超聲酶解制備牡丹籽降血糖肽的響應面優化研究

顏　輝,蔡　豪,賈俊強,江明珠,吳瓊英

(江蘇科技大學生物技術學院,江蘇鎮江 212018)

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超聲酶解制備牡丹籽降血糖肽的響應面優化研究

顏輝,蔡豪,賈俊強,江明珠,吳瓊英

(江蘇科技大學生物技術學院,江蘇鎮江 212018)

為獲得一種新型的降血糖肽,應用超聲輔助酶法制備牡丹籽蛋白源降血糖肽,并通過單因素和響應面實驗進行工藝優化。對酶解的7個因素進行篩選,確定5個主要因素進行響應面實驗設計優化。最優工藝參數為:溫度37.3 ℃,時間21.68 min,超聲波功率60.52 W(體積600 cm3),pH8.01,加酶量10202 U/g,2%蛋白濃度,超聲波頻率28 kHz,此條件下實際抑制率達到40.25%;比相同條件未使用超聲的抑制率提高了14.9%。本研究不僅為超聲輔助加速制備牡丹籽降血糖肽的研究和實際應用提供基礎,也為牡丹籽蛋白的綜合利用提供新的方向。

超聲波,牡丹籽蛋白,α-葡萄糖苷酶抑制率,酶解反應,響應面法

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一種內分泌代謝疾病,慢性高血糖是其主要發病癥狀。長期高血糖可引起高血壓、血管硬化等并發癥,進而導致心、腦、腎等重要器官的病變,嚴重者威脅生命[1]。目前,大部分糖尿病患者為Ⅱ型糖尿病,其中α-葡萄糖苷酶抑制劑是最具臨床價值的降血糖藥物[2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑能夠與小腸中的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結合,阻抑酶活性的發揮,阻滯雙糖水解為單糖,吸收時間后延,從而降低餐后血糖水平。

有學者研究表明,多肽可以作為一類α-葡萄糖苷酶抑制劑,如山杏、絲素、雜色蛤、蠶繭、蛋清、乳清、魷魚肝臟蛋白等蛋白,經過酶解,多肽均有抑制α-葡萄糖苷酶活性,有輔助降低血糖的作用[3-9]。上述蛋白存在成本較高、常規酶解速率慢的缺陷,酶解過程需要一到兩個小時甚至更長時間[3-9],難以滿足大規模工業生產需要,因此,如何低成本且快速獲得多肽是一項亟待解決的問題。

2011年牡丹油被批準成為我國新型的食用油,油料牡丹的種植面積逐年上升,2015年已達200萬畝以上[10],榨油后牡丹籽蛋白將成為一種新型的廉價蛋白原料。

超聲波這種綠色的加工技術,與常規條件相比具有效率高、設備要求低、減少酶解反應時間等優點[11-12]。吳進菊、張輝、李芳等[13-15]都對超聲波輔助酶解蛋白制備肽進行了研究,超聲波有提高酶解速率和肽產量的作用。

本實驗以牡丹籽蛋白作為原料,采用超聲波輔助酶解反應制備降血糖肽,并應用響應面進行工藝優化,以期獲得一種高活性牡丹籽降血糖肽及其高效制備方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

ICR小鼠購自江蘇大學實驗動物中心(合格證編號:NO.201600100)。

實驗材料與試劑:牡丹籽購自山東牡丹科技園;對硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;胰蛋白酶購自國藥集團化學試劑有限公司。

UV-9600紫外可見分光光度計北京北分瑞利分析儀器公司;GYZ-Y3格亞小型家用榨油機合肥格亞機械自動化有限公司;自制超聲波反應器。

1.2實驗方法

1.2.1牡丹籽蛋白的制備牡丹籽65 ℃烘干12 h,剝殼,65 ℃烘干8 h,GYZ-Y3格亞榨油機轉速63 r/min、熱榨模式進行榨油。牡丹籽粕粉碎后與蒸餾水1∶10混均,1 mol/L NaOH溶液調節pH至9.5,50 ℃超聲水浴2 h,3800 r/min離心15 min,所得沉淀重復提兩次,合并所得溶液,2 mol/L鹽酸調節pH至4.5,3800 r/min離心20 min,沉淀冷凍干燥。

