一株冬蟲夏草相關菌株的生物學特性

謝　放，張　育，朱玉蘭

(蘭州交通大學 化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070)

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一株冬蟲夏草相關菌株的生物學特性

謝放，張育，朱玉蘭

(蘭州交通大學 化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070)

從冬蟲夏草蟲體上分離得到一株真菌，對其生物學特性和侵染力，及其與冬蟲夏草菌的相互關系進行了初步研究，并對其進行了分子鑒定。結果表明，該菌絲生長的最適溫度為20～23 ℃，最適pH為7.50，最適碳氮源分別是蔗糖和麩皮，對蝙蝠蛾幼蟲的侵染力為100%，并在與冬蟲夏草菌平板對峙生長中發現其對冬蟲夏草菌的生長抑制率高達43.37%。PCR結果顯示，從菌絲體中擴增獲得了560 bp左右的一段ITS序列，系統發育分析表明，該菌是白僵菌，GenBank登錄號為KP284435。

白僵菌；冬蟲夏草；生物學特性；侵染力

冬蟲夏草是冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲而形成的蟲菌復合體。長期以來，冬蟲夏草菌的分離鑒定一直備受關注，但迄今仍未實現科赫法則條件下冬蟲夏草菌的認定。前人對冬蟲夏草菌有以下不同的看法：郭英蘭等[1]、魏鑫麗等[2]、劉錫琎等[3]通過組織和子囊孢子多途徑、多批次分離試驗證明，中國被毛孢就是冬蟲夏草菌的無性型；趙錦等[4]、李增智等[5]利用rDNA的ITS序列分析和RAPD-PCR技術也得到了中國被毛孢是冬蟲夏草菌的無性型的相關證據；朱佳石等[6-7]、高凌等[8]認為冬蟲夏草菌是多種突變基因型菌(一組真菌)；姚藝桑等[9]通過分子生物學方法證實天然冬蟲夏草子座中存在多個突變基因型菌，并隨著冬蟲夏草的成熟，其在僵蟲體和子座中差異性表達；朱佳石等[6]也發現，蝙蝠蛾擬青霉和中國被毛孢真菌共存于冬蟲夏草的蟲體和子座中；許多研究認為冬蟲夏草菌是多種真菌的總稱[10-14]，幸興球[11]指出冬蟲夏草的無性型可能由至少8種真菌組成，梁宗琦等[12]則提出冬蟲夏草是一個多種菌共存的復雜統一的微生態系統，張永杰等[13]、楊金玲等[14]也認為天然冬蟲夏草中除了中國被毛孢外還存在多種其他真菌。以上這些研究均是圍繞冬蟲夏草菌展開的，但有關冬蟲夏草相關菌對冬蟲夏草菌的影響，以及相關菌株與冬蟲夏草菌之間的對峙研究和回接侵染蝙蝠蛾幼蟲方面的研究均相當有限。本試驗在冬蟲夏草蟲體上分離得到一株真菌，分析了該菌的生物學特性，以及其對蝙蝠蛾幼蟲的侵染力；并且通過平板對峙試驗對該菌株與冬蟲夏草菌之間的關系進行了研究，以期為冬蟲夏草相關菌株的開發利用和冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲的研究提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

1-1菌株分離自甘肅省甘南州夏河縣榨油溝鄉拉代牧場冬蟲夏草的蟲部。供試冬蟲夏草菌(FN570054，HirsutellasinensisFang. X&J. H. Li Fang. X，2013-01-05)[15]，現保存于蘭州交通大學化學與生物工程學院生物種苗工程研究所。蝙蝠蛾幼蟲采自甘肅省武威市天?？h抓喜秀龍鄉代乾牧場。

1.1.2培養基

牛奶培養基：鮮牛奶200 mL，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水解乳蛋白5 g，酵母粉1 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫鉀1 g，復合維生素B 1片，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.1.3其他

HP Fungal DNA Kit試劑盒、引物、Taq酶、dNTP 等購自上海生物工程公司。

1.2方法

1.2.1形態學觀察及鑒定

觀察記錄菌落、菌絲和孢子形態特征，并用數碼相機拍照，用MOTIC B顯微鏡觀察、測量和拍照微觀產孢結構。

1.2.2最佳溫度和最適pH篩選

據單因子試驗設計，將活化好的菌絲體塊用9 mm的打孔器打孔分別接種于培養基中，倒置于16，20，23，26 ℃培養箱中恒溫避光培養；將活化好的菌絲接種于pH值分別為4.5，5.5，6.5，7.5，8.5的培養基，倒置于23 ℃恒溫培養。每個處理均設3組平行，觀察記錄。

