野生花臉香蘑的分離純化及ITS序列鑒定

鄒　莉，楊苑藝，孫婷婷，王世新，崔　嶸，李晶瑩

(東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

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野生花臉香蘑的分離純化及ITS序列鑒定

鄒莉，楊苑藝，孫婷婷，王世新，崔嶸，李晶瑩

(東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以采自內蒙古根河地區的野生花臉香蘑為材料，采用組織分離法分別對其菌蓋處、菌蓋與菌柄交界處和菌柄處的組織進行分離純化；通過測定生長速度和污染率等方法，研究分離純化的最適培養基和最佳部位；最后將分離物進行ITS序列分析，計算遺傳距離，并采用鄰接法構建NJ系統發育樹。結果表明，分離純化最適培養基為PDA+子實體煮水培養基；菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲生長速度快、長勢好、污染率低；并且子實體經自然風干2 d后能有效降低污染率；最后分離物經ITS序列測定，系統發育分析證實其為花臉香蘑。

花臉香蘑；組織分離；ITS序列分析；系統發育分析

花臉香蘑(Lepistasordida)又叫紫晶香磨、丁香蘑等，屬真菌界(Fungi)擔子菌門(Basidiomycomycota)層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)口磨科(Tricholomataceae)香蘑屬(Lepista)[1]。子實體中等大小，菌蓋直徑2.0～10.5(12)cm，紫色、淺紅菱色或藕粉色，菌肉薄并帶淡紫色，菌褶淡藍紫色或淺紅菱色[2-3]?；樝隳⒑胸S富的蛋白質和氨基酸，還富含鈣、鐵、鋅、硒等微量元素[4]，其菌株發酵物有較強的抗癌、抗菌等活性[5]，是營養價值與藥用價值兼優的野生食用菌，具有極大的開發價值[6]。目前，對于花臉香蘑的研究報道不多，主要是關于其發酵物[7]、提取物[8]以及生長特性[9]的研究，而關于花臉香蘑人工栽培方面的研究較少。本研究以采自內蒙古根河地區的野生花臉香蘑為實驗材料，通過組織分離法對其進行菌種分離純化以及ITS序列測定，以期為花臉香蘑的進一步開發與利用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1供試菌種

花臉香蘑(Lepistasordida)，2013年9月采自內蒙古根河地區。

1.2試驗方法

1.2.1培養基的制備

本試驗共設4種培養基，基礎培養基為PDA培養基，碳源為葡萄糖，其他培養基分別添加前人研究的最適氮源和無機鹽等作為比較。

培養基①：PDA培養基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL。將馬鈴薯切成1 cm×1 cm×1 cm小塊放于鍋中加水煮20～30 min，過濾取濾液，加入葡萄糖與瓊脂煮沸4～5 min，分裝于三角瓶中，滅菌。滅菌采用高壓蒸汽滅菌，121 ℃滅菌20 min。

培養基②：PDA+酵母膏培養基。在1 L PDA培養基中加入3 g酵母膏[10]配制而成。

培養基③：PDA+無機鹽培養基。在1 L PDA培養基中加入0.5 g MgSO4，1 g KH2PO4[11]配制而成。

培養基④：PDA+子實體煮水培養基。采集的花臉香蘑子實體經水煮后的濾液代替水配制而成。

1.2.2子實體不同部位對分離的影響

將解剖刀、接種鉤、封口膜以及PDA平板于超凈工作臺中開紫外滅菌30 min。將花臉香蘑新鮮子實體用75%乙醇擦拭2～3遍，用無菌的解剖刀在菌蓋中央劃口，用手輕輕掰開，注意不要用手接觸到內部的菌肉。用無菌的接種鉤分別在子實體菌蓋、菌蓋與菌柄交界處和菌柄處取一小塊菌肉，將其迅速放置于事先滅好菌的PDA平板培養基中，每個培養皿接1塊菌肉，重復20組，用封口膜進行封口后置于25 ℃恒溫培養箱中進行培養，每天觀察長勢并記錄[12]。

花臉香蘑菌絲生長速度的測定采用十字劃線法[13]。將菌肉接于培養皿中心位置，在平板底部用記號筆畫上兩條經過中心點的垂直線，每天同一時間測量菌落的直徑，計算菌絲生長速度(mm·d-1)。

1.2.3子實體風干程度對污染率的影響

分別對新鮮的子實體和經自然風干1，2，3 d的子實體進行分離純化，從上述試驗選出的最佳分離部位處取菌肉接于PDA平板培養基中，每個平板中放置1塊菌肉，重復20組，于25 ℃恒溫培養箱中進行培養，觀察污染情況并記錄。

