體胚誘變結縷草屬突變體形態特征及生長特性評價

方敏彥，章　明，孔維亮

(1.江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400 ；2.句容市園林管理中心，江蘇 句容 212400)

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體胚誘變結縷草屬突變體形態特征及生長特性評價

方敏彥1，章明2，孔維亮1

(1.江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400 ；2.句容市園林管理中心，江蘇 句容 212400)

對結縷草屬3個種的119份體胚誘變突變體的13個外部形態特征及生長特性進行了相關分析。結果表明：突變體的所有13個性狀的變異均較大，其中匍匐枝總長度、單株覆蓋面積、葉毛及密度的變異系數均高于1。主成分分析結果表明，單株覆蓋面積、匍匐枝總長度、密度以及直立枝節間長4個性狀對結縷草屬突變體的遺傳多樣性研究具有重要意義。在聚類分析基礎上，將119份突變體種源劃分為4組，分別為細葉多毛型突變體、粗徑早綠型突變體、短葉少毛型突變體、寬葉晚綠型突變體。

結縷草屬；體胚誘變突變體；形態特征；主成分分析；聚類分析

結縷草屬(ZoysiaWilld)植物為禾本科畫眉草亞科的多年生低矮草本植物，是一種優良的暖季型草坪草。由于其具有廣泛的土壤適應性、較強的抗性(抗旱性、耐鹽性、抗病蟲害等)、耐粗放管理和壽命長等特性，是優良的草坪建植材料[1]。該屬植物雖具有許多優良特性，但由于其野生資源被無節制地原始性采挖，破壞嚴重，且繁殖速度慢，可直接利用的種植材料極少，目前在我國的應用很有限。此外，結縷草屬培育的新品種很少，已有品種存在低溫適應范圍窄等問題。

近年來，體細胞無性系變異開始應用在植物種質創新上。其中，體細胞胚(體胚)變異具有特殊的科學價值。植物體胚的發生與合子胚的發育相似，是由植物某些組織的單個體細胞形成胚胎創造出新個體的過程(稱為無性胚胎發生/體胚形成)[2]。體胚發生是細胞全能性表達最為完全的一種方式，它不僅說明植物體細胞具有完整的全套遺傳信息，而且重演了合子胚形態發生的進程[3]。體胚誘變育種，變異頻率高，其中單基因變異可改變植物的個別性狀，而保持其他優良性狀不變[4]。因此，通過體胚誘變開展結縷草屬植物種質創新，能在盡可能保存原有優良性狀的同時創造出具目標性狀的新種質，且該屬植物均以無性繁殖為主，體胚誘變獲得同質突變體后，在M1代即可對整株進行優良性狀選擇，大大優化了育種程序，具有重要的科學意義。

試驗選用結縷草屬中的中華結縷草(ZoysiasinicaHance)、溝葉結縷草[Zoysiamatrella(L.)Merr.]、蘭引Ⅲ號結縷草(ZoysiajaponicaSteud. cv. Lanyin No.3)，通過體胚不同發育時期，采用60Co-γ輻射誘變及低溫處理等復合處理技術，得到了性狀穩定的同質突變體600余份，通過初選對其中119份突變體進行了形態特征及生長特性評價，以期為突變群體的遺傳變異多樣性研究及優良突變種質的篩選奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料為中華結縷草、蘭引Ⅲ號結縷草、細葉結縷草誘變的119份突變體(A1-F29依次編號)，突變體是項目組通過60Co-γ輻射誘變、及低溫處理這3個品種的體細胞胚后獲得的。于2009年栽植于江蘇農林職業技術學院草坪實驗地內，常規養護管理，2015年5—7月進行田間觀測及樣品采集。

1.2觀測項目和方法

直立枝葉片長、寬：直立枝頂部向基部第4片成熟葉[5]，用0.5 mm刻度直尺測定，重復10次，用cm表示。

直立枝節間長、直徑：直立枝頂端向基部第4節莖或直立枝中部節間，用0.5 mm刻度直尺測定，重復10次，用cm表示。

直立枝株高：地表至直立枝自然頂部高度，將一張A4紙輕輕放在草坪上，用直尺從地面量至紙底[6]，用cm表示。

匍匐枝葉片長、寬：取匍匐枝頂部向基部第4片成熟葉，重復5次，用cm表示。

例如給出帶電粒子的質量為m、帶電量為q以及初速度v0,使粒子從兩極板中部穿過勻強電場，并給出極板長度L，極板間距離為d,極板間的電壓U(如圖一)，那么粒子將會有兩種運動結果，其一是帶電粒子可能落在平行板電容器的下極板上，其二是帶電粒子可能逸出平行板電容器。

