利用油料籽粕酶法制備多肽工藝及其抗氧化活性研究進展

唐天悅,周海玥,姜　婧,宋立華,*

(1.上海交通大學 農業與生物學院,陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240；2.雀巢研發中心上海有限公司,上海 201812)

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利用油料籽粕酶法制備多肽工藝及其抗氧化活性研究進展

唐天悅1,2,周海玥1,姜婧1,宋立華1,*

(1.上海交通大學 農業與生物學院,陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240；2.雀巢研發中心上海有限公司,上海 201812)

油料籽粕經過酶水解可制備具有生物活性的多肽,其中部分多肽具有抗氧化活性。籽粕原料來源及水解工藝不同,活性肽的抗氧化活性也有所差別。本篇綜述介紹目前國內外利用花生、大豆和油菜籽等主要油料籽粕原料酶解制備抗氧化活性肽的工藝方法及其抗氧化活性。

油料籽粕,酶解工藝,生物活性肽,抗氧化活性

根據聯合國糧農組織(UNFAO)的調查數據,2014～2015年度油籽的總產量約5.4億t,榨油之后的副產物油粕粉和油粕餅的利用率(利用量與供應量之比)為82.5%[1],目前,油料作物榨油后的副產物——籽粕,如花生粕、玉米渣和大豆粕等,煉油之后一般都被丟棄或用作廉價的動物飼料。事實上,常見油料籽粕中含有至少35%以上的蛋白質(如表1所示),且氨基酸組成平衡[2],是重要的植物蛋白資源。Hwang JY等[3]的研究表明,利用酶水解花生粕后獲得的多肽較籽粕蛋白在抑制亞麻酸過氧化作用中具有更強的抗氧化活性;更為重要的是,與其他抗氧化食品添加劑相比,籽粕活性多肽在pH為2～12、溫度為30～80 ℃的范圍內,均顯示出較好的溶解性和活性[4]。因此,利用現代生物技術對這些籽粕中的蛋白質進行綜合開發利用,生產活性多肽,不僅可減少浪費,還可開發出具有高附加值的生物活性物質。

表1　我國2012年油料作物產量、籽粕產出量*以及蛋白質含量

注:*中國國家統計局年鑒2013 http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2013/indexch.htm；**2012年我國大豆的進口數量為5838萬t。

表2　部分油料籽粕蛋白的最佳水解條件

目前,利用動、植物來源的蛋白質制備活性肽的方法有酶水解及生物發酵等方法[5]。其中,因為酶法具有較好的專一性,故而在實際生產中得到廣泛應用。在活性肽的酶解制備工藝中,蛋白質來源、氨基酸序列、工藝條件不同,最終獲得的籽粕活性多肽的活性也有所不同。此外,研究表明有些活性多肽對心血管系統、消化系統、免疫系統和神經系統等發揮有益作用[6],其中,具有抗氧化活性的多肽通過抑制羥基自由基、超氧陰離子等自由基的活動,減輕脂質過氧化反應,從而發揮延緩衰老、抗腫瘤及減輕心血管疾病等作用[7]。近年來,抗氧化活性肽的制備工藝及其生物學活性的研究一直受到關注。本文主要綜合論述以花生粕、大豆粕和油菜籽粕為原料,利用酶法制備活性多肽工藝方法及其抗氧化生物活性研究進展。

1　籽粕活性多肽的酶法制備工藝

目前,利用籽粕制備活性多肽的方法主要有直接提取、生物發酵和酶水解等[5]。由于蛋白質結構、分子量以及氨基酸序列不同,所采取的制備工藝也有所不同。其中,直接提取的活性多肽一般天然存在于植物中,如銀杏種子、芹菜和山藥塊莖等,其多肽分子量在30 ku以下,可用離子交換或者排阻色譜法進行提取純化[8-10];利用微生物發酵肉醬、大豆和牛奶也可以獲得活性多肽[11-13];大麻籽活性多肽則是利用胃蛋白酶和胰蛋白酶經體外水解后,再利用超濾分離獲得不同分子量的活性多肽[14],在上述各種工藝中酶水解法應用較多。

1.1酶水解法工藝流程

利用酶法從籽粕中提取制備活性多肽的一般工藝為:籽粕粉碎過篩→提取蛋白→80～100 ℃熱水浴處理→調節pH→酶水解→高溫滅酶→分離純化或超濾→濃縮→冷凍干燥→多肽→檢測多肽的生物學活性[15-17]。在制備活性多肽的工藝中,前處理中通過加熱煮沸籽粕,可破壞蛋白質緊密的球狀空間結構,有利于蛋白酶與蛋白結合位點的接觸,從而加快酶解速度[17]。

