混菌固態發酵棉粕工藝參數的優化

劉惠琴,田永強,*,徐　力,張阿強,陳錫明

(1.蘭州交通大學化學與生物工程學院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學院寒區旱區環境與工程研究所,甘肅蘭州 730000)

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混菌固態發酵棉粕工藝參數的優化

劉惠琴1,田永強1,*,徐力1,張阿強1,陳錫明2

(1.蘭州交通大學化學與生物工程學院,甘肅蘭州 730070;2.中國科學院寒區旱區環境與工程研究所,甘肅蘭州 730000)

利用產朊假絲酵母和從棉籽殼上分離得到的細菌M2對棉粕進行混合固態發酵。通過分子生物學鑒定M2為產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca),在NCBI中獲得登錄號為KT962208。通過采用DPS v7.05統計軟件中的二因子有重復觀察值實驗和均勻優化實驗分別對固態發酵的接種量和接種及發酵溫度、時間和初始含水量進行優化,并對實驗數據進行分析。結論:得出混菌固態發酵棉粕的最佳接種量為4 mL/100 g,產朊假絲酵母與M2的接種比為7∶3,發酵溫度32.5 ℃,發酵時間54 h,底物初始含水量75%。此條件下游離棉酚的降解率為53.021%,粗蛋白含量為45.889%,且蛋白分子量有所減小。

混菌,固態發酵,棉粕,游離棉酚

棉粕是棉花加工業的主要副產品,其粗蛋白含量在36%～45%之間,含有維生素和礦物質元素等多種營養物質,是一種較好的植物源蛋白飼料資源[1-4]。棉粕中的游離酚對動物機體有毒害作用,還有抗營養因子植酸、單寧、環丙烯脂肪酸等,限制了它在畜牧養殖業中的應用[5]。因此,對棉粕進行脫毒處理,成為開發其利用價值的一項重要研究。微生物發酵是降低棉酚含量的有效方法之一[6]。

利用微生物發酵棉粕脫毒的方法可以不同程度消除游離棉酚對動物體的毒害作用,若用能降解游離棉酚的益生菌發酵,還可以改善動物體的腸道微生態環境,促進動物對營養物質的吸收等。武漢工業學院的王小磊[7]等人對黑曲霉、米曲霉與釀酒酵母混合固態發酵對棉粕脫毒的發酵條件的研究,發酵后棉粕中游離棉酚的降解率達到96.2%;Xiao-Yan Weng[8]等人通過利用熱帶假絲酵母ZAU-1(Candida tropicalis ZAU-1)發酵棉粕,游離棉酚的降解率達到94.12%。研究表明還可以利用棉粕作輔料來生產單細胞蛋白,如Anupama[9]等人利用玉米粉等來研究黑曲霉(Aspergillus niger)單細胞蛋白的生成條件。本研究采用馮莉[10]對接種量和接種比及發酵參數優化所采用的實驗設計方法,對產朊假絲酵母和M2混合發酵棉粕的工藝參數進行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

棉粕、麩皮、玉米粉市場。

產朊假絲酵母(31272)中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC);M2從實驗室提供的棉籽殼中分離獲得。

正己烷利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司;異丙醇天津市凱信化學工業有限公司;3-氨基-1-丙醇上海麥克林生化科技有限公司;冰乙酸利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司;苯胺上海中泰化學試劑有限公司;實驗室所用試劑均為分析純。

SW-CJ-1B型雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;LDZX-50FA型高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠;HNY-1102C恒溫培養振蕩器天津市歐諾儀器儀表有限公司;722s型可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司;JSP-100型多功能高速粉碎機浙江省永康市金穗機械制造廠;KDN-08A凱氏定氮儀上海昕瑞儀器儀表有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養基的制備初篩培養基:醋酸棉酚無糖查氏培養基,硫酸銨0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、氯化鈉0.01%、硫酸鎂0.05%、氯化鈣0.1%、酵母膏0.02%、醋酸棉酚0.2%(用丙酮溶解),自然pH,固體培養基加瓊脂1.8%～2%,在121 ℃下,滅菌20 min。

復篩及固態發酵培養基:棉粕+玉米粉+麩皮=6∶2∶2,按比例稱取共30 g,置于480 mL組培瓶中,自然pH,在121 ℃下,滅菌20 min,然后按70%初始含水量將定量的無菌水加入組培瓶中,攪拌均勻,備用。

LB培養基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化鈉1%,自然pH,固體培養基加瓊脂1.8%～2%,在121 ℃下,滅菌20 min。

YPD培養基:葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%,自然pH,固體培養基加瓊脂1.8%～2%,在121 ℃下,滅菌20 min。