1.2.3最佳碳氮源篩選

以牛奶培養基中20 g葡萄糖的含碳量為標準，分別以相等含碳量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉代替基礎培養基中的葡萄糖，并以不添加碳源的基礎培養基為對照；以牛奶培養基中200 mL牛奶的含氮量為標準，分別以相等含氮量的蠶蛹粉、黃豆粉、麩皮代替基礎培養基中的牛奶，并以不添加氮源的基礎培養基做對照。

1.2.4平板對峙試驗

將活化好的1-1菌株和冬蟲夏草菌分別用9 mm的打孔器打孔，放置在牛奶培養基中相距3 cm的位置，16 ℃培養。每個處理設3組平行，觀察記錄，并按以下方法計算抑菌率和拮抗系數。

抑菌率/%=[(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑]×100

拮抗系數分級標準[16]：Ⅰ，白僵菌占據平皿100%；Ⅱ，白僵菌占據平皿≥3/4；Ⅲ，白僵菌占據平皿<3/4，≥2/3；Ⅳ，白僵菌占據平皿<2/3，≥1/3；Ⅴ，白僵菌占據平皿<1/3；Ⅵ，冬蟲夏草菌占據平皿100%。

1.2.5回接侵染試驗

用涂有孢子懸浮液的胡蘿卜喂養蝙蝠蛾幼蟲，每隔5 d換食1次，每天觀察1次，并拍照記錄幼蟲感染情況。

1.2.6菌絲日均長速的測定

菌絲將近長滿平皿而未滿平皿時作為測量終點進行測量。

菌絲日均長速(mm·d-1)=[(菌落直徑-9)/2]/培養天數，最后取3組平行的均值。

1.2.7菌落干重的測定

采用重量法進行測定[17]。

1.2.8DNA提取和PCR擴增

在PDA培養基上23 ℃培養10 d，取新鮮培養物，用試劑盒提取總DNA。PCR擴增：引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系(25 μL)：Mix 12.5 μL，引物ITS1和引物ITS4均為0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。產物檢測：在添加Goldview的1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳20 min檢測。

1.2.9序列分析

PCR產物的純化和DNA測序：由上海美吉生物科技有限公司完成。

2　結果與分析

2.1形態描述

該菌在PDA培養基上生長迅速，菌落白色，菌絲呈絮狀，邊緣整齊，背面略顯黃色，該菌在生長后期菌落邊緣長出基礎寬，頂端細的孢梗束，孢梗束為白色，均勻分布在菌落邊緣，其長度可達到1.0～1.5 cm。菌絲透明，有隔，表面光滑，粗細均勻，寬2～3 μm，分生孢子梗呈瓶梗狀，孢子橢圓形，鏈狀，大小為(3～4 )μm×(1.5～2.5) μm(圖1)。

2.2PCR擴增

用試劑盒提取1-1菌株的基因組DNA為模板，選取ITS1和ITS4作為一對通用引物，進行PCR擴增，結果如圖2所示，所得的產物片段大小為560 bp左右，條帶明亮清晰，無拖尾現象，表明該法提取的基因組DNA質量較好，并滿足基于PCR反應的后續分子生物學試驗研究。

a. 菌落形態； b. 菌絲結構； c，d. 孢子梗和孢子結構。圖1　1-1菌株的菌落、菌絲體和孢子形態Fig.1　The morphology of colony， mycelium and spores of strain 1-1

M： 分子量標準。圖2　菌絲體基因組DNA PCR擴增的ITS片段Fig.2　ITS-PCR product amplificated from genomic DNA of mycelium

2.3系統發育分析

將測序結果提交至GenBank，獲得登錄號為KP284435。在NCBI網站上用BLAST程序進行序列比對，選取相似性較高的菌株，用ClustalX 1.83軟件對1-1菌株和一些已知種進行了多序列比對，用MEGA 4.1軟件，用鄰接法自展值為1 000次的計算構建系統發育樹(圖3)。結果表明，1-1菌株與白僵菌的遺傳關系最近，相似度高達100%，并以100%的支持率處于一個分支中，因此鑒定該菌屬于白僵菌屬。

圖3　依據ITS基因序列構建的系統發育樹Fig.3　Neighbour-joining phylogenetic tree based on ITS gene sequences

