ARMS法甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因檢測252例臨床病理分析

包　亮，王貴民

(吉林大學第一醫(yī)院 甲狀腺外科，吉林 長春130021)

?

ARMS法甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因檢測252例臨床病理分析

包亮，王貴民*

(吉林大學第一醫(yī)院 甲狀腺外科，吉林 長春130021)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)占所有甲狀腺惡性腫瘤的85%-90%[1]，是甲狀腺癌中最常見的病理類型。眾所周知，甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增加。鑒于日益增多的甲狀腺癌，其中絕大多數(shù)是亞臨床的，迫切需要找出一種可靠的術(shù)前分層方法(依據(jù)患者復發(fā)和死亡風險)來確定是否進行手術(shù)、手術(shù)的范圍以及術(shù)后輔助治療的需要。目前研究表明[2,3]，BRAF(鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體 B1)突變是甲狀腺癌中最常見的遺傳學改變，并且BRAF突變僅發(fā)生在乳頭狀癌和乳頭狀癌起源的未分化癌，而在髓樣癌、濾泡癌等其他甲狀腺惡性腫瘤和良性病變以及正常的甲狀腺組織中均未被發(fā)現(xiàn)。近期很多研究表明BRAF V600E突變與PTC高危的臨床病理特征、腫瘤的復發(fā)及131I治療的敏感性降低關(guān)系密切。然而，BRAF突變與PTC臨床相關(guān)性的研究仍存在爭議。因此，本研究旨在通過對吉林大學第一醫(yī)院1年期間行手術(shù)治療的252例PTC病例的臨床資料進行回顧性分析，來探討B(tài)RAF基因與PTC臨床的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1研究對象

選取2013年12月至2014年12月期間在吉林大學第一醫(yī)院甲狀腺外科由同一醫(yī)療團隊進行手術(shù)治療并有BRAF基因檢測結(jié)果的252例PTC患者作為研究對象。所有患者均符合以下選取標準：①術(shù)后石蠟病理切片確診為PTC，住院期間的病例資料較完備；②由我院病理科通過蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS法)[4]檢測BRAF突變；③無頭頸部手術(shù)史的初次手術(shù)患者。

1.2研究方法

收集納入研究PTC患者的臨床病理資料，觀察患者在性別、年齡、家族史、被膜浸潤、腫瘤腺葉分布、病灶數(shù)、區(qū)域(中央?yún)^(qū)、側(cè)頸)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴橋本性甲狀腺炎或結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及臨床分期的BRAF基因表達情況，并按照腫瘤最大直徑將PTC分為T1≤0.5 cm組、0.5 cm2 cm組4組，觀察4組患者的BRAF基因表達情況。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料率的比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法，并用logistic回歸分析的方法進行因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1BRAF突變率以及對BRAF V600E突變與PTC臨床病理特征關(guān)系的統(tǒng)計分析

本組PTC患者的BRAF突變率為84.9%(214/252)。本組所有PTC病例術(shù)后病例亞型均為經(jīng)典型。對本組患者的性別、年齡、家族史、被膜浸潤、腫瘤腺葉分布、病灶數(shù)、區(qū)域[中央?yún)^(qū)(Ⅵ區(qū))、側(cè)頸(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ區(qū)±Ⅴ區(qū))]淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴橋本性甲狀腺炎或結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及臨床分期進行統(tǒng)計，并統(tǒng)計BRAF突變在這些因素中發(fā)生的概率(見表1)，并對BRAF突變率在這些因素中用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行各組間率的比較，計算P值所得結(jié)果均大于0.05，即BRAF突變與上述因素間的差異無統(tǒng)計學意義，尚不能認為BRAF突變與上述因素有相關(guān)性。其中，本組252例病例的臨床分期依據(jù)AJCC第七版分化型甲狀腺癌(DTC)的TNM分期[5]：Ⅰ期149例、Ⅲ期51例、Ⅳ期52例，無Ⅱ期病例。對腫瘤最大直徑大小T(cm)進行比較(見表2)，按T1≤0.5、0.52分層，比較其BRAF突變率，應(yīng)用行×列表格資料χ2檢驗，得出P=0.645>0.05，即BRAF突變與腫瘤大小差異不具有統(tǒng)計學意義，尚不認為BRAF基因突變與腫瘤大小有相關(guān)性。

表1　BRAFV600E基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

注：P<0.05為差異具有顯著性。

表2　BRAFV600E基因突變與腫瘤大小的關(guān)系

此外，采用logistic回歸分析的方法對PTC的高危臨床病理特征與BRAF基因突變的關(guān)系行單因素及多因素分析(表3)，結(jié)果顯示BRAF基因突變與表中變量亦無相關(guān)性。