1.2.2菌種篩選稱取1 g棉籽殼,加入裝有50 mL液體醋酸棉酚無糖查氏培養基的三角瓶中,30 ℃下,150 r/min培養24 h后,梯度稀釋,然后分別吸取200 μL稀釋液,均勻涂布在醋酸棉酚無糖查氏培養基平板上,28 ℃下培養,待長出單菌落后,挑去單菌落純化。將純化后的菌株接于種子液中,待生長至對數期,以干物質質量的8%接種于固態發酵進行復篩。

1.2.3菌株鑒定對復篩得到的菌株進行分子生物學鑒定,即提取復篩所得菌株的16S rDNA,送至測序公司進行測序。

1.2.4復合固態發酵將酵母菌活化在YPD固體培養基上,28 ℃下培養48 h后,用接種環挑去3環接種于50 mL YPD液體培養基中,30 ℃、150 r/min培養20 h,備用。

將復篩所得菌株(M2)活化,接種于種子液培養基,生長至對數期,備用。

復合發酵接種量和接種比的優化采用DPS v7.05統計軟件中的二因子有重復觀察值的設計方法,如表1所示,接種量和接種比分別以4水平和5水平設計,實驗共設20個處理組,每個處理組3個重復。測定指標為發酵產物中游離棉酚的降解率。

表1　產朊假絲酵母和M2接種量和接種比優化的因子與水平

復合發酵工藝參數包括發酵溫度、時間、初始含水量3個因素,實驗采用DPS v7.05統計軟件設計3因素4水平的均勻設計實驗法優化發酵參數,如表2所示。復合固體發酵條件參數的優化設計方案如表3所示,實驗共設4個處理組,每個處理組3個重復。測定指標為發酵產物中游離棉酚的降解率。

表2　復合固態發酵工藝參數的因子水平

表3　復合固態發酵工藝參數的優化均勻設計方案

1.2.5指標測定方法游離棉酚的降解率:

游離棉酚的測定:采用國標標準GB13086-91,飼料中游離棉酚的測定方法。

粗蛋白含量的測定:參照GB/T 6432-94,飼料中粗蛋白測定方法。

蛋白質分子量的測定:SDS-PAGE[11]。

2　結果與分析

2.1菌株篩選

實驗初篩得到3株能在醋酸棉酚無糖查氏培養基上生長的菌,兩株細菌M1和M2,一株絲狀真菌M3,然后以8%的接種量接入固態發酵底物中,細菌發酵48 h,真菌發酵60 h后,經測定所得結果如圖1所示。

圖1　初篩菌株固態發酵對游離棉酚的降解率 Fig.1　The degradation rate of free gossypol by screening strains solid state fermentation

由圖1可以得出,初篩所得的3株菌對游離棉酚的降解能力不同,由強到弱依次是:M2>M1>M3,對游離棉酚的降解率分別是36.599%、33.132%、14.297%。3株菌中M2對游離棉酚的降解率最大,因此,對M2進行分子鑒定,并與產朊假絲酵母對棉粕復合固態發酵。

表4　二因子有重復觀察值實驗結果

注:同行同項數據肩標大寫字母不同表示差異極顯著(p<0.01),小寫字母完全不同表示差異顯著(p<0.05),含有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。2.2菌株鑒定

對復篩所得對游離棉酚降解能力較強的菌株M2進行分子生物學鑒定,提取M2的DNA,并用通用引物擴增:上游引物為5′-GAGCGGATAACAA TTTCACACAGG-3′,下游引物為5′-CGCCAGGGTTTT CCCAGTCACGAC-3′,PCR擴增產物電泳結果如圖2所示,擴增后送至測序公司進行測序。通過BLAST將M2的擴增序列進行比對,得出菌株M2與產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)相似性為99%。將M2的擴增序列提交至GenBank,獲得登錄號為KT962208。

圖2　PCR電泳圖Fig.2　Electrophoresis map of PCR 注:M為Mark;1為空白對照;M2為目的片段。

2.3復合發酵接種量和接種比的優化

適宜的接種量對固態發酵培養基中菌體的生長影響較大,適宜的接種量不僅可以縮短菌株生長的延滯期,以減少發酵時間,而且還可使菌體迅速生長、繁殖,占據整個培養的環境,以減少雜菌的污染。通過DPS v7.05對表4中的實驗數據進行統計處理,得到表5所示的不同接種量與接種比對棉粕發酵底物中游離棉酚降解率的影響。

