家族遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的基因型分析

彭新國,于永春,成佳景,劉永云,陳　明,崔艷芳*

(1.濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州256603；2.上海第十人民醫院)

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家族遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的基因型分析

彭新國1,于永春2,成佳景2,劉永云1,陳明1,崔艷芳1*

(1.濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州256603；2.上海第十人民醫院)

遺傳性無纖維蛋白原血癥(inheritdafibrinogenemia)是一種纖維蛋白原基因缺陷引起的常染色體隱性遺傳疾病，患者表現為纖維蛋白原完全缺乏，發病率大約為百萬分之一。與血友病相比，遺傳性無纖維蛋白原患者黏膜出血較嚴重，但肌肉和骨骼的出血不如血友病常見[1]。第一例異常纖維蛋白原血癥基因突變發現于1968年[2]，目前國內外共發現了約400多例遺傳性異常纖維蛋白原血癥。

纖維蛋白原(fibrinogen,Fg;凝血因子Ⅰ,FⅠ)是一種由2964個氨基酸組成的大分子糖蛋白，以Aα、Bβ、γ三條多肽鏈為組分，由二硫鍵構成對稱的六聚體結構 (Aα、Bβ、γ)2[3]。三條多肽鏈分別由3個獨立基因FGA、FGB、FGG編碼，集中于4q28-4q31約50kb的區域內，從著絲粒到端粒有序的排列[4]。

1　對象和方法

1.1回顧性收集一個遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的臨床資料，根據家系成員實驗室檢查結果繪制遺傳圖。如圖1所示此家系患者無明顯出血癥狀、無血栓病史。

家系內成員進行編號：先證者編號為S4，先證者的祖母、父親、母親、兒子分別編號為S1、S2、S3、S5。正常對照組編號以隨機數字表法編號，依次編號為N1、N2、N3-N30。

1.2提取家系成員及對照組外周血約2ml，進行凝血分析。采用promega試劑盒提取外周血DNA和RNA,并對其純度及濃度進行檢測。設計并合成FGA、FGB、FGG基因所有外顯子及側翼序列的引物，PCR反應體系為20ml，以FGA第一外顯子為例，反應條件為：94℃，預變性，30min，94℃，變性，30s，60℃，退火，30s，72℃，延伸，50s，72℃，充分延伸，5min，29個循環，擴增先證者及對照組三個基因的所有外顯子及側翼序列，PCR產物純化后用BeckmanCoulter公司CEQTMGeneticAnalysisSystem基因分析系統測序，測序結果與Genebank中的基因序列比對，部分測序結果如圖3。對幾個有疑問的錯義突變位點利用BeckmanCoulter公司的GenomeLabGeXP系統采用引物延伸法進行基因型分析。

2　結果

先證者纖維蛋白原基因FGA、FGB和FGG的所有外顯子及側翼序列均測通，對測序結果進行分析，沒有發現堿基的插入或缺失。外顯子區共發現7個單核苷酸突變位點，其中4個錯義突變、2個同義突變、一個位于非編碼區；內含子區先證者發現1個SNP位點，正常對照也表現為同樣的堿基突變。經分析，外顯子區的3個錯義突變位點為可疑致病突變位點。這三個位點分別為FGGexon8c.902位點、FGAexon1c.16位點和FGBexon8c.1433位點。通過單堿基引物延伸，本次實驗選取正常對照30人，在FGGexon8c.902位點上，正常對照組均為純合子(G/G)，而家系中患者均為該突變位點的雜合子(G/A)，驗證了FGG基因第8外顯子上的突變是引起家系成員患遺傳性異常纖維蛋白原血癥的致病突變位點。見下圖1-4。

由圖可見，患者FGG基因cDNA第902位堿基發生了G→A雜合突變，所編碼的氨基酸由原來的精氨酸(Arg)變成了組氨酸(His)，即R275H突變。

圖4中前后兩峰為marker,分別在13堿基和88堿基的位置。Marker之間的峰，為目的峰，從左到右依次為FGG第8外顯子上的堿基突變位點(c.902)、FGA第一外顯子上的堿基突變位點(c.16)和FGB第8外顯子上的堿基突變位點(c.1433)。正常對照(N1)這三個位點均為純合子，堿基分別為G、A、G。

圖1　家系遺傳圖譜(箭頭所示為先證者S4)

圖2　FGA、FGB、FGG基因大部分外顯子56℃PCR擴增產物電泳圖

圖3　FGG基因第8外顯子及其側翼序列PCR產物測序結果

3　討論

通過單堿基延伸法對有疑問的幾個突變位點與對照組進行比較，發現在FGGexon8c.902位點，對照組全部為純合子G；在FGAexon1c.16和FGBexon8c.1433位點，對照組表現出G/A多態性?？梢缘贸鼋Y論：FGG基因第八外顯子c.902G>A雜合性堿基置換，導致Arg275His雜合錯義突變，是引起該家系遺傳性異常纖維蛋白原血癥的原因之一，而FGAexon1c.16和FGBexon8c.1433是人類基因多態性位點。方怡等發現FGG基因第8外顯子的g.5678G>A雜合堿基置換,而致Arg275His的錯義突變是家族性異常纖維蛋白原血癥的原因之一[5]。另外趙曉娟等也發現對1個遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系成員位于纖維蛋白原FGA基因上的2號外顯子g1233→a雜合堿基改變，導致Arg16His錯義突變[6]。

