重金屬Cr6+耐受細菌的篩選研究

姜　蒙，王　偉

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

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重金屬Cr6+耐受細菌的篩選研究

姜蒙，王偉*

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

土壤中重金屬Cr6+污染日益嚴重，其對植物的影響也越來越大，并可通過食物鏈富集進入人和動物體內，從而危害人畜健康。試驗在分別添加0.3和0.5 g·kg-1Cr6+的土樣中進行耐性菌株的篩選，以期為微生物修復重金屬污染提供技術支持。結果表明，該研究共獲得了9株具有較好Cr6+耐性的菌株。它們均可在含0.5，1.0 mmol·L-1Cr6+的LB培養基中生長。其中，編號為J3，J5，J8的菌種耐性達到2 mmol·L-1，在含2 mmol·L-1Cr6+的液體培養基中培養48 h后，培養基中的Cr6+含量分別降低23%，36%，7%。經測定，上述3種菌分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、沙福芽孢桿菌(Bacillussonorensis)。

重金屬Cr6+；重金屬耐性；土壤修復

重金屬鉻主要通過工業生產被釋放到環境中，比如皮革鞣制、電鍍和鉻酸鹽生產等[1]。鉻進入作物體內主要積累在根部細胞，并使細胞膜的通透性增大。鉻滲入細胞后可與細胞核內的核酸等大分子物質結合，抑制包括ATP酶在內的多種酶的活性，影響細胞正常的有絲分裂，并使DNA發生凝集，導致染色體發生斷裂和畸變。此外，鉻還可通過食物鏈富集進入人和動物體內，引發癌癥等疾病，危害人畜健康，如水俁病、骨痛病等都是典型例證。因此，其在食品、水、土壤里的含量應受到嚴格的控制[2]。

目前，我國部分地區土壤遭受鉻污染，嚴重危及糧食生產與人畜安全。傳統的對重金屬污染進行治理的方法主要是物理化學方法，但是該方法花費高，需要消耗大量的資源和專業設備，而且可能引發二次污染[3]。因此，迫切需要針對鉻污染土壤探索、建立適宜的治理方法。近年來，微生物修復技術應運而生。該方法主要利用環境中的微生物對土壤進行修復，對環境的擾動較小，且成本遠低于傳統的物理化學方法。本文主要針對土壤中以重鉻酸鹽形式存在的六價重金屬鉻(Cr6+)，篩選耐性細菌，探討其對重金屬鉻的耐受性和修復能力，以期為土壤中Cr6+的生物修復提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1土壤樣品

于2012年6月取自無重金屬污染的菜田，土壤為典型的灰潮土，pH 7.62。土壤總有機碳平均含量為(10.38±0.97) g·kg-1。

1.2試驗方法

1.2.1土壤樣品的處理

取回的土壤去除雜質并自然風干后過2 mm篩備用。在每個盆里放置1 000 g土壤樣品，以重鉻酸鈉的形式向土壤中添加Cr6+，分別調節其離子濃度至0.3和0.5 g·kg-1，每個處理重復3次。第60天取土壤樣品進行耐鉻細菌的篩選。

1.2.2耐性菌株的篩選及鑒定

菌種篩選采用稀釋平板涂布法，挑選單菌落保存菌種。對所挑選出的單菌落進行菌種形態鑒定，對初步篩選的菌株進行歸類合并；之后，進一步對菌株進行分子生物學鑒定和生理生化鑒定。

1.2.3耐性菌株總DNA提取

采用Wilson方法[4]分別提取篩選到的耐性細菌總DNA。

1.2.4耐性菌株16S rDNA擴增

對提取到的細菌總DNA進行16S rDNA基因PCR擴增，選用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[5]。擴增反應體系如下：總反應體積50 μL，包括10×loading buffer (Mg2+plus) 5 μL，引物(10 μmol·L-1)各2 μL，dNTP mixture(2.5 mmol·L-1each)4 μL，模板1 μL，5 U·μL-1的TaKaRa rTaq酶0.25 μL，用超純水補足體積至50 μL。細菌16S rDNA基因的擴增條件參照Don等[6]。擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。