1.2酶的選擇

目前,利用籽粕水解制備活性肽的酶制劑主要有:堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶等[15,18-19],其中堿性蛋白酶和中性蛋白酶最為常用。在蛋白酶推薦的最適宜作用條件下,堿性蛋白酶酶解花生粕、大豆粕和油菜籽粕后水解產物的抗氧化活性最高[15,18-19]。這可能是與蛋白酶的作用位點密切相關,如有研究表明堿性蛋白酶的水解氨基酸殘基位點為谷氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸及谷氨酰胺的羧端肽鍵;而中性蛋白酶僅水解羧基端為酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等芳香族疏水性氨基酸的肽鍵[20]。因此,利用植物蛋白水解制備活性肽時,選用堿性蛋白酶可能更合適,因為其對羧端疏水性氨基酸具有較強的專一性,表現為經堿性蛋白酶水解后,能獲得較多分子量小于10 ku的肽,由于水解相對徹底,獲得的肽鏈短,游離氨基酸殘基較多,故抗氧化能力較強[21]。

1.3水解條件的選擇

在水解條件方面(包括pH、水解溫度、底物的量、酶制劑添加量),中性和堿性蛋白酶水解各類籽粕的最佳水解條件如表2所示,從表中數據可看出,作用底物不同,兩種蛋白酶的最佳水解條件有所不同:與中性蛋白酶相比,總體上堿性蛋白酶的作用溫度偏高;其次,同樣來源的植物蛋白,經堿性蛋白酶處理的水解度高于中性蛋白酶[22-24],堿性蛋白酶處理后花生粕、大豆粕以及油菜籽粕的水解度在14%～25%。而中性蛋白酶水解之后的籽粕的水解度僅為5%～15%[22-24];此外,在水解時間方面,研究表明水解2 h之后,籽粕溶液水解度的上升趨于緩和,3 h之后水解幾乎不再進行[21]。

因此,在酶解制備活性多肽的實際生產工藝中,可根據所需多肽分子量等要求,合理選擇酶制劑和酶解時間,以簡化生產工藝,降低生產成本[25]。

2　籽粕活性多肽的抗氧化活性

2.1多肽抗氧化活性的影響因素

多肽具有多種活性,其中抗氧化活性是多肽的生物學活性之一。已有部分結果證明分子量在13 ku之內的多肽具有較好的抗氧化活性[26];此外,Pihlanto-Lepp?l?[27]指出,肽鏈末端氨基酸種類會影響肽的生物學活性,一般地,甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、組氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸被認為是抗氧化氨基酸[28]。Garcia[5]和Sila等人[29]分別比較了上百種植物蛋白和數十種魚類蛋白水解后的肽鏈結構及其抗氧化活性,結果表明具有含有上述抗氧化氨基酸殘基的肽鏈具有較高的抗氧化活性。然而,另有研究表明,盡管多肽鏈具有相同種類的氨基酸,其抗氧化活性卻不盡相同,如有研究對豬腦蛋白在不同條件下進行酶解處理后得到不同的多肽,測得這些多肽的各氨基酸比例相同,但這些多肽在相同濃度下,抗氧化活性卻具有顯著差異,研究推測這可能是由于多肽鏈的分子量及親水性有所不同所致,但該研究只給出了肽鏈氨基酸比例和肽鏈大小分布,并未提及肽鏈的親水情況及肽鏈結構式[28];另外,Je[30]和Kim等人[31]證明有些不含上述氨基酸殘基的多肽鏈,亦有較好的抗氧化活性。上述研究結果提示氨基酸殘基的種類對多肽抗氧化活性的影響尚有待于進一步研究。

值得注意的是,除了多肽中抗氧化氨基酸殘疾的種類,這些氨基酸殘基的位置也會導致其抗氧化活性的變化,Chen[32]研究了28種多肽的抗氧化活性,結果表明在肽鏈C末端缺失組氨酸會降低抗氧化活性,如果N末端缺失亮氨酸卻對抗氧化活性無影響,這進一步提示抗氧化氨基酸殘基在C端還是N端對多肽的抗氧化活性亦有影響。某些以二肽形式結合的氨基酸,比他們單獨存在時要表現出更強的抗氧化活性[33-34]。此外,多肽的某些結構構象也會降低多肽的抗氧化活性,比如,將多肽鏈中第二個L-組胺酸換成了D-組胺酸,其抗氧化活性則會下降60%[35-36]。由此可見,多肽的抗氧化活性與其分子量、氨基酸殘基種類、殘基位置以及構象等有關。

