亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌產金屬β-內酰胺酶基因的流行病學研究

陳詠君，陳詠玫，張立群，吳麗霞，郭　晶

(1.沈陽醫學院附屬第二醫院 檢驗科，遼寧 沈陽110002；2.北京海淀婦幼保健院；3.沈陽醫學院)

?

亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌產金屬β-內酰胺酶基因的流行病學研究

陳詠君1，陳詠玫2，張立群3，吳麗霞1，郭晶1

(1.沈陽醫學院附屬第二醫院 檢驗科，遼寧 沈陽110002；2.北京海淀婦幼保健院；3.沈陽醫學院)

目的明確我院臨床分離的銅綠假單胞菌耐亞胺培南基因型。方法收集臨床分離的銅綠假單胞菌 219株，篩選亞胺培南耐藥株；采用雙紙片協同試驗對臨床分離的35株耐亞胺培南銅綠假單胞菌進行金屬β-內酰胺酶(MBL)表型檢測；用聚合酶鏈反應(PCR)檢測MBL基因型別，并對PCR擴增陽性株進行測序。結果219株銅綠假單胞菌中35株為耐亞胺培南銅綠假單胞菌，35株耐亞胺培南銅綠假單胞菌共檢出14株MBL表型陽性，占40% 。其中IMP-1型陽性7株、VIM-2型陽性2株。結論產金屬β-內酰胺酶是銅綠假單胞菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機制之一，臨床應根據藥敏結果及產酶情況綜合考慮合理用藥，以減少耐藥菌株的產生。

銅綠假單胞菌；亞胺培南；金屬β-內酰胺酶

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1471)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界，即使在健康人的皮膚，腸道及呼吸道仍可檢測到其存在。銅綠假單胞菌能夠引起人和動物的感染，但是伴隨抗生素的應用，銅綠假單胞菌的耐藥現象日益嚴重。銅綠假單胞菌復雜的耐藥機制，給臨床治療帶來了極大的困難。亞胺培南是臨床上常用于治療銅綠假單胞菌引起重癥感染的藥物，隨著亞胺培南在臨床的廣泛應用，銅綠假單胞菌對其耐藥率逐漸上升，已成為全球關注的重大問題[1]。目前關于銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制主要包括如下可能機制：(1) 銅綠假單胞菌能夠產生金屬β-內酰胺酶(MBL)和OXA型β-內酰胺酶等碳青霉烯水解酶，發生耐藥；(2) 銅綠假單胞菌外膜孔蛋白OprD的表達缺失或表達下降；(3) 銅綠假單胞菌主動外排系統表達增高。在這些主要的耐藥機制中，金屬β-內酰胺酶的產生是銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的重要機制之一。本研究回顧性對我院2012年-2013年間臨床分離非重復的亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌進行了MBL的表型及基因型檢測，現報告如下。

1　材料與方法

1.1菌株來源

收集我院2012年1月-2013年12月臨床分離銅綠假單胞菌219株，從中篩查出耐亞胺培南銅綠假單胞菌35株，所有菌株均保存在-40℃冰箱，臨用前復蘇。其中送檢標本包括：痰液、尿液等等。

1.2試劑及儀器

細菌基因組提取試劑盒(上海生工有限公司)；Taq酶及PCR相關試劑(上海生工有限公司)；ATB半自動微生物分析儀及配套試劑(法國生物梅里埃公司)、PCR9700(ABI)、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；紫外凝膠成像儀(美國AlphaInnotech)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)(沈陽化學試劑公司)；IPM(10mg/ml)藥敏紙片購自英國OXOID公司。

1.3質控菌株

質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購自衛生部臨床檢驗中心。

1.4鑒定與藥敏

細菌的培養和鑒定方法均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)進行，采用法國梅里埃半自動ATB配套鑒定及藥敏板，按照2013年美國臨床實驗室標準研究所(CLSI)[2]標準判斷藥敏結果。

1.5MBL耐藥表型檢測

雙紙片協同實驗檢測金屬酶：參照文獻[3]報道的方法。

1.6引物設計與合成

引物設計參照文獻[4]，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1　IMP、VIM、SPM、GIM基因引物一覽表

1.7DNA擴增

1.7.1DNA提取采用細菌基因組提取試劑盒，購于上海生工有限公司，按照操作說明提取基因組DNA。

1.7.2PCR擴增體系和反應條件 擴增反應總體積為25μl，6×Buffer緩沖液5μl，Taq酶(5U/H1)0.25μl，dNTP3μl，引物各4μl，模板5μl，加滅菌去離子水至25μl。反應條件為：94℃ 4min，94℃1s，55℃1s，72℃1.5s，72℃延伸10s。

1.7.3瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳40min(140V)。紫外燈下觀察結果，凝膠成像系統成像。

