Wortmannin對(duì)糖尿病大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9表達(dá)的影響

梁英杰,周德鵬,曹東華

(1.遼河油田總醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 盤錦124010;2.中國(guó)人民解放軍第二○二醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 沈陽(yáng)110003)

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Wortmannin對(duì)糖尿病大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9表達(dá)的影響

梁英杰1,周德鵬1,曹東華2

(1.遼河油田總醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 盤錦124010;2.中國(guó)人民解放軍第二○二醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 沈陽(yáng)110003)

目的研究Wortmannin對(duì)糖尿病大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9表達(dá)的影響。方法60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(20)、糖尿病組(20) 和Wortmannin處理組(20)，通過(guò)高糖、高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。糖尿病模型建立后，檢測(cè)血糖、血脂及體重的改變；采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測(cè)各組大鼠肺組織中Caspase-3與Caspase-9表達(dá)的變化情況。結(jié)果與對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血糖、血脂值明顯增高，P<0.01；與糖尿病模型組比較，Wortmannin處理組大鼠血糖、血脂值明顯降低，P<0.01。免疫組織化學(xué)和Western blot 結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，P<0.01；而與糖尿病模型組比較，Wortmannin處理組大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9的表達(dá)量均顯著降低。結(jié)論P(yáng)I3K/Akt信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-3與Caspase-9的表達(dá)參與糖尿病肺組織病變的發(fā)生發(fā)展。

糖尿??；肺；磷脂酰肌醇3激酶；Caspase-3；Caspase-9；大鼠

(ChinJLabDiagn,2016,20:1428)

隨著社會(huì)的進(jìn)步,人們生活水平的提高以及生活方式的改變，2型糖尿病的發(fā)病率快速增高,正嚴(yán)重地危害著人類的健康。2型糖尿病是一種嚴(yán)重的慢性疾病，其病因及機(jī)制非常復(fù)雜。糖尿病對(duì)人類的危害不僅是機(jī)體內(nèi)環(huán)境中血糖濃度的升高，更重要的是對(duì)機(jī)體各個(gè)臟器的損害，引發(fā)諸多并發(fā)癥，包括感染、視網(wǎng)膜病變、心腦血管硬化、神經(jīng)傳導(dǎo)延緩以及腎臟功能改變[1-3]。糖尿病肺病(Diabetes lung disease，DLD) 是糖尿病的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病晚期死亡的一個(gè)重要原因[4]。因此，延緩糖尿病肺病的病理進(jìn)程，對(duì)改善預(yù)后、降低死亡率有重要的臨床意義。本研究通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路被阻斷后，DM大鼠肺組織中Caspase-3與Caspase-9表達(dá)的變化情況，探討糖尿病肺損傷的可能發(fā)生機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

羊抗大鼠Caspase-3和 Caspase-9多克隆抗體(Santa-Cruz)，鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，血糖試劑盒(上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司)，Sure Step Plus血糖檢測(cè)儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)。全自動(dòng)血液生化分析儀(意大利愛康公司)，凝膠成相系統(tǒng)(Gel DocTM，美國(guó)Bio-Rad 公司)。

1.2動(dòng)物分組及模型的建立

60只健康雄性SD 大鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，250-300 g，隨機(jī)分為對(duì)照組(20)使用普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病組(20)和Wortmannin處理組(20)高脂飼料喂養(yǎng)76 d后，空腹12 h后，糖尿病組腹腔注射STZ(30 mg/kg)，對(duì)照組注射枸櫞酸緩沖液。72 h后尾靜脈取血測(cè)定血糖，將血糖濃度≥10.0 mmol/L大鼠定為糖尿病造模成功，糖尿病模型建立后,每周監(jiān)測(cè)血糖1次,不符合標(biāo)準(zhǔn)者棄去。糖尿病模型建立次日起，Wortmannin處理組靜脈注射Wortmannin(0.5 mg/kg),1次/周,共12 W，第12周禁食12-14 h測(cè)定血糖后,麻醉處死大鼠，取材。

1.3血糖血脂測(cè)定

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，采集血樣，利用SureStep Plus 血糖檢測(cè)儀測(cè)定血糖，全自動(dòng)血液生化分析儀測(cè)定血脂。