表4　籽粕活性多肽對大鼠血紅細胞及肝細胞的體外抗氧化作用

2.2籽粕活性多肽的體外抗氧化活性

表3　不同濃度籽粕活性多肽的體外抗氧化活性

多肽體外抗氧化能力還可通過檢測紅細胞的溶血率和丙二醛(MDA)抑制率等方法進行評估。研究顯示,油料籽粕活性多肽可在紅細胞受到氧化物(例如:過氧化氫)攻擊時,利用其自身的抗氧化性,使紅細胞的細胞膜免受氧化損傷而減少細胞膜的破裂(表現為紅細胞溶血率的降低)[15];薛照輝[38]的研究表明,油菜籽粕活性多肽可通過抑制肝細胞中脂質過氧化反應,抑制脂質過氧化反應終產物MDA的生成(表4)。

在多肽的抗氧化活性評價方面,也有人將籽粕活性多肽添加入食用油脂中以替代常規抗氧化劑,觀察其對油脂氧化的抑制作用。王建化等人[22]在豬板油里添加花生肽,通過檢測油脂的過氧化值觀察花生肽(5%)的抗氧化效果,結果表明豬板油在70 ℃下保存12 d,其過氧化值(POV)較對照組降低五倍,抗氧化效果與3%維生素E的抗氧化效果相當;Hwang JY等人[39]的結果表明:1.0 mg/mL花生籽粕活性多肽與0.02 mg/mL BHA具有相同的抗氧化能力,提示花生籽粕來源的多肽具有一定的抗氧化活性。另有研究表明大豆籽粕多肽濃度小于0.1%時,其在大豆油和菜籽油中的抗氧化活性顯著低于叔丁基對苯二酚(0.02%),隨著大豆籽粕多肽使用量的增加,其抗氧化作用增強;但添加量加倍后,油脂過氧化值(POV)值未見進一步明顯降低。即使在大豆油和菜籽油中添加0.1%的大豆籽粕多肽,其對POV值的影響僅相當于0.04%茶多酚的2倍[18]。

上述研究結果表明,多肽的抗氧化活性與其原料來源密切相關,即來源不同,其發揮抗氧化活性的有效濃度有所不同;抗氧化活性的評估方法不同,其表現也不盡相同。另外,籽粕來源的活性多肽,雖然在清除氧自由基和延緩脂質過氧化等方面都有一定效果,但作為抗氧化劑應用于食用油中尚有一定的局限性,根據現有研究結果,將籽粕多肽作為抗氧化劑應用植物油,不但添加量較高,抗氧化效果有限,而且不同來源的籽粕活性多肽對不同植物油的抗氧化效果也還需要更多的實驗數據進一步評估。

2.3籽粕活性多肽的體內抗氧化活性

為進一步研究籽粕多肽的體內抗氧化活性,有研究利用D-半乳糖建立衰老大鼠模型,并灌胃給予大鼠花生籽粕多肽(500 mg/kg ·體重),連續喂養50 d后,可以使大鼠血清和腦組織中的SOD活性顯著增加,其中,大鼠腦組織SOD活性較衰老模型組增加14.5%,血清SOD活性增加7.7%[40]。給大鼠每日灌胃給予400 mg/kg ·體重大豆籽粕多肽,45 d之后,其肝組織的SOD活性量較模型組增加15.2%[18]。

另有體內研究結果表明,D-半乳糖所致衰老組大鼠腦組織CAT活性較正常組大鼠降低50%,而每日灌胃給予劑量為400 mg/kg·體重的大豆籽粕多肽,連續喂養45 d后,大鼠腦組織的CAT活性較衰老模型組高41.6%[18];且大豆籽粕多肽干預劑量低于400 mg/kg·體重時,隨多肽劑量的增加腦及肝組織中CAT活性顯著增加;但當大豆籽粕多肽的干預劑量超過400 mg/kg·體重之后,CAT活性未見明顯增強[18]。

在對脂質過氧化物的作用方面,D-半乳糖致衰老大鼠腦組織MDA水平較正常組大鼠升高29.4%,而在大豆籽粕多肽干預組(400 mg/kg·體重,45 d)MDA水平較衰老模型組降低10.3%,肝組織的MDA則降低16.8%[18]。利用花生籽粕多肽(500 mg/kg·體重)對同類衰老大鼠進行干預50 d后,大鼠血清MDA含量可較衰老模型降低39.5%[40]