1.2.2鼠源α-葡萄糖苷酶制備脫臼處死小鼠,用0 ℃生理鹽水洗去雜物,液氮研磨。將pH6.8濃度為0.05 mol/L的PBS與研磨粉混合,按照體積質量比10∶1配比,渦旋提取60 s,4 ℃8000 r/min離心15 min,取上清。

1.2.3檢測方法酪氨酸標準曲線與酶活力的測定參照周景祥[16]文章中的方法;α-葡萄糖苷酶抑制率測定參照Hyun[6]的方法,有改動。

配制5 mg/mL pNPG溶液、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)、0.5 mol/L碳酸鈉溶液,在試管中依次加入磷酸緩沖液、樣品、α-葡萄糖苷酶液和pNPG溶液,反應體系如表1所示:

表1　α-葡萄糖苷酶抑制率檢測體系組成

混合均勻,水浴37 ℃反應15 min,加入2 mL碳酸鈉溶液終止反應,405 nm處檢測吸光值。抑制率計算公式如下:

抑制率(%)=[A0-(A-A2)]/(A0-A1)×100

其中A0、A、A1、A2分別為控制組、實驗組、對照組、背景組對應吸光值。

1.2.4單因素條件的篩選以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標,在預實驗的基礎上選用胰蛋白酶進行實驗,設定超聲波體積為600 cm3,進行單因素實驗。

1.2.4.1加酶量對抑制率的影響 固定底物濃度2%，溫度37 ℃，時間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同加酶量(2500、5000、7500、10000、12500、15000 U/g)對抑制率的影響。

1.2.4.2底物濃度對抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，溫度37 ℃，時間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同底物濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)對抑制率的影響。

1.2.4.3溫度對抑制率的影響 固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，時間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同溫度(31、34、37、40、43 ℃)對抑制率的影響。

1.2.4.4時間對抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同時間(0、10、20、30、40、50、60 min)對抑制率的影響。

1.2.4.5pH對抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，時間20 min，超聲波頻率28 kHz，超聲波功率60 W，考察不同pH(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)對抑制率的影響。

1.2.4.6超聲波頻率對抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，時間20 min，pH8.0，超聲波功率60 W，考察不同超聲波頻率(22、28、35、40 kHz,)對抑制率的影響。

1.2.4.7超聲波功率對抑制率的影響固定加酶量7500 U/g，底物濃度2%，溫度37 ℃，時間20 min，pH8.0，超聲波頻率28 kHz，考察不同超聲波功率(30、60、90、120、150 W)對抑制率的影響。在單因素實驗的基礎上進行響應面設計,并根據響應值進行分析。所采集樣品經沸水滅酶10 min,8000 r/min離心15 min取上清液檢測抑制率。

1.2.5響應面實驗設計在單因素實驗基礎上,選取加酶量(A)、時間(B)、溫度(C)、pH(D)和超聲功率(E)這5個因素,進行響應面實驗設計,如表2所示:

表2　響應面實驗的因素和水平編碼

1.2.6數據分析響應面模型的建立與數據分析通過Design Expert 8.0.6軟件進行計算和分析處理。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.1.1不同酶解時間檢測其對鼠源性α-葡萄糖苷酶的抑制效果,如圖1。

圖1　不同酶解時間對抑制率的影響Fig.1　The influence of enzymatic hydrolysis time on inhibition rate

在0～20 min內,抑制率顯著上升,20 min之后抑制率略有下降,這可能是繼續水解切成無活性小肽[4-5,9,18],也可能是超聲處理影響了胰蛋白酶酶活力,導致抑制率的變化[11],因此選擇20 min作為實驗的最優點。

2.1.2不同底物濃度檢測結果如圖2。底物濃度在0.5%～2%時,隨著蛋白濃度增大,抑制率逐漸上升,2%～3.5%,盡管濃度增加,但抑制率增加極少。在蛋白質濃度較低時,隨著蛋白濃度增加,抑制活性的產物多肽也在增多;蛋白濃度進一步增大,酶分子的活性中心逐漸被飽和[5,9,17],因此抑制率上升緩慢?？紤]到更加經濟因素,選擇2%的濃度進行響應面設計。

