產(chǎn)雌馬酚梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護(hù)效果

尹業(yè)師，方　丹，朱立穎，劉　偉，吳　健，王　欣，*

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

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產(chǎn)雌馬酚梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護(hù)效果

尹業(yè)師1，方丹2，朱立穎1，劉偉1，吳健2，王欣1，*

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

部分梭菌對機(jī)體的免疫系統(tǒng)具有明顯的調(diào)節(jié)作用，可開發(fā)成新型益生菌。由于雞盲腸內(nèi)容物中梭菌含量較高，從小雞肓腸內(nèi)容物中分離培養(yǎng)功能性梭狀芽孢桿菌，并在小雞中初步研究其對沙門氏菌攻毒的保護(hù)效果。該研究首先采用梭菌選擇性培養(yǎng)基，從小雞肓腸內(nèi)容物中分離獲得了一株可以將大豆素轉(zhuǎn)化為雌馬酚的革蘭氏陽性纖維狀梭菌C1，以四環(huán)素為對照，研究梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒的保護(hù)作用。結(jié)果表明，梭菌C1組和四環(huán)素組均具有降低肓腸內(nèi)容物中沙門氏菌活菌數(shù)和促進(jìn)小雞生長的功能，推測梭菌C1具有開發(fā)為四環(huán)素替代品的潛能。雖然較高濃度的S-雌馬酚(5 mg·mL-1)在體外對沙門氏菌有一定的抑制作用，梭菌C1也具有將大豆素轉(zhuǎn)化為雌馬酚的能力，但梭菌C1在體外對沙門氏菌的抑制作用并不明顯，其益生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

梭菌；雌馬酚；小雞；沙門氏菌

隨著“超級細(xì)菌”的報(bào)道與流行，細(xì)菌的抗菌素耐藥越來越受到關(guān)注。在細(xì)菌抗菌素耐藥日趨嚴(yán)峻的形勢下，很多學(xué)者把耐藥菌的產(chǎn)生歸因于畜禽抗菌素的濫用[1-2]。歐盟很多國家已經(jīng)禁止使用抗菌素作為動物促生長劑，而抗菌素替代品——益生菌的應(yīng)用前景廣闊。目前，商用的益生菌主要是乳酸菌和雙歧桿菌，但家禽消化道中的優(yōu)勢菌群主要為擬桿菌和梭菌[3-4]，所以尋求新的益生菌迫在眉睫。雖然有些擬桿菌和梭菌是條件性致病菌，但最近研究表明，很多擬桿菌和梭菌均有助于宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用及調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟[5-8]。所以，開發(fā)新的擬桿菌和梭菌在益生菌定殖和功能發(fā)揮方面具有一定優(yōu)勢。

梭狀芽孢桿菌是硬壁菌門中一類革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，具有產(chǎn)生內(nèi)孢子和在惡劣條件下存活的生態(tài)優(yōu)勢。盡管有些梭菌由于能產(chǎn)生毒素類物質(zhì)而具有致病性，但大部分梭菌與宿主之間維持著共生關(guān)系。ⅩⅣa簇和Ⅳ簇梭菌占腸道總菌的10%～40%[4]，能夠產(chǎn)生各種具有生物活性的酶，以幫助宿主降解利用宿主自身無法消化的多糖和寡糖類物質(zhì)[5]，其降解產(chǎn)物包括乙酸、丙酸和丁酸等重要的能量來源物質(zhì)。最新研究發(fā)現(xiàn)，ⅩⅣa簇和Ⅳ簇梭菌具有調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟的功能[6]，由梭菌屬ⅩⅣa簇和Ⅳ簇組成的46株梭菌的復(fù)合物，具有促進(jìn)腸道上皮T淋巴細(xì)胞和免疫球蛋白A(IgA)分泌細(xì)胞分化增殖的能力[7]。因此，從雞腸道內(nèi)容物分離培養(yǎng)梭狀芽孢桿菌，研究其生理功能顯得尤為重要。

本研究采用梭菌選擇培養(yǎng)基，從雞盲腸內(nèi)容物中分離獲得了一株可以將大豆素轉(zhuǎn)化為雌馬酚的梭狀芽孢桿菌C1。沙門氏菌攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，梭菌C1具有抑制沙門氏菌定殖和促進(jìn)小雞生長的功能。

1　材料與方法

1.1梭菌C1的分離鑒定

15日齡AA肉雞購自浙江大學(xué)海寧種雞場。小雞用乙醚麻醉后，直接扭頸處死，腹腔解剖后將肓腸轉(zhuǎn)移到37 ℃厭氧工作站(英國Electrotek公司)。稱取小雞肓腸內(nèi)容物0.2 g，加入2 mL滅菌PBS，混勻后配制成10%的懸液。再用PBS將10%的懸液按10-2，10-4，10-6和10-8進(jìn)行梯度稀釋，然后取各個(gè)稀釋度菌液100 μL涂布在梭菌選擇培養(yǎng)基平板上(青島海博生物技術(shù)有限公司)。平板在37 ℃厭氧工作站內(nèi)倒置培養(yǎng)3 d后，挑取乳白色菌落至液體梭菌培養(yǎng)基中(青島海博生物技術(shù)有限公司)，靜置培養(yǎng)5 d后將菌液離心沉淀(5 000g離心 5 min)，然后用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒(Qiagen)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取。采用細(xì)菌16S rDNA全長通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，具體操作步驟參照TaKaRa ExTaq說明書進(jìn)行。采用革蘭氏染色液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)和生物顯微鏡CX51(OLYMPUS)對梭菌C1進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2梭菌C1產(chǎn)雌馬酚能力檢測