1.2.516S rDNA回收測序

對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在切膠儀中對目的條帶進行切膠回收，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對回收條帶進行純化再回收。并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和亮度。純化后的PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，結果與NCBI基因庫中所有已測定的原核生物16S rDNA序列進行比對[7]。用MEGA 5.1軟件對所測序列和同源序列進行分析，構建系統發育樹。

1.2.6菌株Cr6+耐受性測定

為檢測所篩選菌株對重金屬Cr6+的耐受程度，將菌株在LB培養基中培養，調節pH為7.5。培養基經高壓滅菌后，重金屬鉻以Na2Cr2O7形式經過濾器消毒滅菌添加，Cr6+終濃度分別設置為0.5，1，2，3 mmol·L-1。

將含Cr6+培養基上形成的菌落與對照相比，定性篩選出耐受性較強的菌株。

1.2.7耐受菌種Cr6+降解能力測定

將上述分離得到的具有較好耐受性的菌株培養在Cr6+濃度分別為1和2 mmol·L-1的液體培養基中，25 ℃恒溫搖床培養48 h，同時設置對照組，即將耐受菌株培養在未添加Cr6+的液體培養基中。Cr6+含量采用全譜直讀等離子體發射光譜儀(ICP-AES)測定[8]。

2　結果與分析

2.1菌株Cr6+耐性及降解力

結果顯示，本試驗從土壤中分離得到的9種菌株在含有0.5和1 mmol·L-1Cr6+的培養基上均有菌落形成，但J1，J2，J4，J6，J7，J9在含1 mmol·L-1Cr6+的培養基上長勢已明顯變弱，只有J3，J5，J8菌株能在含2 mmol·L-1Cr6+的培養基上形成菌落，認定這3個菌株具有較強的Cr6+耐性。

將J3，J5，J8菌株進一步轉移至含1 mmol·L-1Cr6+的液體培養基上培養，48 h后，J3，J5，J8菌株所在培養基中的Cr6+含量分別降低62%，67%，37%。當液體培養中的Cr6+濃度進一步增大到2 mmol·L-1時，J3，J5，J8菌株對Cr6+的降解能力減弱，培養基中的Cr6+含量分別降低23%，36%，7%。

2.2Cr6+耐受菌株生理生化特性鑒定

根據形態學觀察發現，本研究所分離得到的耐受細菌(J3，J5，J8)在LB培養基中菌落形態明顯不同，不是同一細菌。經革蘭氏染色、鏡檢，均為革蘭氏陽性菌，桿狀；細菌培養3 d可產生芽孢，初步認定為芽孢桿菌屬。為進一步確定J3，J5，J8的種，根據伯杰細菌鑒定手冊(第8版)所述方法開展糖發酵、V.P試驗、耐熱性等生理生化試驗，結果如表1所示。

表1菌株生理生化試驗結果

Table 1Physiological and biochemical tests of isolated strains

指標J3J5J8接觸酶+++厭氧生長+-+最高生長溫度/℃～50～55～475%NaCl+++7%NaCl++-V.P試驗+++淀粉水解+++明膠水解+++甲基紅試驗+++檸檬酸利用試驗---水解酪素+++葡萄糖發酵+++乳糖發酵---蔗糖發酵+++pH5.7生長-+-馬尿酸鹽水解--+

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

2.3Cr6+耐受菌的分子鑒定結果

將提取的各菌株DNA克隆、測序，結果如表2所示。

為進一步明確J3，J5，J8的種屬關系，構建系統發育樹研究其親緣關系及進化水平，結果如圖2所示。

結合形態特征、培養基特征、生理生化特征和分子生物學鑒定結果以及系統發育樹，J3與Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42(T)在系統發育樹上處于同一分支，親緣關系最近，相似度達到98.257%；J5與BacilluslicheniformisATCC14580(T)相似度達到98.624%，系統發育樹也顯示親緣關系最近；J8與BacillussonorensisNRRLB-23154(T)處于系統發育樹上同一分支，但節點值較低，而且相似度僅為95.494%。據此，初步確定J3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，J5為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，J8為沙福芽孢桿菌(Bacillussonorensis)。