匍匐枝節間長：匍匐枝頂端向基部第4節莖，重復5次，用cm表示。

匍匐枝總長度：測定匍匐枝在不同方向上的總長度[7]，用cm表示。

密度：具體指草層中直立枝的密度。觀測時采用9級制打分法[8]，其中1為密度最低，6為可以接受，9為密度最低，3人同時打分取平均值。

葉毛(表面/背面)：分五級制[9]。其中0為無毛，1為葉毛很稀疏，2為葉毛較稀疏，3為葉毛較密，4為葉毛很密，3人同時打分取平均值。

葉色：利用日本產SPAD-502葉綠素儀在距離葉片基部50%左右處測定[10-11]，以葉片葉綠素的相對含量表示。

單株覆蓋面積：按橢圓計算[12]，以最大擴展距離為長軸a、與最大擴展距離方向垂直的距離為短軸b，S=πab，用(cm2·株-1)表示。

1.3數據與統計

利用Excel對不同種類結縷草形態學上的數量性狀指標測定值進行初步統計分析，計算平均數、標準差、變異系數，進而比較各個種的種內遺傳變異程度。利用SPSS 17.0軟件對不同種類結縷草的形態特征和生長習性進行指標間相關性分析、主成分分析及聚類分析。

2　結果與分析

2.1突變體形態特征、生長特性變異及相關性分析

2.1.1突變體形態特征、生長特性變異

在13個外部性狀中，匍匐枝總長度、單株覆蓋面積、葉毛及密度的變異系數均高于1，其中匍匐枝總長度為7.2～30.6 cm，變異系數為1.06，單株覆蓋面積為193.4～2 859.9 cm2·株-1，變異系數為1.01，葉毛的變異系數為1.58，密度的變異系數為1.02。其次是葉色、直立枝直徑、匍匐枝節間長，其變異系數都大于0.25。變異系數是揭示樣本差異的參數，變異系數越大，則樣本間的差異越大，一般認為變異系數大于10%就說明樣本間的差異較大[13]。本研究中所有性狀的變異系數都大于10%，說明突變體種質資源外部性狀種內變異很大，遺傳多樣性非常豐富(表1)。

表1突變體形態特征、生長特性變異

Table 1Morphological and growth characteristics ofZoysiamutants

性狀平均值變異系數直立枝葉片長/cm3.25±0.700.21直立枝葉片寬/cm0.217±0.0270.12直立枝節間長/cm1.58±0.380.24直立枝直徑/cm0.092±0.0240.26匍匐枝葉片長/cm2.43±0.420.17匍匐枝葉片寬/cm0.20±0.020.10匍匐枝節間長/cm1.64±0.440.27葉色(SPAD值)21.8±7.450.34葉毛(5分制)0.54±0.851.58密度(9分制)5.22±5.341.02直立枝株高/cm5.93±1.400.24匍匐枝總長度/cm15.90±16.831.06單株覆蓋面積/(cm2·株-1)625.77±633.161.01

2.1.2突變體形態特征、生長特性相關性分析

由表2可以看出，突變體外部性狀之間不是相互獨立的，而是存在一定的相關關系。結縷草屬突變體植物的直立枝葉片長與直立枝直徑之間呈顯著的正相關，相關系數為0.250；直立枝葉片寬與直立枝葉片長、直立枝直徑之間都呈顯著的正相關，相關系數分別是0.233和0.187；直立枝節間長與直立枝直徑呈顯著的負相關，相關系數為-0.207；因此，結縷草突變體種質的很多外部性狀在遺傳上是相互連鎖的，在選育新品種時，可以同時獲得幾個性狀都優良的新品種。

2.2突變體表型性狀的主成分分析

從主成分分析結果(表3)中可以看出，對于結縷草突變體而言，在第一主成分中，單株覆蓋面積、匍匐枝總長度是比較穩定的性狀，這些性狀解釋了結縷草屬的大部分變異，也成為結縷草屬分組的主要依據。在第二主成分中，密度、直立枝節間長是比較重要的指標。直立枝葉片寬、葉色、葉毛歸屬第三主成分，匍匐枝葉片長、匍匐枝葉片寬歸屬第四主成分，而直立植株高、直立枝葉片長、匍匐枝節間長、直立枝直徑歸屬第五主成分。單株覆蓋面積、匍匐枝總長度、密度以及直立枝節間長這4個性狀可作為研究結縷草屬突變體種內差異的主要依據。

表2突變體形態特征、生長特性的相關系數

Table 2Correlation coefficient of morphological and growth characteristics ofZoysiamutants

特性直立枝葉片長直立枝葉片寬直立枝節間長直立枝直徑直立枝10.233*-0.1560.250**葉片長0.0110.0900.0060.1190.1190.1190.119直立枝0.233*1-0.1780.187*葉片寬0.0110.0530.0420.1190.1190.1190.119直立枝-0.156-0.1781-0.207*節間長0.0900.0530.0240.1190.1190.1190.119直立枝0.250**0.187*-0.207*1直徑0.0060.0420.0240.1190.1190.1190.119

