54 gene expression levels in youngsters were dramatically higher than that of the adults especially in HT than in WD and JH.JH showed the weakest expression level ofGPR54 while the cows exhibited the strongestGPR54 expression level compared to ox (P<0.01).These results indicated that the polymorphisms ofGPR54 promoter and the bovine sexual precocity were evidently correlated.

bovine；sexual precocity；GPR54 gene；promoter efficiency

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.010

2016-03-07

國家自然科學基金項目(31272402)

王學故(1991-)，男，安徽利辛人，碩士生，主要從事動物分子遺傳育種研究，E-mail：1055069260@qq.com

陳宏權，教授，博導，主要從事動物分子遺傳育種研究，E-mail：chqchq@ahau.edu.cn

S823.2

A

0366-6964(2016)09-1824-06