3　討論

目前，研究基因改變在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用是臨床前沿熱點。研究已經(jīng)證實[21,22]，對甲狀腺結(jié)節(jié)行細針穿刺細胞學檢查(FNAC)同時檢測BRAF V600E 基因突變有助于提高對PTC的診斷率，尤其是FNAC不能明確診斷的甲狀腺結(jié)節(jié)具有重要意義。BRAF V600E突變是BRAF突變中最常見和最具代表性的，占BRAF所有突變的90%以上[6]。據(jù)文獻報道[7,8]，BRAF V600E 突變在PTC中發(fā)生率最高，達29%-83%。研究表明[2,9],MAPK通路的突變發(fā)生在約30%的癌癥中，而約8%的癌癥的發(fā)生是由于BRAF突變。而在MAPK通路中，BRAF基因突變可導致腫瘤細胞的增殖和分化，這一機制可能參與腫瘤早期的發(fā)生和發(fā)展[2]。

表3　單因素與多因素分析

注：單因素分析：P<0.05有相關(guān)性；多因素分析：P<0.074有相關(guān)性

因此，進一步研究BRAF V600E突變與PTC的臨床病理特征間的關(guān)系有助于闡明甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，并為臨床醫(yī)生針對PTC患者治療策略以及預后的判斷給出重要的指導價值。然而，國內(nèi)外對BRAF V600E 突變率及其與PTC臨床病理特征聯(lián)系的研究結(jié)論不一。

本研究中BRAF突變率為84.9%(214/252),其比例高于文獻報道29%-83%[7,8]。但與韓國學者報道的突變率相符，其報道PTC中BRAF突變率為52%-87%[10,11]。本組檢測方法為ARMS法，檢測方法的不同可能是造成本組BRAF突變率較高的原因之一。在來自韓國的Jung Kwang Nam等[12]研究的424例PTC患者中，BRAF突變的比例為335/424(79%)，而按PTC病理亞型分類，經(jīng)典型的突變率為79.7%，濾泡亞型為62.5%(P=0.019)，并認為，造成在韓國BRAF突變率較高的原因主要是該國的PTC病理亞型主要為經(jīng)典型PTC，且與其國內(nèi)人均碘攝入量高有關(guān)。而本組所有病例術(shù)后病理確診均為經(jīng)典型乳頭狀癌。我國在1996年起立法施行全民食鹽加碘政策，而文獻[13]報道，據(jù)WHO等組織規(guī)定的碘過量標準[MUI(尿碘中位數(shù))>300 μg/L]，我國在1999年MUI早已到達306 μg/L，說明我國早已總體達到碘過量水平。這與Jung Kwang Nam等研究觀點一致。

另外，需要指出的是，本組對BRAF突變研究的不足之處在于，本組病例均為術(shù)后病理診斷為PTC之后檢測的BRAF基因即回顧性分析，缺少任何降低選擇性偏倚的前瞻性研究；本研究為局部地區(qū)的少數(shù)病例，缺乏大多數(shù)研究的多元分析；且PTC病理組織學亞型單一(均為經(jīng)典型)。這些因素難免對BRAF突變率高低差異造成影響。

本研究對BRAF突變與性別、年齡(≥45歲/<45歲)、腫瘤大小、家族史、被膜浸潤、單灶或多灶、腫瘤腺葉分布(單葉癌/雙葉癌)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴橋本甲狀腺炎、伴結(jié)節(jié)性甲狀腺腫以及臨床TNM分期間的關(guān)系(表1、2、3)進行了統(tǒng)計分析，不論是χ2檢驗還是logistic回歸因素分析，均未得出具有統(tǒng)計學意義的結(jié)果。Ju-Han Lee等[14]對12項關(guān)于BRAF突變與PTC臨床病理因素相關(guān)性的研究中對1168例PTC病例進行了Meta分析，結(jié)果顯示BRAF 基因突變與PTC組織學亞型，甲狀腺腺外擴散和較高的臨床分期密切相關(guān)，而與PTC患者的年齡、性別、種族、或腫瘤的大小無顯著關(guān)系。但國內(nèi)外研究結(jié)論尚不統(tǒng)一。Su-jin Kim等[15]報道,BRAF突變僅與甲狀腺腺外擴散密切相關(guān)。而石臣磊等[16]對BRAF突變與PTC臨床病理特征的關(guān)系的研究中報道，PTC僅與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著性關(guān)系。導致這種不一致的結(jié)論出現(xiàn)的原因尚待研究。但就本研究所得到的結(jié)果顯示，單獨檢測BRAF V600E突變尚不能為臨床對PTC的治療及預后評價提供有效的指導價值。

另外，在對本組與文獻報道[17]分析比較中發(fā)現(xiàn)，其與本組PTC病例均為同一醫(yī)療團隊，文獻中研究對象為2009年7月至2011年2月的全切的PTC手術(shù)病例，其中被膜浸潤143/221(64.7%)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移95/221(43.0%)，而本組中被膜浸潤210/252(83.3%)、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移139/252(53.2%)明顯高于前者。盡管本組病例手術(shù)切除范圍與前期病例相比更加規(guī)范，但不能完全解釋被膜浸潤率增高的原因，筆者認為本組病例惡性程度較前期文獻報道的要高。