1.4免疫組織化學(xué)方法測(cè)定Caspase-3和Caspase-9表達(dá)

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，麻醉處死大鼠，開胸，剪開右心耳，生理鹽水沖洗，然后多聚甲醛灌流固定，取肺組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再移入30%蔗糖溶液中脫水至沉底，石蠟包埋，常規(guī)切片，按照SP試劑盒說(shuō)明測(cè)定Caspase-3和 Caspase-9表達(dá)。

1.5Western blot方法檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，麻醉處死大鼠，冰上開胸，取肺組織，超聲粉碎，離心取上清，以BCA法測(cè)定樣品蛋白含量，計(jì)算上樣量，樣品經(jīng)沸水浴變性后，上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)印，雜交，暗室內(nèi)ECL發(fā)光，X光片顯影、定影，凝膠圖像分析儀采集分析圖像光密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果

2.1大鼠的一般情況及血糖、血脂測(cè)定結(jié)果

糖尿病組大鼠在注射STZ后，呈明顯多飲、多食、多尿癥狀，明顯消瘦，并伴不同程度精神萎靡，毛豎而無(wú)光澤；而對(duì)照組大鼠精神狀況良好，體重明顯增加，毛皮有光澤。正常對(duì)照組大鼠空腹血糖濃度為(5.06±0.92) mmol/L，顯著低于糖尿病組大鼠(18.17±4.98) mmol/L，P<0.01，與糖尿病組大鼠相比，Wortmannin處理組大鼠空腹血糖濃度(10.21±2.57) mmol/L顯著降低，P<0.01。正常對(duì)照組大鼠血脂濃度為(1.52±0.27) mmol/L，顯著低于糖尿病組大鼠(2.37±0.36) mmol/L，P<0.01；與糖尿病組大鼠相比，Wortmannin處理組大鼠空腹血脂濃度(1.91±0.27) mmol/L顯著降低，P<0.01。

2.2免疫組織化學(xué)方法測(cè)定Caspase-3和Caspase-9表達(dá)結(jié)果

對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3和Caspase-9僅有微量表達(dá)，顯著低于糖尿病組與Wortmannin處理組，P<0.01；而與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)顯著降低，P<0.01，見圖1，表1。

2.3Western blot方法測(cè)定Caspase-3和 Caspase-9表達(dá)結(jié)果

對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，糖尿病組與Wortmannin處理組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3與Caspase-9蛋白的表達(dá)量均顯著升高，P<0.01；而與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠肺組織凋亡因子Caspase-3和 Caspase-9的表達(dá)顯著降低，P<0.01，見圖2，表2。

A:對(duì)照組; B:糖尿病組; C:Wortmannin處理組圖1　免疫組化法檢測(cè)Caspase-3 和Caspase-9表達(dá)表1　Caspase-3 和 Caspase-9平均光密度值 (MOD)比較

nCaspase-3Caspase-9對(duì)照組100.18±0.030.19±0.03糖尿病組100.52±0.15*0.43±0.11*Wortmannin處理組100.31±0.090.27±0.09

*與對(duì)照組或Wortmannin處理組比較,P<0.01

A:對(duì)照組;B:糖尿病組;C:Wortmannin處理組圖2　Western blot方法測(cè)定Caspase-3和 Caspase-9表達(dá)表2　Caspase-3 和 Caspase-9平均光密度 值(MOD)比較

nCaspase-3Caspase-9對(duì)照組100.33±0.060.24±0.04糖尿病組100.85±0.16*0.51±0.13*Wortmannin處理組100.55±0.120.36±0.11