1.8統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件，數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，對上述檢測結果進行t檢驗或方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.12012年1月-2013年12月本院共分離銅綠假單胞菌219株，其中對亞胺培南耐藥或中介的共35株，占16%；其中EDTA法檢測金屬酶表型結果陽性14株，占40%。

2.235株耐亞胺培南PA共檢出7株IMP-1基因(見圖1)。

圖1部分IMP-1型金屬β-內酰胺酶編碼基因電泳圖

M:為marker;S:為標本

2.335株耐亞胺培南PA共檢出2株VIM-2基因(見圖2)。

圖2VIM-2型金屬β-內酰胺酶編碼基因電泳圖

M:為marker;S:為標本

3　討論

銅綠假單胞菌是假單胞菌屬中最具代表性的菌種。廣泛存在于自然界，即使正常人體的皮膚、腸道和呼吸道等部位也是銅綠假單胞菌的定植部位，這導致銅綠假單胞菌是常見的條件致病菌，亦是院內感染的主要致病菌。近年來，隨著大量的廣譜抗生素在臨床的廣泛應用，導致銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥率不斷升高，隨之而來的銅綠假單胞菌引起的感染成為臨床治療的一大難題。目前臨床用于治療銅綠假單胞菌的主要抗生素有三代頭孢菌素、β-內酰胺類、含酶抑制劑、碳青霉烯類抗菌藥物如亞胺培南(Imipenem,IMP)來治療，其中亞胺培南應用最為廣泛。碳青霉烯類抗菌藥物抗菌譜廣，無論是革蘭陽性菌還是革蘭陰性菌，而且對需氧菌、厭氧菌亦有很強的抗菌活性。但是，隨著亞胺培南在臨床的廣泛應用，銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率也逐年上升。本實驗中我院銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥率為14.9%[5]，均低于張諱博、施曉群、陳越等[6-8]報道2010、2011、2012年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測的耐藥率，這一結果與我們選取的樣本數量或本院使用碳青霉烯類藥物的情況密切相關。

銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物產生耐藥的主要機制是金屬β-內酰胺酶(MBL)的產生。本實驗采用紙片EDTA實驗分離MBL陽性的菌株，結果分離得到陽性表型菌株14株，占所收集耐亞胺培南PA的40%(14/35)，稍低于國內其他地區[9]。這一結果提示引起本院感染的銅綠假單胞菌已經有金屬酶的產生，但是相對于其他地區處于較低水平。銅綠假單胞菌一旦有金屬β-內酰胺酶產生，就會對所有的β-內酰胺類抗生素和碳青霉烯類抗生素產生耐藥，這一結果將導致臨床抗感染治療失敗。在本研究中，銅綠假單胞菌的分離率居首位的是干診三病房，其次為心外科病房[9]。

雖然國際上在銅綠假單胞菌中已經檢測到VIM、IMP、SPM、GIM、NDM和SIM型MBL基因[10]，但國內銅綠假單胞菌的檢測中以IMP、VIM和SPM型MBL基因為主，因此本實驗僅針對VIM、IMP、SPM、GIM型金屬β-內酰胺酶基因進行了研究。我們的研究結果提示：其中初篩陽性的14株菌株中，有7 株攜帶有IMP-1 基因，2 株攜帶有VIM-2 基因，其它菌株的擴增結果為陰性。導致擴增陰性的可能原因如下：(1) 使用EDTA法表型篩選時，EDTA自身的殺菌作用導致假陽性；(2)存在其他耐藥機制，例如OproD的缺失及MExXY-OprM外排泵的過度表達[11-15]，另外，產生過多Ampc酶，獲得性β-內酰胺酶的產生，細胞內酶的改變，細胞外膜主動外排系統、靶位的突變，細菌生物被膜的形成等也都是PA耐藥的機制。

鑒于銅綠假單胞菌日益增加的耐藥產生[8]，尤其是以產MBL的銅綠假單胞菌耐藥，一直困擾廣大臨床醫生。并且這一耐藥的產生容易通過整合子進行耐藥性傳播，因此臨床醫生有必要按有關規定，嚴格規范使用抗菌藥物，尤其是碳青霉烯類抗生素，以達到降低抗菌藥物選擇壓力，避免醫院產MBL銅綠假單胞菌感染的產生。同時有研究證明，過度使用消毒劑也是銅綠假單胞菌耐藥產生的機制之一[16，17]。因此，規范合理的消毒程序，同樣是我們工作中需要進一步提高的地方。另外，隨意將耐藥PA的污水及垃圾的排放，也是PA耐藥發生的風險之一[18]。所以醫院應加強對醫療垃圾及污水的消毒措施，以減少耐藥菌的增加。

綜上所述，MBL相關基因的存在與銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥性有關。為了降低這一風險的發生，我們除了應該規范使用抗生素外，在消毒劑的使用方面也應該注意，以其達到降低銅綠假單胞菌的耐藥。

[1]Kucisec-TepesN.Pseudomonasaeruginosa-asignificanthospitalpathogenandresistancetocarbapenem[J].ActaMedCroatica,2004,58(4):313.