1.2.4不同培養基對分離的影響

分別制備1.2.1節中的4種培養基，對花臉香蘑進行分離培養。從上述試驗選出最佳風干程度的子實體并從最佳分離部位處取菌肉接于4種培養基中，每個平板放置1塊菌肉，重復20組，于25 ℃恒溫培養箱中進行培養，觀察菌絲長勢并記錄。

1.2.5DNA的提取、擴增和鑒定

采用快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒(天根)分別對花臉香蘑的子實體和分離培養得到的菌絲體進行基因組 DNA 的提取。子實體用無菌的接種鉤鉤取其純凈的菌肉，放于研缽中，加入液氮充分研磨；菌絲體用無菌的小勺在分離培養基上刮取后放于研缽中，加入液氮充分研磨。其余步驟參照說明書。

采用通用引物ITS1和ITS4(ITS1：5’-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3’)用于rDNA ITS 區段的 PCR 擴增[14]。擴增體系為50 μL，其中去離子水為35.5 μL，10×PCR緩沖液 5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)4 μL，ITS1 /ITS4 引物各2 μL，TaqDNA 酶(5 U·μL-1)0.5 μL，模板DNA 1 μL(濃度20～50 ng·μL-1)；PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃反應7 min。對PCR擴增產物進行電泳檢測后送至哈爾濱博仕公司進行測序。

將測序結果在NCBI中做BLASTN比對，找出并下載>95%相似性序列，用ClustalX2.1的Alignment程序對所有同源序列進行多重對位排列。用MEGA 5.02軟件包進行系統發育分析和進化樹的構建。用Kimura2-parame-ter 模式計算遺傳距離，所有對位排列結果中的空位(gaps)或缺失數據(missing data)作完全刪除(complete deletion)處理，進化距離分析采用鄰位相連法(neighbor-joining，NJ)。系統樹的每個分支的統計學顯著性分析以自展法(bootstrap)進行檢驗，重復次數為1 000次。

2　結果與分析

2.1子實體不同部位對分離的影響

從表1可以看出，從花臉香蘑子實體的不同部位所取菌肉組織經培養后，3個部位的菌絲生長速度有極顯著差異，其中菌蓋與菌柄交界處菌絲長勢最旺盛，生長速度最快，且污染率最低，都顯著低于其他2個部位的平均污染率。因此，菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位。

表1子實體不同部位對分離的影響

Table 1Effect of sporocarp different parts on isolation

分離部位菌絲長勢生長速度/(mm·d-1)平均污染率/%菌蓋處++6.8aA29.13aA菌蓋與菌柄交界處+++7.8bB16.19bA菌柄處++6.0cC26.42aA

注：數據為每個處理的平均值。菌絲生長濃密，長勢旺盛，用“+++”表示；菌絲生長較密，長勢較好，用“++”表示；菌絲生長稀，長勢較弱，用“+”表示。同列不同行數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2子實體風干程度對污染率的影響

通過前一組試驗確定菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位，本組試驗以新鮮的花臉香蘑子實體和經自然風干1，2，3 d的子實體為材料，同時取菌蓋與菌柄交界處的菌肉進行培養，研究子實體風干程度對污染率的影響。

試驗結果表明，風干2 d子實體菌蓋與菌柄交界處的平均污染率(11.53%)要顯著低于新鮮子實體的污染率(16.19%)和風干3 d子實體的污染率(15.04%)，但與風干1 d子實體的污染率(14.78%)差異不顯著。因此，采用風干2 d的花臉香蘑子實體進行分離能有效地降低污染率。

2.3不同培養基對分離的影響

通過前兩組試驗確定了最佳分離部位以及子實體最佳風干程度，本組試驗分別采用4種培養基對風干2 d的花臉香蘑子實體取其菌蓋與菌柄交界處的菌肉進行培養，研究不同培養基對分離的影響。

結果表明，采用培養基①的菌絲生長速度為7.8 mm·d-1，采用培養基②的菌絲生長速度為8.5 mm·d-1，采用培養基③的菌絲生長速度為8.1 mm·d-1，采用培養基④的菌絲生長速度為8.8 mm·d-1。

對4種培養基的菌絲生長速度進行比較發現，采用添加了無機鹽的培養基③培養后對菌絲的生長速度提升并不顯著，而用培養基②和培養基④進行分離培養后，菌絲生長速度均顯著高于另外2種培養基的菌絲生長速度，且培養基④菌絲生長速度提升最大。因此，PDA+子實體煮水培養基最適合花臉香蘑的生長。