3　討論

Cr6+的毒害作用主要是由于它能引起細胞發生氧化應激反應，破壞細胞膜并損害DNA[9]。鉻鹽有鉻酸鹽和重鉻酸鹽兩種形式，在過去二十年中，幾乎大部分細菌修復作用的研究都是針對鉻酸鹽的耐受性及修復能力，對重鉻酸鹽的研究極少[10]。因此，本研究主要針對重鉻酸鹽污染，篩選耐Cr6+細菌。

表2菌種測序結果

Table 2Sequencing results of tested strains

菌株細菌學名菌株獲取號相似度/%J1BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489798.969Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846798.777BacillussiamensisPD-A10(T)GQ28129998.638J2BacilluslicheniformisATCC14580(T)AE01733398.182Bacillusaerius24K(T)AJ83184398.092BacillussonorensisNRRLB-23154(T)AF30211897.835J3Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846798.825Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42(T)CP00056098.257Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB3610(T)FN59764497.672J4BacillussafensisFO-036b(T)AF23485499.291Bacillusstratosphericus41KF2a(T)AJ83184199.134Bacillusaltitudinis41KF2b(T)AJ83184299.134J5BacilluslicheniformisATCC14580(T)AE01733398.624BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489797.222J6BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489799.481Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846799.054J7Bacillustequilensis10b(T)HQ22310798.036BacillusatrophaeusJCM9070(T)AB02118197.950BacillusmojavensisIFO15718(T)AB02119197.950J8BacillussonorensisNRRLB-23154(T)AF30211895.494Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846795.485J9BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489799.120Bacillusamyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciensDSM7(T)FN59764498.261BacillusvallismortisDSM11031(T)AB02119898.174

圖2　J3，J5，J8菌株的16S rDNA系統發育樹Fig.2　Neighbor-joining phylogenetic tree showing the relationships for 16S rDNA gene sequences of J3， J5， J8 and their closest relatives

針對重金屬污染治理，目前普遍使用的還是傳統的農業防治和工程物理化學方法。如林匡飛等[11]在含鎘100 mg·kg-1的土壤上改種苧麻，5年后，土壤鎘含量平均降低27.6%；Wasay等[12]采用淋洗法，對比弱有機酸鹽(檸檬酸和酒石酸鹽)和強螯合劑(EDTA和DTPA)對重金屬Cr，Mn，Hg，Pb污染土壤修復的有效性，發現EDTA和DTPA能有效地去除Hg以外的重金屬元素，但同時也提取出大量的土壤營養元素；而且，EDTA和DTPA被吸附于土壤顆粒表面，易對土壤造成新的污染。這些方法同時也大都存在花費高、需要消耗大量的資源和專業設備，而且可能引發次生污染等問題。微生物修復的優點是實施較簡便，投資較少，更重要的是對環境破壞小。所以，近年來微生物修復重金屬污染的研究越來越受到科研人員的關注。要采用微生物方法治理重金屬污染，獲得高效的菌種資源是成功的關鍵。目前在細菌、真菌、藻類微生物中均有重金屬耐性菌株報道。如Wang等[13]對國內外重金屬修復相關的微生物，包括細菌、真菌和藻類，進行了比較全面的綜述，并列出各自的修復能力，從其研究中也可以看出，對Cr6+具有較好修復能力的微生物較少。Ziagova等[14]從礦區篩選出對Cd2+和Cr6+有較好修復能力的Pseudomonassp.和S.xylosus兩株細菌，經進一步研究發現，它們對Cr6+的生物吸附能力分別達到95.0和143 mg·g-1。目前，已知的能夠修復Cr6+的真菌種類更少，其能力相對細菌來說也較弱，主要包括：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉菌屬(Penicilliumsp.)和曲霉菌屬(Aspergillussp.)。如Ozer等[15]研究發現，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在25 ℃時對Cr6+吸附達到最大值，但也僅為32.6 mg·g-1。Say等[16]在研究產紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)對水溶液中Cr6+生物吸附時，發現pH對其影響較大，大約在pH 6.0時，生物吸附量最大，達36.5 mg·g-1。目前，報道的對重金屬Cr有修復能力的藻類只有小球藻(Chlorellavulgaris)[17-18]、馬尾藻類海草(Sargassumsp.)[19-20]和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)[18]。