[2]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.PerformancastandardsforantimicrobialsusceptibiIitytesting:seventeenthinformational[S].CLSIdocumentM100-S19,2009,3:44-45.

[3]LeeK,ChongY.ShinHB,etal.ModifiedHodgeandEDTA-disksynergyteststoscreenmetallo-beta-lactamaseproducingstrainsofPseudomonasandAcinetobacterspecies[J].ClinMicrobiolInfect，2001,7(2):88.

[4]陳瑞,唐英春,朱家馨,等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥性和金屬酶研究[J].中國微生態學雜志,2006,18(3):209.

[5]蘇維奇,朱元祺,孔繁榮，等．青島地區耐亞胺培南銅綠假單胞菌金屬β-內酰胺酶檢測及耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志,2009,9(2):205.

[6]張諱博,倪語星,孫景勇,等.2010年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜,2012,3(12)161.

[7]施曉群,孫景勇,倪語星,等.2011年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜,2013,3(13)219.

[8]張越,孫景勇,倪語星,等.2012年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜,2015,3(15)199.

[9]陳詠君,陳詠玫,張立群,等.219株銅綠假單胞菌感染分布與耐藥性分析[J].中國醫學創新,2014,4(11):80.

[10]JovcicB，LepsanovicZ，SuljagicV，etal．EmergenceofNDM-1metallo-β-lactamaseinPseudomonasaeruginosaclinicalisolatesfromSerbia[J],AntimicrobAgentsChemother，2011,55(8):3929.

[11]Vatcheva-DobrevskaR,MuletX,IvanovI,etal.MolecularEpidemiologyandMultidrugResistanceMechanismsofPseudomonasaeruginosaIsolatesfromBulgarianHospitals[J].MicrobDrugResist,2013,19(5):355.

[12]史偉峰,王玉月,姜慶波,等.多重耐藥性銅綠假單胞菌耐藥基因及菌株聚類分析[J].中華醫院感染學雜志,2007,17(9):1057.

[13]劉樹華,劉平洪,薛曉,等.燒傷病房亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及耐藥基因分析[J].中華燒傷雜志,2014,30(1):25.

[14]王歡,黃慶,黃君,等.銅綠假單胞菌OprD2基因環介導等溫擴增快速檢測技術的研究[J].中華檢驗醫學雜志,2013,36(6):543.

[15]劉濤,修清玉.耐碳青霉烯銅綠假單胞菌金屬β-內酰胺酶和外膜蛋白機制研究[J].國際呼吸雜志,2015,9(35):1361.

[16]曾麗,曾文,鄧文喻,等.耐亞胺培南銅綠假胞菌耐藥性分析及耐消毒劑基因檢測[J].國際檢驗醫學雜志,2012,8(15):1795.

[17]顏英俊,糜祖煌,劉華,等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥特征及耐消毒劑基因的檢測分析[J].中國抗生素雜志,2007,32(4):249.

[18]SlekovecC,PlantinJ,CholleyP,etal.TrackingdownantibioticresistantPseudomonasaeruginosaisolatesinawastewaternetwork[J].PLoSOne,2012,7(12):e49300.

StudyOnmetalintheβ-lactamaseresistancegenesresistantPseudomonasaeruginosaimipenem

CHEN Yong-jun,CHEN Yong-mei,ZHANG Li-qun,et al.

(Second Affiliated Hospital of Shenyang Medical College,Shenyang 110002 ,China)

ObjectiveToinvestigatetheimipenem-resistantPseudomonasaeruginosagenotypeinourhospitalclinicalisolates.MethodsAtotalof219Pseudomonasaeruginosawerecollectedinourhospital.Double-disksynergytestwasusedto35ofimipenem-resistantPseudomonasaeruginosaphenotypebyMBLdetection.Polymerasechainreaction(PCR)wasusedtodetectMBLgenotypes.PCRmplificationpositivestrainswassequenced.ResultsAmong219ofPaeruginosa,imipenem-resistantwas35cases.Amongtheimipenem-resistant,MBL-positivephenotypewas21case(16%).WhichIMP-1-typepositive7,VIM-2type2positive.Conclusionβ-lactamaseproducingmetalPseudomonasaeruginosaisoneofthemainmechanismswithintheβ-lactamantimicrobialresistanceofclinicalrational.Itshouldberationallyusemedicinessothattoreduceresistancestrainsgenerating.

pseudomonasaeruginosa；imipenem；Metallo-β-lactamase

遼寧省教育廳科學技術研究項目(L2013399)；沈陽醫學院科技基金項目(2013020)

1007-4287(2016)09-1471-04

R378.99+1

A

2015-04-11)