2.4ITS區段的PCR產物及測序結果

對花臉香蘑子實體及分離培養得到的菌絲進行DNA提取并以提取的DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后得到如圖1所示的特異性條帶。由圖1可以看出，L1與L2片段大小一致，約為670 bp左右，與測序得到的基因片段長度L1 677 bp和L2 674 bp大小相符，并且L1與L2有99%的同源性。因此，可以初步判定菌絲體L2為花臉香蘑子實體L1的純培養菌株。

M，DL2000； L1，花臉香蘑子實體； L2，菌絲體。圖1　子實體及其分離菌株的rDNA ITS擴增圖譜Fig.1　rDNA ITS amplification patterns of sporocarp and the isolated strain

2.5系統發育分析

在NCBI中進行BLASTN比對，找到8條與L2相似性>95%的序列并下載，用ClustalX 2.1軟件進行序列比對，并輔以人工修正。基于來自NCBI中的8個種的ITS序列，以木耳(Auriculariaauricula)作為外參，連同試驗中的 ITS 序列共10個序列一起用于系統發育分析。用MEGA 5.02中的鄰接法(NJ)構建系統樹。從圖2可以看出，L2與香蘑屬的Lepistanuda、Lepistasordida和Lepistatarda有較近的系統發育關系，與近緣屬的Clitocybeodora和Tricholomamongolicum序列差異較大，系統發育關系較遠。

圖2　花臉香蘑菌株系統發育樹狀圖Fig.2　Phylogenetic dendrogram of Lepista sordida isolation strain

3　結論與討論

本試驗采用組織分離法對野生花臉香蘑進行分離，試驗結果表明，野生花臉香蘑能夠成功分離并且菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位，其菌絲長勢好，生長速度快并且污染率低，可能是因為該部位與空氣接觸少，雜菌少，因而培養時污染率低；另外，本試驗篩選出最適宜分離的培養基為PDA+子實體煮水培養基，用此培養基進行組織分離能提高菌絲生長速度，原因可能是子實體煮水后含有菌絲生長所需的營養物質和微量元素；并且將子實體經自然風干2 d后再進行分離能有效地降低污染率，這可能是因為將子實體風干后能減少雜菌尤其是細菌的數量，從而降低污染率，但風干時間過長也可能進一步導致雜菌滋生，因而風干時間以2 d為最佳。

本試驗關于菌種鑒定采用ITS法，其準確性高且簡單易行。通過對供試子實體與菌絲體的ITS區段長度進行比對，驗證了供試菌絲體為花臉香蘑的分離物；構建系統發育樹后驗證供試菌絲體與香蘑屬的Lepistanuda，Lepistasordida和Lepistatarda有較近的系統發育關系。本試驗成功分離了野生花臉香蘑，并驗證其供試菌絲體為花臉香蘑，為花臉香蘑的進一步開發利用提供了科學依據。

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(責任編輯張韻)

Isolation and identification of wild Lepista sordida by ITS gene sequence

ZOU Li， YANG Yuan-yi， SUN Ting-ting， WANG Shi-xin， CUI Rong， LI Jing-ying

(SchoolofForestry，NortheastForestUniversity，Harbin150040，China)

Lepistasordidawhich was collected from Genhe District in Inner Mongolia was used as materials， tissue isolation was used to isolate the tissue of pileus， stipe， and junction of them. The optimal culture medium and the best tissue for isolation was investigated by measuring growth rate and pollution rate. Then the isolate was identified by internal transcribed spacer (ITS)， the genetic distance was calculated by Kimura2-parame-ter， and a NJ systematic tree was established by the neighbor-joining method. The results showed that the optimal culture medium was PDA added with sporocarp boiled water， and the junction of pileus and stipe showed fast growth and low pollution， which was the best isolation position. Moreover， the pollution rate could be effectively reduced when the sporocarp had been air-dried for 2 days. At last， the isolate was identified asLepistasordidaby the analysis of phylogenetic relationship of ITS gene sequences.

Lepistasordida; tissue isolation; ITS sequence analysis; phylogenetic analysis

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.14

2015-07-13

鄒莉(1966—)，女，黑龍江哈爾濱人，教授，主要從事資源微生物方向的研究。E-mail：zouli6616@yahoo.com.cn

S646

A

1004-1524(2016)02-0264-05

鄒莉，楊苑藝，孫婷婷，等. 野生花臉香蘑的分離純化及ITS序列鑒定[J].浙江農業學報，2016，28(2)： 264-268.