圖4　正常對照(N1)三個SNP位點的堿基

本研究家系患者無明顯的臨床出血癥狀、無血栓病史。分析原因，可能此家系的纖維蛋白原活性雖然低，但是血管壁、血小板等的功能正常，起到代償作用。γ鏈275位氨基酸Arg275His雜合錯義突變是引起此家系遺傳性異常纖維蛋白原血癥的原因，此氨基酸位點上的錯義突變，臨床表現差異大，ReinCM報道了一個γR275C雜合錯義突變的病例，患者表現出嚴重的出血癥狀[7]。

遺傳性異常纖維蛋白原血癥(inheritddisfibrinogenemia)是常染色體顯性遺傳性疾病，具有很高的外顯率，絕大多數是雜合子，約40%無癥狀。江明華等對8例遺傳性異常纖維蛋白原血癥先證者分析，發現了p.BβAsn190Ser、p.AαArg35His和p.γArg301His，3個突變所致，提示p.BβAsn190Ser和p.γArg301His可能是國人的熱點突變[8]。本實驗所研究的遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系，四代4個成員均為遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者，符合常染色體顯性遺傳的特點

遺傳性疾病對人類健康的危害很大，若能發現患病家系的遺傳特點，并在基因水平進行診斷和預防，則能提高出生人口的的質量。產前診斷是預防出生缺陷、降低缺陷兒出生的有效措施之一。由于目前對遺傳性纖維蛋白原血癥無有效的治療手段。

所以，進行產前診斷的目的就是杜絕純合子胎兒的出生，減少或預防雜合子胎兒的出生。如能從孕婦體內檢測到胎兒的DNA，就可實現無創產前診斷，使從基因水平診斷遺傳性纖維蛋白原疾病成為可能。1997年，Lo等首次發現了孕婦血中存在胎兒游離DNA，為無創性產前診斷奠定了基礎[9]。Neerman-Arbez等已運用STR位點連鎖分析及直接測序的方法進行了首例遺傳性無纖維蛋白原血癥家系的產前診斷，產前診斷的廣泛開展及基因治療的積極探索將為解決Fg基因缺陷打下堅實的基礎[10]。

[1]LakM,KeihaniM,ElahiF,etal.Bleedingandthrombosisin55patientswithinheritedafibrinogenaemia[J].BrJHaematol,1999,107(1):204.

[2]Blomb?ckM,Blomb?ckB,MammenEF,etal.FibrinogenDetroit-amoleculardefectintheN-terminaldisulphideknotofhumanfibrinogen[J].Nature,1968,218(5137):134.

[3]MosessonMW,SiebenlistKR,MehDA.Thestructureandbiologicalfeaturesoffibrinogenandfibrin[J].AnnNYAcadSci,2001,936:11.

[4]KantJA,FornaceAJJr,SaxeD,etal.Evolutionandorganizationofthefibrinogenlocusonchromosome4:geneduplicationaccompaniedbytranspositionandinversion[J].ProcNatlAcadSciUSA,1985,82(8):2344.

[5]FangYi，WangXue-feng，FuQi-hua，etal.InheriteddysfibrinogenemiacausedbyArg275Hisintheγchainoffibrinogen[J].ChineseJournalofMedicalGenetics,2005,22(2):1003.

[6]趙小娟，王兆鉞，江明華，等.纖維蛋白原α鏈Arg16His突變導致遺傳性異常纖維蛋白原血癥[J].中華血液學雜志，2010,31(3):253.

[7]ReinCM,AndersonBL,BallardMM,etal.SeverebleedinginawomanheterozygousforthefibrinogengammaR275Cmutation[J].BloodCoagulFibrinolysis，2010，21(5):494.

[8]江明華，王曉歐，舒曠怡，等.八個遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的臨床和基因突變分析[J].中華醫學遺傳學雜志，2014,31(2):1003.

[9]LoYMD,CorbettaN,ChamberlainPF,etal.PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum[J].Lancet,1997,78(5):350.

[10]Neerman-ArbezM,VuD,Abu-LibdehB,etal.PrenataldiagnosisforcongenitalafibrinogenemiacausedbyanovelnonsensemutationintheFGBgeneinaPalestinianfamily[J].Blood,2003,101(9):3492.

濱州市科技發展計劃項目(2013ZC1717)，濱州醫學院科技計劃項目(BY2011KZ08，BY2013KJ28)

1007-4287(2016)09-1589-03

2015-12-24)