*與對(duì)照組或 Wortmannin 處理組比較,P<0.01

3　討論

糖尿病(DM)是一種危害人類健康的慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并且對(duì)心、腦、腎有顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn)，肺臟也是DM 損傷靶器官之一，DM本身可導(dǎo)致肺臟損害，可發(fā)展為慢性肺功能障礙，可以出現(xiàn)限制性通氣功能障礙和彌散、阻塞性及混合性通氣功能障礙，損傷機(jī)制可能與高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、PKC 信號(hào)傳導(dǎo)通路增強(qiáng)等有關(guān)[5,6]，但是其具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指生物體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞在一定發(fā)育階段由基因控制的、自主的、有序的死亡過(guò)程，它對(duì)于自身穩(wěn)定的維持、組織的進(jìn)化、器官的發(fā)育等起著重要的作用。細(xì)胞凋亡機(jī)制主要有外源性和內(nèi)源性途徑兩種，外源性途徑需要先形成凋亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)，然后最終激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡；內(nèi)源性途徑也需要先形成凋亡活化復(fù)合體，然后激活Caspase-9 及下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，2 型糖尿病大鼠肺組織中Caspase-3和Caspase-9表達(dá)增高，羅格列酮可通過(guò)調(diào)節(jié)肺組織中Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)抑制肺組織細(xì)胞凋亡，延緩糖尿病肺病變的進(jìn)展[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠肺組織Caspase-3與Caspase-9蛋白的表達(dá)顯著升高，P<0.01，這與先前的研究一致，結(jié)果提示，Caspase-3與Caspase-9很可能在糖尿病肺部損害中發(fā)揮作用。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)通路是真核細(xì)胞關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞凋亡、代謝、增殖及分化等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要功能,研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠模型的腎皮質(zhì)中PI3K及Akt活性升高[11]，大鼠糖尿病發(fā)病4周后整個(gè)腎臟的磷酸化PKB/Akt水平增加，并且體內(nèi)由Gas6腎臟因子介導(dǎo)的腎小球肥大與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[12]。本研究組前期研究已經(jīng)證明，糖尿病模型組大鼠肺組織PI3K、Akt和p-Akt的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了糖尿病肺組織病變的發(fā)生發(fā)展，但是其具體的作用機(jī)制尚不清楚，其是否能夠調(diào)節(jié)炎癥因子Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)都需進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，在注射PI3K抑制劑Wortmannin阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，采用免疫組織化學(xué)和Western 方法檢測(cè)DM大鼠肺組織中Caspase-3與Caspase-9表達(dá)的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠肺組織炎性因子Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)顯著降低，P<0.01，結(jié)果提示，Caspase-3與Caspase-9可能參與了PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的糖尿病肺組織病變的病理機(jī)制。血糖、血脂測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與糖尿病組相比，Wortmannin處理組大鼠血糖、血脂濃度顯著降低，P<0.01，說(shuō)明阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，能夠改善血糖、血脂狀況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的發(fā)現(xiàn)有利于闡明PI3K/Akt信號(hào)通路參與糖尿病肺損傷的作用機(jī)制，能夠?yàn)樘悄虿》螕p傷的藥物治療提供一定參考依據(jù)。

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The effect of Wortmanninon on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in in lung tissue of diabetic rats

LIANGYing-jie,ZHOUDe-peng,CAODong-hua.

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theGenerarHospitalofLiaoheOilfield,Panjin124010,China)

ObjectiveTo study the effect of Wortmanninon on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in lung tissue of diabetic rats.Methods60 rats were divided into control group(20) diabetes mellitus group(20),and Wortmannin treatment group(20).The diabetic rat models were established by giving high glucose,highfat diet combined with peritoneal injection with low-dose streptozotocin(STZ).The changes of blood glucose,blood lipids and body weight were measured after the establishment of the model of diabetes,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were observed by immunohistochemical method and western blot method in lungs of rats in all groups.ResultsCompared with the control group,serum glucose,lipid values were significantly higher in rats of diabetes mellitus group,P<0.01.Compared with the diabetes mellitus group,serum glucose,lipid values were significantly lower in rats of Wortmannin treatment group,P<0.01.Compared with control group,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were increased significantly in lung tissue of rats in diabetes mellitus group,P<0.01.Compared with the diabetes mellitus group,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were decreased significantly in lung tissue of rats in Wortmannin treatment group.ConclusionPI3K/Akt signal pathway might be related to lung tissue pathological changes of dibtetic rats by regulating the expressions of Caspase-3 and Caspase-9.

diabetes mellitus;lung;PI3K;Caspase-3;Caspase-9;rat

遼寧省教育廳科研基金項(xiàng)目(2010687)

1007-4287(2016)09-1428-04

R282.71R587.2

A

2015-10-12)