本研究中篩選到3株對Cr6+具有較強耐性的菌株(J3，J5，J8)，均可耐受2 mmol·L-1的Cr6+；并具有較好的修復能力，在含2 mmol·L-1Cr6+的液體培養基中培養48 h，Cr6+含量分別降低了23%，36%和7%，具有潛在的應用價值。經鑒定，它們均屬于芽孢桿菌屬，J3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，J5為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，J8為沙福芽孢桿菌(Bacillussonorensis)。國內外已經有關于地衣芽孢桿菌對Cr6+有修復能力的報道，如Zhou等[21]研究死亡的地衣芽孢桿菌細胞對Cr6+的生物吸附動力學時，發現含鉻300 mg·L-1、pH 2.5、溫度為50 ℃的處理液，其生物吸附量最大，達60.5 mg·g-1。本研究篩選到的3株細菌其耐受Cr6+的原理及修復原理有待進一步研究，對于其修復動力學的研究也將進行，以便在今后的修復應用中發揮最大效用。

[1]徐衍忠， 秦緒娜， 劉祥紅， 等. 鉻污染及其生態效應[J]. 環境科學與技術， 2002， 25(增刊): 8-9.

[2]PAWLISZ A V， KENT R A， SCHNEIDER U A， et al. Canadian water quality guidelines for chromium[J].EnvironmentalToxicology&WaterQuality， 1997， 12(2): 123-183.

[3]BELEZA V M， BOAVENTURA R A， ALMEIDA M F. Kinetics of chromium removal from spent tanning liquors using acetylene production sludge.[J].EnvironmentalScience&Technology， 2001， 35(21): 4379-4383.

[4]WILSON K. Preparation of genomic DNA from bacteria[M]// Current Protocols in molecular biology. New York: John Wiley & Sons， Inc.， 2013: 143-151.

[5]POLZ M F， CAVANAUGH C M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR.[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology， 1998， 64(10): 3724-3730.

[6]DON R H， COX P T， WAINWRIGHT B J， et al. Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.[J].NucleicAcidsResearch， 1991， 19(14): 4008.

[7]PATTANAPIPITPAISAL P， BROWN N， MACASKIE L. Chromate reduction and 16S rRNA identification of bacteria isolated from a Cr(Ⅵ)-contaminated site[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology， 2001， 57(1/2): 257-261.

[8]ATANASSOVA D， STEFANOVA V， RUSSEVA E. Co-precipitative pre-concentration with sodium diethyldithiocarbamate and ICP-AES determination of Se， Cu， Pb， Zn， Fe， Co， Ni， Mn， Cr and Cd in water[J].Talanta， 1998， 47(5): 1237-1243.

[9]REYNOLDS M F， PETERSON-ROTH E C， BESPALOV I A， et al. Rapid DNA double-strand breaks resulting from processing of Cr-DNA cross-links by both MutS dimers[J].CancerResearch， 2009， 69(3): 1071-1079.

[10]FRANCISCO R， MORENO A， MORAIS P V. Different physiological responses to chromate and dichromate in the chromium resistant and reducing strainOchrobactrumtritici5bvl1[J].Biometals， 2010， 23(4): 713-725.

[11]林匡飛， 張大明， 李秋洪， 等. 苧麻吸鎘特性及鎘土的改良試驗[J]. 農業環境科學學報， 1996 (1): 1-4.