表5　不同接種量與接種比例對棉粕發酵底物中游離棉酚降解率的影響

注:同行同項數據肩標大寫字母不同表示差異極顯著(p<0.01),小寫字母完全不同表示差異顯著(p<0.05),含有相同字母表示差異不顯著。由表5可得,當接種量為4、6、8 mL/100 g時,隨著接種量的增加,降解率逐漸降低,接種量為4 mL/100 g時,降解率最大,為42.628%,且差異極顯著(p<0.01);當接種量為10 mL/100 g時,降解率為41.385%,且差異不顯著,其原因可能是發酵底物沒有攪拌均勻。隨著接種比的變化,降解率先升高后降低,產朊假絲酵母與M2的比例為7∶3時,降解率最大,為43.355%,差異極顯著(p<0.01)。因此,兩種菌的最佳組合為A1B4,即接種量為4 mL/100 g,接種比為7∶3。

通過表5還可得出,接種量、接種比及其互作對游離棉酚降解率的影響都極顯著(p<0.01),其主次效應順序為接種量(A)、互作效應(A×B)、接種比(B)。

2.4復合發酵工藝參數的優化

采用DPS v7.05統計軟件,以游離棉酚的降解率作為目標函數Y,對表6的實驗數據進行逐步回歸分析,得到線性回歸方程:Y=26.50-0.76X1+0.48X3,X2與游離棉酚的降解率回歸關系非常小,因而在回歸方程中被剔除。經統計分析,該方程的決定系數R2=0.9964,表明該回歸方程與實驗結果符合度極好。溫度(X1/ ℃)、初始含水量(X3/%)與Y的偏相關系數分別為-0.9904、0.9978,經檢驗,X3對游離棉酚的降解率有極顯著的影響(p<0.01),而X1對游離棉酚的降解率有顯著的影響(p<0.05)。由回歸方程可得,游離棉酚的降解率與X1呈負相關,與X3呈正相關,因此最佳的發酵條件為溫度32.5 ℃,發酵時間為54 h,底物初始含水量為75%。

表6　固態發酵工藝參數的優化實驗結果

2.5發酵物中粗蛋白含量及蛋白分子量的變化

由表7可知,當接種量為4 mL/100 g,產朊假絲酵母與M2的接種比為7∶3,發酵溫度32.5 ℃,發酵時間54 h,底物初始含水量75%時,游離棉酚的降解率為53.021%,與上述實驗結果相符。發酵后底物中粗蛋白含量為45.889%,與發酵前相比,升高了2.037%,其原因可能是產朊假絲酵母的菌體蛋白。由圖3可知,發酵后的蛋白分子量與發酵前相比相對較小,大分子蛋白在一定程度上有所減少。

表7　驗證實驗結果

圖3　SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis注:1.Mark;2.對照組;3,4,5.實驗組。

3　結論

首先,從棉籽殼中分離出一株能降解游離棉酚的細菌M2,并鑒定為為產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca),讓其與產朊假絲酵母復合固態發酵棉粕,得出這兩株菌復合發酵對游離棉酚的降解率與它們分別發酵時的降解率高,這說明這兩株菌之間沒有拮抗作用,可能存在互利共生的作用。通過實驗優化,得到其最佳發酵工藝參數為接種量為4 mL/100 g,產朊假絲酵母與M2的接種比為7∶3,發酵溫度32.5 ℃,發酵時間54 h,底物初始含水量75%,pH自然。在此條件下游離棉酚的降解率最高,達到53.021%。

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Optimization of the process parameters of cottonseed cake by solid-state fermentation with mixed culture

LIU Hui-qin1,TIAN Yong-qiang1,*,XU Li1,ZHANG A-qiang1,CHEN Xi-ming2

(1.Lan Zhou Jiao Tong University,Chemical and Biological Engineering College,Lanzhou 730070,China; 2.Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

By using Candida utilis and bacteria M2 that was isolated from cottonseed shell to be solid-state fermentated cottonseed meal. Molecular identification showed that M2 was Klebsiella oxytoca and the login number was KT962208 in the NCBI. By using the two factors have repeated observation value test and uniform design test of DPS v7.05 statistical software to respectively optimize inoculum and inoculation ratio,and the fermentation temperature,time and initial containing water of solid state fermentation.And analyzed these experimental data. Finally,come to the conclusion that the best inoculation amount was 4 mL/100 g and the inoculation ratio of Candida utilis yeast and M2 was 7∶3,the fermentation temperature was 32.5 ℃,time was 54 h,initial containing water was 75%. Under this kind of condition,the degradation rate of gossypol was 53.021%,the crude protein content was 45.889%,and the molecular weight of the protein has slightly decreased.

mixed bacteria;solid state fermentation;cottonseed meal;free gossypol

2016-01-14

劉惠琴(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：工業微生物發酵，E-mail：huiqin4625@163.com。

田永強(1972-)，男，博士，教授，從事微生物分離、鑒定和應用研究，E-mail：357181873 @qq.com。

甘肅省科技支撐計劃項目(613035)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)17-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.033