注：*和**分別表示相關系數達到顯著和極顯著水平。

表3主成分分析結果

Table 3The results of principal component analysis

特性元件12345單株覆蓋面積0.963匍匐枝總長度0.956密度0.819直立枝節間長-0.815直立枝葉片寬0.812葉色0.809葉毛0.476匍匐枝葉片長0.797匍匐枝葉片寬0.755直立枝株高0.743直立枝葉片長0.658匍匐枝節間長-0.510直立枝直徑0.447

2.3突變體聚類分析

根據13個性狀的聚類結果，在歐式平方距離18處可以將119份突變體種質材料分成4組(圖1)。由表4可知,Ⅰ組有4份種源(A15，C30，E22，F7)，主要特點表現在葉片長(3.5～5.3 cm)而窄(0.15～0.22 cm)，直立枝直徑細(0.05～0.1 cm)，葉綠素含量低(11.4～20.3)，匍匐枝節間短(0.6～1.8 cm)，直立植株矮(4.1～6.5 cm)，密度低而葉毛密集。可應用于公共綠地、公園和小區綠化。Ⅱ組有3份種源(A11，B4，E17)，主要特點是直立枝直徑粗(0.1～0.12 cm)，葉綠素含量高(15.7～26.8 cm)，匍匐枝長(11.6～ 15.1 cm)，密度高且返青早。可進行營養繁殖，應用于運動場及水土保持。Ⅲ組有9份種源(A18，B12，B27，C2，C6，D4，E5，E15，F3)，主要特點表現為直立枝葉片短(2.4～4.1 cm)，葉表面無毛或稀疏，匍匐枝和直立枝的節間長(1.2～2.5 cm)，但返青比較遲。Ⅳ組有103份種源，主要特點則表現為匍匐枝短(7.2～17.8 cm)，直立枝和匍匐枝的葉片都比較寬(0.21～0.29 cm)。

圖1　突變體形態聚類圖Fig.1　Cluster figure of Zoysia mutants

表4四個突變體組的形態特征和生長特性

Table 4Morphological and growth characteristics of the four groups ofZoysiamutants

性狀(單位)Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組平均值變異系數平均值變異系數平均值變異系數平均值變異系數直立枝葉片長/cm4.100.183.600.173.100.173.200.21直立枝葉片寬/cm0.2020.060.2030.040.2100.140.2200.12直立枝節間長/cm1.650.221.630.771.730.231.570.24直立枝直徑/cm0.0820.240.1060.080.0900.260.0920.26匍匐枝葉片長/cm2.250.092.20.042.330.142.450.18匍匐枝葉片寬/cm0.2020.070.1970.050.1980.060.2030.09匍匐枝節間長/cm1.350.371.530.271.670.271.650.26葉色(SPAD值)16.480.2122.170.2120.170.3022.120.35葉毛(5分制)0.751.110.331.420.221.870.561.57密度(9分制)4.500.336.0005.000.495.240.43直立植株高/cm5.450.175.770.106.460.155.900.25匍匐枝總長度/cm13.980.1914.650.1013.530.1813.073.94單株覆蓋面積/(cm2·株-1)640.800.25584.630.02568.040.33621.02258.96

3　結論與討論

3.1結縷草屬突變體表型變異特征

由于結縷草屬突變體的誘變手段不同，導致在外部形態上存在很大的差異，本研究在對119份突變體的13個外部性狀觀測分析后發現，突變體的外部形態特征變異系數都大于10%，即遺傳多樣性非常豐富。在13個外部性狀中，平均變異系數(CV)由大到小依次為葉毛、匍匐枝總長度、密度、單株覆蓋面積、葉色、匍匐枝節間長、直立枝直徑、直立枝株高、直立枝節間長、直立枝葉片長、匍匐枝葉片長、直立枝葉片寬、匍匐枝葉片寬。結縷草屬突變體的部分外部性狀之間存在一定的相關性，直立枝葉片長與直立枝葉片寬、直立枝直徑都呈顯著的相關性。本結論與Diesburg[14]的研究結果一致，即高度性狀(包括生殖枝高度和草層高度)、葉片長度和葉片寬度相互間呈正相關。

3.2基于表型性狀的主成分分析及聚類分析

通過主成分分析，發現單株覆蓋面積、匍匐枝總長度、密度以及直立枝節間長這4個性狀可作為研究結縷草屬體胚誘變突變體遺傳多樣性的主要依據。宣繼萍[8]指出，結縷草屬植物葉片寬度、匍匐莖長度、直徑、每穗小穂數、小穗柄長度、小穗長度、生殖枝高度、葉舌的顏色及有無毛9個性狀是結縷草屬形態分類的重要依據，與本文結論有一些差異，但在匍匐莖長度等方面是一致的，這可能是結縷草屬體胚誘變突變體變異后的群體特性。