上述研究表明,花生和大豆籽粕多肽對衰老大鼠的腦、肝臟和機體均表現出一定的抗氧化活性,但與花生和大豆籽粕多肽相比較而言,菜籽多肽的體內抗氧化效果并不是非常顯著[41],可見多肽在體內的抗氧化活性與其制備的原料來源、種類及作用劑量密切相關。

3　展望

[1]糧食展望 市場綜述. 聯合國糧食及農業組織(糧農組織)[R]. ISSN 2227-4669,2014(10):8

[2]王楠,馮志彪. 兩種油料蛋白制備及其功能性研究[J]. 中國油脂,2012,03:18-22.

[3]Hwang JY,Shyu YS,Wang YT,at al. Antioxidative properties of protein hydrolysate from defatted peanut kernels treated with esperase[J]. LWT-Food Science and Technology,2010,43:285-290.

[4]Tang L,Sun J,Zhang H,at al. Evaluation of physicochemical and antioxidant properties of peanut protein hydrolysate[J]. National Institutes of Health,2012,7(5),PMC3365052 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3365052/

[5]Garcia MC,Puchalska P,Esteve C,et al. Vegetable Foods:A cheap source of proteins and peptides with antihypertensive,antioxidant,and other less occurrence bioactivities[J]. Talanta,2013,106:328-349.

[6]Murray BA,FitzGerald RJ. Angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins:biochemistry,bioactivity and production[J]. Curr Pharma Design,2007,13:773-791.

[7]Zhou CS,Hu JL,Ma HL,et al. Antioxidant peptides from corn gluten meal:Orthogonal design evaluation[J]. Food Chemistry,2015,187:270-278.

[8]Huang W,Deng Q,Xie B,et al. Purification and characterization of an antioxidant protein from Ginkgo biloba seeds[J]. Food Research International,2010,43(1):86-94.

[9]Boonmee A,Srisomsap C,Karnchanatat A,at al. An antioxidant protein in Curcuma comosa Roxb. Rhizomes[J]. Food Chemistry,2011,124(2):476-480.

[10]Hou WC,Lee MH,Chen HJ,et al. Antioxidant Activities of Dioscorin,the Storage Protein of Yam Tubes[J]. Agriculture Food Chemistry,2001,49(10):4956-4960.

[11]Ohata M,Uchida S,Zhou LX,et al. Antioxidant activity of fermented meat sauce and isolation of an associated antioxidant peptide[J]. Food Chemistry,2016,194:1034-1039.

[12]Xu L,Du B,Xu BJ. A systematic,comparative study on the beneficial health components and antioxidant activities of commercially fermented soy products marketed in China[J]. Food Chemistry,2015,174:202-213.

[13]Solieri L,Rutella GS,Tagliazucchi D. Impact of non-starter lactobacilli on release of peptides with angiotensin-converting enzyme inhibitory and antioxidant activities during bovine milk fermentation[J]. Food Microbiology,2015,51:108-116.

[14]He R,Girgih AT,Rozoy E,et al. Selective separation and concentration of antihypertensive peptides from rapeseed protein hydrolysate by electrodialysis with ultrafiltration membranes[J]. Food Chemistry,2016,197:1008-1014.

[15]劉麗娜. 不同水解度花生多肽的制備及其生物活性研究[D]. 武漢:華中農業大學,2009.

[16]陳麗花,王躍,朱錦爵. 大豆蛋白抗氧化活性肽的制備工藝研究[J]. 食品工業,2011,3:31-34.

[17]王微星,陳劍兵,楊穎,等. 不同預處理方法對菜籽蛋白酶解效果的影響[J]. 浙江農業學報,2012,24(5):909-913.

[18]王莉娟. 大豆肽的制備及其體外抗氧化活性研究[D]. 無錫:江南大學,2008.

[19]聶慎德. 菜籽肽制備及其抗氧化活性的研究[D]. 合肥:合肥工業大學,2009.

[20]王洪濤. 海參肽的酶法制備工藝及抗疲勞活性研究[D]. 煙臺:煙臺大學,2007.

[21]He R,Girgih AT,Malomo SA,et al. Antioxidant activities of enzymatic rapeseed protein hydrolysates and the membrane ultrafiltration fractions[J]. Journal of Functional Foods,2013,5:219-227.