2.4最適溫度篩選

1-1菌株在不同溫度下的生長情況見表1，該菌在16～26 ℃范圍內都能生長，但長速和干重存在差異：在20 ℃時菌絲長速最快，而在23 ℃時，積累的干重最多；溫度超過23 ℃時，菌落干重積累量隨之減少，因此，該菌菌絲生長的最適溫度為20～23 ℃，而在劉召等[18]的研究中白僵菌菌絲最適生長溫度為28 ℃，可能不同地理來源的菌株，其菌絲生長的溫度范圍不同[19]。

表1不同溫度對菌絲生長的影響

Table 1Effect of different temperatures on the growth of mycelia

溫度/℃菌落直徑/cm菌落干重/g162.8667bB0.1033cB204.6667aA0.1267bB234.2333aA0.1733aA262.4667bB0.1000cB

注：同一列不同行數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.5最佳pH篩選

pH試驗結果表明(表2)，1-1菌株在pH值為4.50～8.50的范圍內均能生長，且在不同pH值下菌株生長狀況差異不大，pH值為4.50時，菌絲生長緩慢，菌絲稀疏；隨著pH值的增大菌絲長速和菌落干重均表現出先增加后減弱的趨勢。其中pH值為7.50時菌絲的生長速率和干重均達最大，因此該菌絲最適生長pH為7.50。這與張曉敏等[20]對白僵菌的研究結果一致。

表2不同pH值對菌絲生長的影響

Table 2Effect of different pH values on the growth of mycelia

pH值菌落直徑/cm菌落干重/g4.504.25000.0867bAB5.504.68330.1000bAB6.504.86670.1400aAB7.504.99330.1467aA8.504.56000.0800bB

2.6最適碳源篩選

由表3可知，1-1菌株在沒有添加額外碳源的情況下也能正常生長，說明菌株能利用多種碳源，但長速和干重存在較大差異。其中以葡萄糖為碳源時菌絲長速最快，蔗糖次之，但總體而言，不同碳源對菌絲生長的影響差異性不大。就干重來說，以蔗糖為碳源時菌落質地緊密，長勢好，積累的干重最多。因此，該菌的最適碳源為蔗糖，說明該菌能較好地利用雙糖。試驗中發現不同的碳源對菌株干重積累的影響與對菌絲長速的影響不同，可能是豐富的營養物質促使菌落密度的加厚和分枝的增多有關，如Suzuki等[21]研究表明；合適的碳氮營養素能夠增加真菌中部分生長因子，更有利于菌絲生長。

表3不同碳源對菌絲生長的影響

Table 3Effect of different carbon sources on the growth of mycelia

碳源菌落直徑/cm菌落干重/g葡萄糖4.7750aA0.1467aA麥芽糖3.7900bB0.1300aA蔗糖4.7000aA0.1767aA淀粉4.4333aA0.1367aA無碳源3.4500bB0.0800bB

2.7最佳氮源篩選

在沒有添加額外氮源的情況下，1-1菌株依然生長良好，說明其能利用多種氮源，但長速和干重存在較大差異。其中不同的動植物蛋白對菌絲生長差異性不顯著，而以麩皮為氮源的培養基中的菌落直徑和干重積累量達到最大，牛奶次之(表4)。因此，該菌的最適氮源為麩皮，因為麩皮除能提供氮源外，還提供了有利于該菌生長的碳素營養和生長因子，從而促使營養平衡和物質轉化。

表4不同氮源對菌絲生長的影響

Table 4Effect of different nitrogen sources on the growth of mycelia

氮源菌落直徑/cm菌落干重/g牛奶3.19000.0667abA蠶蛹粉3.09000.0467cAB黃豆粉2.71000.0533bcAB麩皮3.26670.0733aA無氮源2.89330.0367cB

2.81-1菌株與冬蟲夏草菌之間的關系

1-1菌株與冬蟲夏草菌之間的相互關系如圖4所示，對照組中的冬蟲夏草菌在20 d時菌絲生長進入對數期，并隨著時間的推移菌落半徑也逐步增大，到30 d時菌落半徑達1.9000 cm；而處理組中冬蟲夏草菌的生長速度很慢，在第30天冬蟲夏草菌菌落直徑只有1.1663 cm。說明白僵菌對冬蟲夏草菌的生長產生了明顯的抑制作用，30 d時白僵菌對冬蟲夏草菌的抑制率為43.37%，拮抗系數達到Ⅲ級。在培養后期發現白僵菌與冬蟲夏草菌菌落發生重疊，重疊部分白僵菌將冬蟲夏草菌覆蓋，顯微觀察發現該區域中白僵菌菌絲與冬蟲夏草菌菌絲并列生長。該菌與冬蟲夏草菌之間的關系到底是空間競爭還是營養競爭，還需做進一步的試驗。