這種BRAF突變與PTC高危臨床病理特征間不相關(guān)結(jié)論的得出可能與本組僅對BRAF基因進行了檢測，而未對PTC其他基因檢測進行比較分析，以及本組病例惡性程度較前期病例[17]增高有關(guān)。此外，本組252例病例中BRAF突變檢測陰性38例，陰性組病例相對過少可能也是原因之一。

綜上，鑒于本研究通過對BRAF突變與PTC臨床病理特征的研究，尚不能認為單獨檢測BRAF基因突變能夠為臨床個體化管理PTC患者提供有效的治療和預后評價的指導價值，而BRAF突變在PTC形成、發(fā)展中的致癌作用，已在很多研究中得到證實，近期有研究表明[18]，體細胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因的啟動子突變與PTC高侵襲性及BRAF V600E 突變密切相關(guān)。另有研究證明[19]，若在BRAF突變基礎(chǔ)上發(fā)生TERT啟動子突變，PTC的侵襲性將明顯增加。由此，聯(lián)合檢測BRAF V600E 突變與TERT啟動子突變將有望成為甲狀腺癌診斷、治療及預后評價中新的分子腫瘤標志物，為甲狀腺癌臨床治療研究提供新的方向。

[1]Davies L,Welch HG.Increasing incidence of thyroid cancer in the United States,1973-2002[J].JAMA，2006，295:2164.

[2]Xing M.BRAF mutation in thyroid cancer[J].Endocr Relat Cancer,2005,12:245.

[3]Liu D,Liu Z,Condouris S,et al.BRAF V600E maintains proliferation,transformation,and tumorigenicity of BRAF-mutant papillary thyroid cancer cells[J].J Clin Endocrinol Metab,2007,92 (6):2264.

[4]段秀梅,騰永亮,佟玲玲,等.直接測序法與ARMS法檢測甲狀腺乳頭狀微小癌組織中BRAF基因突變的比較[J].中國免疫學雜志,2014,11:1514.

[5]NCCN guidelines.Thyroid carcinoma[S].Version3,2011.

[6]Hilger RA,Scheulen ME,Strumberg D.The Ras-RAFMEK-ERK pathway in the treatment of cancer[J].Onkologie,2002,25:511.

[7]Garnett MJ,Marais R.Guilty as charged:B-RAF is a human oncogene[J].Cancer Cell,2004,6:313.

[8]Tama P,Solti Z,Bauer P.Mechanism of epidermal growth factor Regulation of Vav2,a guanine nucleotide exchange factor for Rac[J].J Biol Chem,2003,278(2):5163.

[9]Cohen Y,Xing M,Mambo E,et al.BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma[J].J Natl Cancer Inst,2003,95:625.

[10]Kim TY,Kim WB,Song JY,et al.The BRAF mutation is not associated with poor prognostic factors in Korean patients with conventional papillary thyroid microcarcinoma[J].Clin Endocrinol Oxf,2005,63:588.

[11]Kim KH,Kang DW,Kim SH,et al.Mutations of the BRAF gene in papillary thyroid carcinoma in a Korean population[J].Yonsei Med J,2004,45:818.

[12]Nam JK,Jung CK,Song BJ,et al.Is the BRAF(V600E) mutation useful as a predictor of preoperative risk in papillary thyroid cancer?[J].Am J Surg,2012,203(4):436.

[13]任思佳,沈捷.食鹽加碘對甲狀腺癌發(fā)病的影響[J].醫(yī)學綜述,2014,17:3135.

[14]Lee JH,Lee ES,Kim YS.Clinicopathologic significance of BRAF V600E mutation in papillary carcinomas of the thyroid:A meta-analysis[J].Cancer,2007,110(1):38.

[15]Kim SJ,Lee KE,Myong JP,et al.BRAF V600E Mutation is Associated with Tumor Aggressiveness in Papillary Thyroid Cancer[J].World J Surg,2012,36(2):310.

[16]石臣磊,丁超,秦華東,等.BRAF V600E 突變與乳頭狀甲狀腺癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中國普通外科雜志,2014,11:1522.

[17]劉嘉,高新寶,蘇暢,等.甲狀腺乳頭狀癌221例臨床特點分析及術(shù)式探討[J].中華內(nèi)分泌外科雜志,2013,7(4):278.

[18]Liu X，Bishop J,Shan Y,et al.Highly prevalent TERT promoter mutations in aggressive thyroid cancers[J].Endocr Relat Cancer,2013,20(4):603.

[19]Liu X,Qu S,Liu R,Sheng C,et al.TERT promoter mutations and their association with BRAF V600E mutation and aggressive clinicopathological characteristics of thyroid cancer[J].J Clin Endocrinol Metab,2014,99(6):E1130.

1007-4287(2016)09-1525-04

2015-04-07)