人參皂苷Rb1對糖氧剝奪所致SH-SY5Y細胞凋亡的影響及機制研究

高　麗，興芝博，陸　斌，劉　磊,欒永昕*

(1.吉林大學第一醫院 a.門診部;b.神經外科,吉林 長春130021；2.延邊大學醫學部2013級)

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人參皂苷Rb1對糖氧剝奪所致SH-SY5Y細胞凋亡的影響及機制研究

高麗1a，興芝博2，陸斌1b，劉磊1b,欒永昕1b*

(1.吉林大學第一醫院 a.門診部;b.神經外科,吉林 長春130021；2.延邊大學醫學部2013級)

目的為了探討人參皂甙Rb1(GRb1)對糖氧剝奪(OGD)所致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用及GRb1的保護作用機制。方法采用體外培養SH-SY5Y細胞，應用MTT法、TUNEL染色、流式細胞儀、Western Blotting等方法檢測GRb1對糖氧剝奪所致SH-SY5Y細胞凋亡的抑制作用。結果GRb1預處理能增強OGD損傷細胞的生存能力，抑制OGD誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。進一步研究顯示GRb1能抑制由OGD線粒體膜電位的降低和線粒體內細胞色素C(cyct C)的釋放。結論研究表明GRb1對OGD誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用與其對線粒體功能的保護有關。

人參皂苷Rb1;糖氧剝奪;線粒體;細胞色素c

(ChinJLabDiagn,2016,20:1425)

缺血性中風是導致中老年人致死和致殘的主要原因之一。缺血再灌注是導致遲發性神經元損傷或死亡的主要因素。細胞凋亡在各種病理因素引起的神經元細胞凋亡中起重要作用，而抗凋亡可以減輕缺血再灌注引起的神經元細胞損傷。越來越多的證據表明，線粒體是調節細胞凋亡的一個重要的細胞器。在應激條件下，線粒體膜電位去極化，釋放線粒體內細胞色素C(cyct C)進而啟動了內源性凋亡信號通路[1]。

人參皂苷有抗感染、抗凋亡、誘導神經性能改變等生物學功能，而GRb1可以抑制心、肝、腦細胞缺血再灌注損傷[2-4]。因此，GRb1可能是治療缺血再灌注引起腦損傷的潛在藥物。盡管動物實驗表明GRb1能減緩局部缺血再灌注引起的神經元細胞凋亡，但它對線粒體功能的影響依舊不清楚。在本研究中，我們采用SH-SY5Y細胞的OGD模型模擬體內神經元缺血再灌注性損傷，探討GRb1對SH-SY5Y細胞線粒體的保護作用。

1　材料與方法

1.1試劑

GRb1購自國家藥品和生物制品檢測所，cyct C、細胞色素氧化酶IV(COX IV)單克隆抗體、山羊抗兔IgG和馬抗小鼠IgG購自Cell Signaling公司，ECL購自Amersham公司，PVDF膜購自Millipore公司，DMEM培養基購自Gibco公司。其它試劑均購自Sigma公司。

1.2細胞培養、糖氧剝奪及分組

人SH-SY5Y細胞從中國科學院上海細胞生物學研究所獲得。將制備好的SH-SY5Y細胞隨機分為以下幾組：對照組(正常SH-SYSY細胞常氧培養27 h)，OGD組(細胞糖氧剝奪3 h，然后常氧培養24 h)，OGD+GRb1組(分別用1.0 μmol/ L，10 μmol/ L和100 μmol/ L的GRb1與SH-SY5Y細胞共孵育30 min，糖氧剝奪3 h，然后常氧培養24 h)。

1.3細胞存活實驗

用酶標儀測定光吸收值。細胞存活力的變化用各組的光吸收值與正常培養細胞的光吸收值的比值來表示。

1.4TUNEL染色檢測細胞凋亡

通過計數帶綠色熒光的細胞與帶紅色熒光的細胞來定量細胞凋亡變化，并表示為TUNEL陽性細胞與總細胞的比率。

1.5細胞內ROS水平測試

用DCFH-DA評價細胞內ROS的平均水平，其用任意單位/mg蛋白質表示，作為對照。

1.6線粒體膜電位檢測

用流式細胞儀檢測羅丹明123細胞的熒光強度。

1.7差速離心

所收集的細胞經差速離心后將沉淀用裂解液溶解后使用蛋白質測定試劑盒檢測各組分的蛋白質含量。

1.8凝膠電泳和Western印跡

等量蛋白經電泳、轉膜等過程，用柯達影像分析軟件分析光密度。

1.9統計學分析

采用SPSS統計軟件進行分析，所有數據表示為平均值±標準差，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1GRb1降低OGD引起的細胞凋亡