圖4　平板對峙實驗中該菌株對冬蟲夏草菌的影響Fig.4　Effect of the strain 1-1 on Ophiocordyceps sinensis in table confrontation experiment

2.91-1菌株回接侵染蝙蝠蛾幼蟲試驗

1-1菌株侵染蝙蝠蛾幼蟲后第6天，幼蟲開始死亡，共死亡20頭，菌株對蝙蝠蛾幼蟲的侵染率高達100%。死亡的幼蟲皮膚呈黃色，身體僵硬，死亡后第2天，幼蟲身體開始長出均勻的菌絲，菌絲呈白色，質地疏松。第6天時菌絲布滿全身，死亡9 d后菌絲開始大量生長，與培養基上的菌落形態一致，待死亡后第24天，可以看見邊緣有孢梗束長出(圖5-c箭頭所示)，說明該菌對蝙蝠蛾幼蟲有較高的侵染率，是蝙蝠蛾幼蟲的致病菌。

a： 死亡第2天； b： 死亡第15天； c： 死亡第24天； d： 死亡第50天。圖5　蝙蝠蛾幼蟲侵染試驗結果Fig.5　Results of Hepialidae larva infection test

3　討論

在平板對峙試驗中，1-1菌株對冬蟲夏草菌抑制效果明顯，其具體原因是營養競爭，空間競爭，還是產生了其他的抗生物質？由于兩者在對峙中沒有明顯的抑菌分界線，且冬蟲夏草菌落生長沒有表現出偏心現象，可判斷他們之間沒有拮抗作用；其次，在對峙生長后期，該菌繼續在冬蟲夏草菌的菌落上生長直至全部覆蓋，通過顯微觀察發現，該菌菌絲與冬蟲夏草菌菌絲并列生長，對該現象的深入分析還需進一步的細胞學試驗驗證。如果細胞學試驗發現，菌絲被穿透、細胞萎縮等被寄生后的特有現象，方可確定該菌與冬蟲夏草菌之間是重寄生關系，否則就是營養競爭或者空間競爭關系。再次，這種抑制作用是否受到培養條件的影響也需進一步研究，作者曾添加蝙蝠蛾幼蟲體液培養冬蟲夏草菌，表現出生長迅速，暗示在更適宜的條件下，冬蟲夏草菌生長表現可能完全不同。如果僅僅是營養競爭關系，則抑制效果就可能不同。

回接侵染試驗結果說明，該菌也是寄生蝙蝠蛾幼蟲的致病菌，但在冬蟲夏草蟲體上分離得到意味著它可能有一定作用。馬少麗等[23]的研究表明，對蝙蝠蛾幼蟲具有侵染力的相關菌株與冬蟲夏草菌的復合侵染可將侵染率由原來的4%提高至50%。本供試菌對蝙蝠蛾幼蟲具有很高的侵染力，但是否也具有提高冬蟲夏草菌對蝙蝠蛾幼蟲的侵染率，還需要復合侵染試驗加以驗證。

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(責任編輯張韻)

Biological characteristics of a strain of Ophicordyceps sinensis related fungi

XIE Fang， ZHANG Yu， ZHU Yu-lan

(SchoolofChemicalandBiologicalEngineering，LanzhouJiaotongUniversity，Lanzhou730070，China)

A preliminary study was carried out to investigate the biological characteristics， infection rate of a fungus isolated fromOphicordycepssinensis， as well as its relationship withOphicordycepssinensis， and the molecular identification was analyzed. The results showed that the optimum temperature and pH for culture was 20 to 23 ℃ and 7.50 respectively. The optimum carbon sources and nitrogen sources was sucrose and bran. The infection rate onHepialidaelarva was 100%. The inhibition rate onOphicordycepssinensiswas 43.37% in flat confrontation test. PCR results showed that about 560 bp ITS fragments were amplified from the mycelium. Phylogenetic analysis indicated that the fungi belonged toBeauveria， and GenBank accession number is KP284435.

Beauveria;Ophicordycepssinensis; biological characters; infection

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.21

2015-06-15

甘肅省科技支撐基金(212256)

謝放(1962—)，男，甘肅蘭州人，博士，副教授，研究方向為資源與環境微生物。E-mail：1004389243@qq.com

Q935

A

1004-1524(2016)02-0306-06

謝放，張育，朱玉蘭. 一株冬蟲夏草相關菌株的生物學特性[J].浙江農業學報，2016，28(2)： 306-311.