[12]WASAY S A， BARRINGTON S， TOKUNAGA S. Organic acids for the in situ remediation of soils polluted by heavy metals: soil flushing in columns[J].Water， 2001， 127(1): 301-314.

[13]WANG J， CHEN C. Biosorbents for heavy metals removal and their future[J].BiotechnologyAdvances， 2009， 27(2): 195-226.

[14]ZIAGOVA M， DIMITRIADIS G， ASLANIDOU D， et al. Comparative study of Cd(Ⅱ) and Cr(Ⅵ) biosorption onStaphylococcusxylosusandPseudomonassp. in single and binary mixtures[J].BioresourceTechnology， 2007， 98(15): 2859-2865.

[15]OZER A， OZER D. Comparative study of the biosorption of Pb(Ⅱ)， Ni(Ⅱ) and Cr(Ⅵ) ions onto[J].JournalofHazardousMaterials， 2003， 100: 219-229.

[16]SAY R， YILMAZ N， DENIZLI A. Removal of chromium(Ⅵ) ions from synthetic solutions by the fungusPenicilliumpurpurogenum[J].EngineeringinLifeSciences， 2004， 4(3): 276-280.

[17]AKSU Z. Investigation of simultaneous biosorption of copper(Ⅱ) and chromium(Ⅵ) on dried chlorella vulgaris from binary metal mixtures: Application of multicomponent adsorption isotherms[J].SeparationScience&Technology， 1999， 34(3): 501-524.

[18]D?NMEZ G ?， AKSU Z， ?ZTüRK A， et al. A comparative study on heavy metal biosorption characteristics of some algae[J].ProcessBiochemistry， 1999， 34(9): 885-892.

[19]COSSICH E S， TAVARES C R G， RAVAGNANI T M K. Biosorption of chromium (Ⅲ) bySargassumsp. biomass[J].ElectronicJournalofBiotechnology， 2002，5(2): 133-140.

[20]SILVA E A， COSSICH E S， TAVARES C G， et al. Biosorption of binary mixtures of Cr(Ⅲ) and Cu(Ⅱ) ions by Sargassum sp[J].BrazilianJournalofChemicalEngineering， 2003， 20(3): 213-227.

[21]ZHOU M， LIU Y， ZENG G， et al. Kinetic and equilibrium studies of Cr(Ⅵ) biosorption by deadBacilluslicheniformisbiomass[J].WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology， 2006， 23(1): 43-48.

(責任編輯高峻)

Screening of heavy metal Cr6+resistant strains

JIANG Meng， WANG Wei*

(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China)

Cr6+is a hazardous heavy metal element to plant growth， and can endanger human and animal health through food chain enrichment. In the present study， Cr6+resistant strains were screened from soils added with 0.3， 0.5 g·kg-1Cr6+， in order to provide technical support for microbial remediation of heavy metal pollution. It was shown that 9 Cr6+resistant strains were screened， all of which could grow normally in media with 0.5， 1.0 mmol·L-1Cr6+. Among them， strains named as J3， J5 and J8 were able to grow in media with 2 mmol·L-1Cr6+. Besides， after 48 h cultivation in media with 2 mmol·L-1Cr6+， Cr6+content in media with J3， J5， J8 was reduced by 23%，36%， 7%， respectively. Sequencing analysis showed that J3， J5， J8 wereBacillusamyloliquefaciens，Bacilluslicheniformis，Bacillussonorensis， respectively.

heavy metal Cr6+; heavy metal resistance; soil remediation

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.24

2015-10-16

國家高技術研究發展計劃(863計劃)課題(2012AA101401)

姜蒙(1988—)，男，山東濟寧人，碩士，主要從事微生物學研究工作。E-mail: jiang-meng-1988@163.com

，王偉，E-mail: weiwang@ecust.edu.cn

S154.39

A

1004-1524(2016)02-0324-06

姜蒙，王偉. 重金屬Cr6+耐受細菌的篩選研究[J]. 浙江農業學報，2016，28(2)： 324-329.