圖2　不同底物濃度對抑制率的影響Fig.2　The influence of substrate concentration on inhibition rate

圖3　不同加酶量對抑制率的影響Fig.3　The influence of enzyme amount on inhibition rate

圖4　不同pH對抑制率的影響Fig.4　The influence of pH on inhibition rate

圖5　不同溫度對抑制率的影響Fig.5　The influence of temperature on inhibition rate

圖6　不同頻率對抑制率的影響Fig.6　The influence of frequency on inhibition rate

圖7　不同功率對抑制率的影響Fig.7　The influence of power on inhibition rate

2.1.3不同加酶量加酶量在2500～10000 U/g范圍內,加酶量增多,抑制率一直顯著上升,超過10000 U/g之后,抑制率有所下降。底物濃度不變時,酶分子增多,酶解加快,抑制活性產物增多;隨著加酶量進一步增加,酶分子達到過飽和,只有部分酶能與蛋白結合反應,導致抑制率上升緩慢[5,9,17]。因此選擇10000 U/g作為最優加酶量。

2.1.4不同pHpH在6.0～8.0之內,抑制率一直上升,大于pH8.0,抑制率呈下降趨勢;pH較低或者較高時都會影響其空間結構[18],導致酶解的效果不佳[5,9],抑制率下降,這表明胰蛋白酶的最適pH在8.0左右。因此選擇pH8.0作為最優pH。

2.1.5不同溫度溫度在31～37 ℃之內,抑制率一直不斷上升,37 ℃達到頂點,超過37 ℃抑制率呈下降趨勢,表明溫度低于或者高于最適溫度抑制率均會降低[5,9,18],因此選擇37 ℃作為最優溫度。

2.1.6不同頻率頻率在22～28 kHz之內,抑制率顯著上升,28 kHz之后,抑制率呈下降趨勢,不同頻率超聲波對胰蛋白酶活力影響導致[18],由于超聲波振子頻率特殊因素,選擇28 kHz進行響應面設計。

2.1.7不同功率功率在30～60 W之內,抑制率一直顯著上升,大于60 W,抑制率呈下降趨勢;表明低功率的超聲促進酶解進行,導致抑制率的增高[11],可能是酶分子的結構遭到高能量強度的超聲波破壞,影響了酶的活性,進而導致抑制率下降,這是不同的功率對酶活性的影響導致抑制率的變化[11,19],因此選擇60 W作為最優功率。

2.2響應面優化實驗

2.2.1響應面實驗結果在表2中的水平編碼之下,響應面設計和結果見表3:

表3　響應面實驗設計及其結果

2.2.2模型方差分析回歸模型方差分析結果與回歸方程系數見表4:

表4　回歸方程模型方差分析表

Y(%)=39.03+1.04A+6.13B+6.65C+0.44D+5.31E-2.36AB-8.08AC-7.86AE-9.74BC-3.72BD-9.88BE-8.74CD-13.29CE+44.71DE-4.33A2-6.65B2-10.54C2-11.05D2-8.1E2-51.97ABC

由表4方差分析可知,一次項中B、C、E極其顯著,交互項與平方項中各項均顯著,各因素重要程度為[20-21]:C(溫度)>B(時間)>E(功率)>A(加酶量)>D(pH)。

2.2.3響應面分析根據回歸方程,各因素之間交互作用的影響,如圖8所示:

圖8　各因素交互作用對抑制率影響的響應曲面圖Fig.8　The various interactive effects on inhibition rate of response surface plots注:a.加酶量與時間,b.加酶量與溫度,c.加酶量與功率,d.時間與溫度,e.時間與功率,f.溫度與功率。

由圖8可以直觀的看出各因素交互作用對抑制率的影響,曲線密集或陡峭程度越高則表明對結果響應值得影響越大[22-23]。在本文選定的實驗條件參數范圍內,由圖8a可知,沿著時間方向等高線比加酶量方向等高線更加密集陡峭,時間對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響要遠大于加酶量對其的影響;圖8b中可以看出沿著溫度方向等高線比沿著加酶量方向更加密集,坡度也更加陡峭,溫度對抑制率的影響要遠比加酶量大;圖8c中沿著功率方向等高線要比沿加酶量密集,功率對抑制率的影響高于加酶量對其的影響;圖8d中沿著溫度方向等高線比時間更加密集,溫度對抑制率的影響要比時間更大,圖8e中時間方向等高線比功率更加密集,時間比功率影響更加顯著;圖8f中溫度方向等高線比功率密集,溫度比功率影響更加顯著。