[22]王建化,熊柳,孫高飛,等. 花生抗氧化活性肽制取工藝研究[J]. 中國油脂,2008,33(6):15-18.

[23]張強. 酶解豆粕蛋白制備ACE抑制肽的研究[D]. 天津:天津商業大學,2012.

[24]盧曉會. 菜籽肽的制備、分離純化及其抗氧化活性研究[D]. 揚州:揚州大學,2012.

[25]張毅. 酶法制備大豆肽工藝條件的研究[D]. 無錫:江南大學,2009.

[26]Samaranayaka,AGP,Li C. Food-derived peptidic antioxidants:A review of their production,assessment,and potential applications[J]. Journal of Functional Foods,2011,3:229-254.

[27]Pihlanto-Lepp?l? A. Bioactive peptides derived from bovine whey proteins:opioid and ace-inhibitory[J]. Trends Food Sci Technol,2000,11:347-56.

[28]Zou Y,Wang W,Li Q,et al. Physicochemical,functional properties and antioxidant activities of porcine cerebral hydrolysate peptides produced by ultrasound processing[J]. Process Biochemistry,2015:431-443.

[29]Sila A,Bougatef A. Antioxidant peptides from marine by-products:Isolation,identification and application in food systems. A review[J]. Journal of Functional Foods,2016,21:10-26.

[30]Je JY,Qian ZJ,Byun HG,et al. Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis[J]. Process Biochemistry,2007,42:840-846.

[31]Kim S,Je J,Kim S. Purification and characterization of antioxidant peptide from hoki(Johnius belengerii)frame protein by gastrointestinal digestion[J]. Journal of Nutritional Biochemistry,2007,18:31-38.

[32]Chen HM,Muramoto K,Yamauchi F,et al. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1996,44:2619-2623.

[33]Chi C F,Wang B,Hu F,et al.Purification and identification of three novel antioxidant peptides from protein hydrolysate of bluefin leatherjacket(Navodon septentrionalis)skin[J]. Food Research International,2015,73(a):124-139.

[34]Saito K,Jin DH,Ogawa T,et al. Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial chemistry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51:3668-3674.

[35]Nagasawa T,Yonekura T,Nishizawa N,et al.Invitroandinvivoinhibition of muscle lipid and protein oxidation by carnosine[J]. Molecular and Cellular Biochemistry,2001,225:29-34.

[36]Sarmadi BH,Ismail A. Antioxidative peptides from food proteins:A review[J]. Peptides,2010,31:1949-1956.

[37]Yang B,Yang HS,Li J,et al. Amino acid composition,molecular weight distribution and antioxidant activity of protein hydrolysates of soy sauce lees[J]. Food Chemistry,2011,124:551-555.

[38]薛照輝. 菜籽肽的制備及其生物活性的研究[D]. 武漢:華中農業大學,2004.

[39]Hwang JY,Shyu YS,Chang HM. Antioxidative activity of roasted and defatted peanut kernels[J]. Food Research International,2001,34:639-647.

[40]陳貴堂,趙立艷,李博,等. 花生肽對衰老模型大鼠血清和心、腦組織抗氧化效果的影響[J]. 中國糧油學報,2012,27(1):34-38.

[41]金晶. 菜籽蛋白酶解及產物抗氧化活性的研究[D]. 武漢:華中農業大學,2009.

Research progress in enzymic preparation of oil crop meal peptides and its antioxidant activity

TANG Tian-yue1,2,ZHOU Hai-yue1,JIANG Jing1,SONG Li-hua1,*

(1.Bor S. Luh Food Safety Research Center,School of Agriculture & Biology, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China; 2.The nestle research center in Shanghai co.,LTD,Shanghai 201812,China)

Bioactive peptides from de-fatted oil crops meal can be prepared using enzyme hydrolysis,and some of them has anti-oxidative activity. These peptides obtained under different hydrolysis condition and from different categories of oil crop meal have been shown to possess different radical scavenging and lipid oxidation inhibition abilities. Our present review summarized the enzymatic process and antioxidant activities of peptides from oil crops meal as peanut,soybean and rapeseed.

oil crop meals;enzymatic hydrolysis;bioactive peptides;antioxidant activity

2016-01-27

唐天悅(1986-)，女，在讀農業推廣碩士研究生，研究方向：食品營養，E-mail:397728089@qq.com。

宋立華(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：食品加工與營養，E-mail：lihuas0529@163.com。

國家自然科學基金(30972460)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0390-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.069