基于聚類分析的結果，可以將結縷草突變體劃分為4組，Ⅰ組細葉多毛型結縷草，Ⅱ組粗徑早綠型結縷草，Ⅲ組短葉少毛型結縷草，Ⅳ組寬葉晚綠型結縷草。本研究結果說明，獲得的結縷草體胚誘變突變群體具有豐富的遺傳多樣性，可為草坪地被體胚誘變育種提供理論依據。同時，證明體胚誘變可拓寬結縷草屬植物的遺傳基礎、實現優良種質創新、選擇優異基因，并為大規模結縷草突變體庫的構建及功能基因組學研究奠定了基礎。

[1]賀小霞.狗牙根和海濱雀稗的形態特征與 AFLP遺傳多樣性研究[D].上海：上海交通大學， 2011.

[2]陶雷.刺五加體細胞胚發生機制的初步研究[D].哈爾濱:東北林業大學，2013.

[3]ANTONY C， IGNACIMUTHU S. Efficient somatic embryogenesis and plant regeneration from shoot apex explants of different Indian genotypes of finger millet (Eleusinecoracana(L.)Gaertn.)[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant， 2008，44(5):427-435.

[4]王婷婷，徐國榮，張舉仁，等.細胞工程技術選育的草地早熟禾新種質的耐熱性分析[J].草業學報，2009，18(2)：60-65.

[5]李亞，凌萍萍，劉建秀，等.中國結縷草屬植物(Zoysiaspp.)地下部分分布和形態類型的多樣性[J].植物資源與環境學報，2002，11(2):39-44.

[6]胡利珍.野生結縷草品系生物學特性及坪用現狀的研究[D].長沙:湖南農業大學，2007.

[7]杜永吉，金芳，孫吉雄，等.蘭引Ⅲ號結縷草分株繁殖建坪的研究[J].草原與草坪，2008(1):54-58.

[8]宣繼萍.結縷草屬(ZosiaWilld.)植物種質資源多樣性研究[D].南京：南京農業大學，2008.

[9]賈蘊琪.結縷草綠期與抗寒性研究[D].蘭州:甘肅農業大學，2009.

[10]魚歡，祖超，楊建峰，等.應用SPAD葉綠素儀測定不同位置胡椒葉片的SPAD值[J].熱帶作物學報，2012，33(10):1890-1895.

[11]薛香，吳玉娥.小麥葉片葉綠素含量測定及其與SPAD值的關系[J].湖北農業科學，2010，49(11):2701-2702.

[12]董沁.基于形態特征和AFLP的野生早熟禾遺傳多樣性研究[D].蘭州:甘肅農業大學，2013.

[13]郭海林，陳宣，薛丹丹，等.結縷草屬植物青綠期的遺傳分析[J].草業學報，2009，18(4):147-153.

[14]DIESBURG K L. Expanded germplasm collections set stage for increased zoysiagrass breeding for turf use[J].Diversity，2000，16(1/2):49-50.

(責任編輯張韻)

Evaluation of morphological and growth characteristics of somatic embryo mutants of Zoysia

FANG Min-yan1，ZHANG Ming2，KONG Wei-liang1

(1.JiangsuPolytechnicCollegeAgricultureandForestry，Jurong212400，China; 2.JiangsuJurongGardenManagementCenter，Jurong212400，China)

Thirteen morphological and growth characteristics of somatic embryo mutants ofZoysiaincluding 3 species and 119 mutants were analyzed. Results showed that the variation of all the 13 traits were large， among which the variation coefficient of total length of creeping branch， covering area per plant， lamellar hair and density were higher than 1. The results of principal component analysis showed that single cover area， total length of creeping branch， density and erect internode length were meaningful for the study on genetic diversity ofZoysiamutants. Based on the clustering analysis， 119Zoysiamutants were divided into four groups， including narrow leaf and hairy type mutants， large diameter and early green mutants， short leaf and little hair type mutants， and wide leaf and lately green mutants.

Zoysia; somatic embryo mutants; morphological characteristics; principal component analysis; cluster analysis

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.15

2015-10-30

奧林高爾夫教育與研究基金(AL2014004)；江蘇農林職業技術學院草坪創新團隊

方敏彥(1980—)，女，浙江永康人，副研究員，博士，主要從事園林植物栽培和育種研究。E-mail: fangyanhome@163.com

S812

A

1004-1524(2016)02-0269-05

方敏彥，章明，孔維亮. 體胚誘變結縷草屬突變體形態特征及生長特性評價[J].浙江農業學報，2016，28(2)： 269-273.