圖1示，SH-SY5Y細胞存活力在OGD再復氧后24 h下降到68.5%±5.2%。但是，用1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的GRb1處理，其存活能力分別上升到82.1%±5.8%(與OGD組相比，P<0.01)，87.3%±6.3%(與OGD組相比,P<0.01)，但100 μmol/L的GRb1對細胞存活沒有保護作用。結果表明，1.0-10.0 μmol/L的GRb1對SH-SY5Y細胞存活是有保護作用的，而100 μmol/L的GRb1是沒有保護作用。因此1.0-10.0 μmol/L的GRb1被用于后面的實驗來研究GRb1對OGD引起的細胞凋亡的保護作用。

2.2GRb1抑制OGD引起的細胞凋亡

TUNEL染色評估細胞凋亡。圖2示，OGD組TUNEL染色(綠色)陽性細胞百分率是28.8%±7.1%，顯著高于對照組7.8%±1.9%，而當用1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的GRb1預處理時其上升的百分率分別減少到20.9%±3.8%(與OGD組相比P<0.05)，12.4%±4.1%(與OGD組相比P<0.01)，因此，TUNEL染色結果表明GRb1可抑制OGD誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。

2.3GRb1維持線粒體膜電位

線粒體功能障礙是以線粒體膜的去極化為特征。圖3示：OGD使SH-SY5Y細胞膜電位從90.41%降到75.96%。用1.0 μmol/L或10.0 μmol/L的GRb1處理可以抑制線粒體膜電位的下降，并分別維持在81.84%和87.58%，這說明GRb1可以減緩OGD誘導的線粒體膜電位下降。該結果表明GRb1可以保護OGD造成的線粒體損傷。

圖1　MTT法檢測細胞活力

圖2　TUNEL染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡

圖3　流式細胞儀測量線粒體膜電位

2.4GRb1抑制cyct C的釋放

線粒體內的cyct C在啟動內在的細胞凋亡途徑中起重要作用。因此，我們通過差速離心分離亞細胞線粒體和細胞漿，并通過Western Blottting檢測線粒體內和細胞內cyct C的含量變化。圖4示：同對照組相比較，OGD后線粒體中cyct C水平顯著降低，但是細胞漿內的cyct C顯著升高。而用1.0 μmol/L或10.0 μmol/L GRb1處理后則抑制了由OGD引起的cyct C的變化，GRb1降低線粒體內cyct C釋放，并且減緩其在細胞質內的增加，10.0 μmol/L效果較1.0 μmol/L更顯著。該結果提示了GRb1具有抑制線粒體損傷的作用。

圖4　Western印跡分析

3　討論

本研究表明無論是較低濃度(1.0 μmol/L)或是較高濃度(10.0 μmol/L)的GRb1都通過抑制細胞凋亡而顯著地減少OGD誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，而且我們發現，GRb1的抗凋亡作用與其降低線粒體膜電位、防止cyct C從線粒體釋放等保護線粒體功能有關。這些結果表明GRb1對OGD誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的抑制作用是通過穩定線粒體功能來完成的。

OGD誘導的SH-SY5Y細胞凋亡常被用來模仿由腦缺血再灌注引起的神經元細胞凋亡[5]。預防或抑制細胞凋亡已成為保護神經元細胞的一種策略。GRb1通過多種途徑在細胞凋亡過程中起保護作用[2]。線粒體是公認的介導細胞凋亡至關重要的細胞器。越來越多的證據表明穩定線粒體可以發揮其神經元細胞凋亡的保護作用。Liang等人報道對由缺血再灌注引起的大腦損傷可以通過穩定線粒體功能進行缺血性后處理保護[6]。Jiang等人用帕金森病大鼠模型研究神經元細胞凋亡過程中雷帕毒素的保護作用，發現這與穩定線粒體功能有關[7]。諸實驗均表明穩定線粒體功能是減少神經元細胞凋亡的一種途徑。