2.2.4最優工藝與驗證實驗經過單因素與響應曲面分析得出酶解牡丹籽蛋白最優工藝條件:溫度37.3 ℃,21.68 min,60.52 W(體積600 cm3),pH8.01,加酶量10202 U/g,2%蛋白濃度,28 kHz,在此條件預測抑制率達到40.18%。為驗證模型可靠性,進行3次驗證,測得抑制率為40.25%,與預測值基本一致,數準確可靠,具有實用性。

2.2.5結果討論本研究使用超聲波輔助酶解的方法制備牡丹籽降血糖肽。普通酶解在溫度37.3 ℃,pH8.01,加酶量10202 U/g,底物濃度2%條件下,40 min才到達最佳抑制率,抑制率僅為25.35%,相較而言,超聲波輔助酶解的抑制率提高14.9%,這可能是超聲波輔助酶解過程對蛋白質、酶分子的結構發生了影響導致的[11-15,18-19],研究結果與林洮等[19]對超聲波促進酶解反應的研究結果一致。王晟等[3]通過對木瓜蛋白酶制得山杏蛋白降血糖肽的研究,該肽對α-葡萄糖苷酶抑制類型為非競爭性抑制;本文中牡丹籽降血糖肽的抑制類型有待以后研究。

因此,使用超聲波輔助酶解,不僅提高了產量,也縮短了反應時間,達到了預期目的。不僅為Ⅱ型糖尿病患者提供了新型降血糖藥物,而且為牡丹籽蛋白的高效化利用提供了新的方向,具有較高的實用前景與價值。

3　結論

本研究采用超聲波輔助胰蛋白酶的技術手段制備牡丹籽降血糖肽,通過超聲波提高酶解反應速率以及目標產物得率,相較正常酶解,時間縮短為原來的1/2,α-葡萄糖苷酶抑制率卻是原來的2倍以上;因此,超聲波明顯促進多肽的制備效果,在實際生產中極具應用價值。

在本實驗中,通過對超聲波頻率、功率、底物濃度、溫度、時間、pH、加酶量的單因素篩選和響應面優化。最終確定最佳工藝參數為:溫度37.3 ℃,21.68 min,60.52 W(體積600 cm3),pH8.01,加酶量10202 U/g,2%蛋白濃度,28 kHz,在此條件實際抑制率達到40.25%。

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Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic preparation of peony seed hypoglycemic polypeptide by response surface methodology

YAN Hui,CAI Hao,JIA Jun-qiang,JIANG Ming-zhu,WU Qiong-ying

(School of biotechnology,Jiangsu University of Science and Technology,Zhenjiang 212018,China)

In order to get a new type of hypoglycemic peptide,ultrasonic-assisted enzymatic was used to prepare peony seed hypoglycemic peptide,and the process was optimized by one-factor and response surface experiments. Five factors were determined to be optimized by the response surface methodology from the seven factors of enzymolysis. The optimal process parameters were temperature of 37.3 ℃,time of 21.68 min,power of 60.52 W(volume of 600 cm3),pH8.01,enzyme of 10202 U/g,protein concentration of 2%,frequency of 28 kHz,and the actual inhibition rate was 40.25% under this condition,which was increased by 14.9% compared with the no ultrasonic condition. This study not only provided basis for ultrasonic assisted preparation of peony seeds hypoglycemic peptide,but also gave a new utilization direction of peony seed protein.

ultrasonic;peony seed protein;α-glycosidase inhibition rate;enzymatic hydrolysis reaction;response surface methodology

2016-02-26

顏輝(1971- )，男，博士，副教授，研究方向：生物制藥，E-mail:yanh1006@163.com。

市重點研發計劃-產業前瞻與共性關鍵技術(GY2015006)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)17-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.035