線粒體不僅是細胞內活性氧的主要來源，而且也是活性氧攻擊目標。活性氧的攻擊可導致線粒體膜電位的衰減，膜電位是反映線粒體功能的指示器。因此，在本研究中我們檢測SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的變化。我們發現用GRb1預處理能顯著將線粒體膜電位維持在一個較高的水平。Kong等人證明了GRb1通過抑制線粒體通透性轉換孔開放，防止新生大鼠氯化鈷誘導的心肌細胞凋亡[8]。我們的結論和先前的研究均表明GRb1對細胞凋亡的抑制作用與其保護線粒體功能有關。

cyct C從線粒體釋放反映出線粒體功能障礙。在本研究中，我們證實GRb1可以有效地抑制cyct C由線粒體釋放。該結果與缺血模型中抗氧化劑可以抑制凋亡誘導因子和cyct C的釋放一致[9]。抑制cyct C的釋放表明GRb1預處理可以保護線粒體功能并抑制胱天蛋白酶依賴和胱天蛋白酶非依賴途徑的激活。Hashimoto等人證明GRb1通過刺激雌激素受體與ERK1/2，Akt的后續活化和抑制SAPK/ JNK，p38蛋白的活性減弱MPP+(1-甲基1-4-苯基吡啶)誘導的PC12細胞凋亡。因此，這些先前的研究都表明，GRb1可以通過多種途徑發揮抗凋亡作用

在本研究中，我們證明GRb1通過調節線粒體功能，包括維持線粒體膜電位、抑制凋亡誘導因子向細胞核移位和cyct C向細胞質移位、提高線粒體內抗凋亡蛋白Bcl-2水平和降低促凋亡蛋白 Bax水平來抑制細胞凋亡。這些可能有助于我們理解GRb1抗凋亡作用的機制。

[1]Jordan J,de Groot PW,Galindo MF.Mitochondria:the headquarters in ischemia-induced neuronal death[J].Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2011,11(2):98.

[2]Wu Y,Xia ZY,Dou J，et al.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Mol Biol Rep，2011,38(7):4327.

[3]Guo Y,Yang T,Lu J，et al.Rb1 postconditioning attenuates liver warm ischemia-reperfusion injury through ROS-NO-HIF pathway[J].Life Sci，2011,88(13-14):598.

[4]Lim JH,Wen TC,Matsuda S，et al.Protection of ischemic hippocampal neurons by ginsenoside Rb1,a main ingredient of ginseng root[J].Neurosci Res，1997,28(3):191.

[5]Marutani E,Kosugi S,Tokuda K，et al.A novel hydrogen sulfide-releasing N-methyl-D-aspartate receptor antagonist prevents ischemic neuronal death[J].J Biol Chem，2012,287(38):32124.

[6]Liang JM,Xu HY,Zhang XJ，et al.Role of mitochondrial function in the protective effects of ischaemic postconditioning on ischaemia/reperfusion cerebral damage[J].J Int Med Res，2013,41(3):618.

[7]Jiang J,Jiang J,Zuo Y，et al.Rapamycin protects the mitochondria against oxidative stress and apoptosis in a rat model of Parkinson's disease[J].Int J Mol Med，2013,31(4):825.

[8]Kim GS,Jung JE,Narasimhan P，et al.Release of mitochondrial apoptogenic factors and cell death are mediated by CK2 and NADPH oxidase[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(4):720.

[9]James D,Parone PA,Terradillos O，et al.Mechanisms of mitochondrial outer membrane permeabilization[J].Novartis Found Symp,2007,287:170.

Ginsenoside Rb1 attenuates oxygen-glucose deprivation-induced apoptosis in SH-SY5Y cells via protection of mitochondria

GAOLi,XINGZhi-bo,LUBin,etal.

(DepartmentofPoliclinic,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the role of mitochondria in the protective effects of ginsenoside Rb1 on cellular apoptosis caused by oxygen-glucose deprivation.Methodsin this study,MTT assay,TUNEL staining,flow cytometry,immunocytochemistry and western blotting were used to examine the cellular viability.ResultsWe found that pretreatment with GRb1 improved the cellular viability damaged by OGD.Moreover,GRb1 inhibited apoptosis in SH-SY5Y cells induced by OGD.Further studies showed that the elevation of cellular reactive oxygen species levels and the reduction of mitochondrial membrane potential caused by OGD were both counteracted by GRb1.ConclusionOur study indicates that the protection of GRb1 on OGD-induced apoptosis in SH-SY5Y cells is associated with its protection on mitochondrial function and inhibition of release of AIF and cytochrome c.

ginsenoside Rb1;oxygen-glucose deprivation;mitochondria;cytochrome c

1007-4287(2016)09-1425-04

R392R743.3

A

2015-04-19)