將121 ℃高壓滅菌20 min的BHI培養(yǎng)基分裝到試管中，每管5 mL，然后加入5 μL濃度為5 mg·mL-1的大豆素貯存液，混勻后接種活化好的梭菌C1 50 μL，在37 ℃厭氧工作站中靜置培養(yǎng)96 h后收集發(fā)酵液。發(fā)酵液5 000g離心 5 min，將900 μL上清液用等量的乙酸乙酯萃取抽提3次，然后將萃取的上清液混合，45 ℃冷凍離心濃縮成粉末，加入200 μL甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm聚偏氟乙稀微孔濾膜過濾后，參照王宇等[9]的方法，使用HPLC對溶液中的雌馬酚濃度進(jìn)行檢測。

1.3梭菌C1菌懸液和發(fā)酵液上清對沙門氏菌的體外抑制試驗(yàn)

配置1.2%的LB瓊脂平板，用一次性細(xì)菌接種環(huán)將過夜培養(yǎng)的沙門氏菌劃線接種到冷卻凝固的LB平板上，然后將直徑6 mm的無菌濾紙片輕輕放入平板中，將5 μL梭菌C1菌懸液、梭菌C1發(fā)酵液上清、四環(huán)素水溶液(2 mg·mL-1)及不同濃度的S-雌馬酚溶液(0.2，1.0和5.0 mg·mL-1)和相應(yīng)的有機(jī)溶劑甲醇分別點(diǎn)到濾紙片上。平板在37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)14 h后觀察抑菌圈大小。

1.4梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護(hù)試驗(yàn)

1.4.1試驗(yàn)動物

剛出殼清潔級Ross308肉雞，購自浙江大學(xué)海寧種雞場。

1.4.2試驗(yàn)日糧

所喂飼料參照文獻(xiàn)[10]的配方配制。

1.4.3試驗(yàn)用菌株

梭菌C1為本研究從小雞肓腸內(nèi)容物中分離獲得；沙門氏菌CVCC519購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。菌株活化后保存在4 ℃冰箱備用。

1.4.4飼養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將剛出殼的小雞平均分成3組，分別標(biāo)記為梭菌C1組、四環(huán)素組和對照組。每組小雞初始體質(zhì)量平均為(44±1.1)g。每組設(shè)2個(gè)平行，每個(gè)平行各10只小雞。梭菌C1組小雞每天每只經(jīng)口腔用灌胃針灌喂0.2 mL活化好的梭菌C1(2×107cfu·mL-1)，連續(xù)灌喂5 d；四環(huán)素組按0.1 g·mL-1的量將四環(huán)素添加在飲水中，小雞自由飲用，每天更換1次；對照組不進(jìn)行任何干預(yù)。6日齡時(shí)對所有小雞進(jìn)行沙門氏菌攻毒，每只小雞灌喂0.2 mL活化好的沙門氏菌菌液(2×107cfu·mL-1)，連續(xù)灌喂2 d。攻毒后，梭菌C1組再用梭菌C1菌液灌喂2 d，四環(huán)素組再在飲水中添加0.1 g·mL-1四環(huán)素2 d，此后不再進(jìn)行干預(yù)。所有試驗(yàn)組小雞均自由采食飲水。

1.4.5小雞平均體質(zhì)量檢測

分別在沙門氏菌攻毒后第2，9，16和23天記錄每只小雞體質(zhì)量，并計(jì)算平均體質(zhì)量。

1.4.6沙門氏菌活菌數(shù)檢測

分別在沙門氏菌攻毒后第2，9，16和23天隨機(jī)選取每個(gè)試驗(yàn)組4只小雞，每個(gè)平行各2只，解剖后取其盲腸內(nèi)容物。用電子天平稱取0.1 g盲腸內(nèi)容物，迅速加入0.9 mL PBS充分混勻。將稀釋好的雞盲腸內(nèi)容物再用PBS依次進(jìn)行梯度稀釋，然后分別取10-4，10-5，10-6，10-7四個(gè)稀釋度的菌液各100 μL涂布到可用于沙門氏菌鑒別的選擇性瓊脂平板DHL上，37 ℃培養(yǎng)過夜后進(jìn)行菌落記數(shù)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行平均值與標(biāo)準(zhǔn)誤差分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1梭菌C1的分子生物學(xué)鑒定與形態(tài)學(xué)觀察

對梭菌C1的16S rRNA序列PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，然后對所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果顯示，梭菌C1與從人糞便樣品中分離到的一株產(chǎn)雌馬酚梭菌TM-40相似度最高，其16S rRNA基因的DNA序列相似性達(dá)到100%。形態(tài)學(xué)觀察表明，梭菌C1是一種具有分節(jié)的纖維狀革蘭氏陽性菌(圖1)。綜上所述，推測梭菌C1可能是一株新的具有產(chǎn)生雌馬酚能力的梭菌。

圖1　梭菌C1革蘭氏染色結(jié)果Fig.1　Gram stain results of the Clostridium C1

2.2梭菌C1產(chǎn)S-雌馬酚能力檢測

由于梭菌C1與雌馬酚產(chǎn)生菌TM40同源性最高，本研究對梭菌C1是否也具有雌馬酚產(chǎn)生能力進(jìn)行了檢測。從圖2的HPLC檢測結(jié)果可以看出，與S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品相比，梭菌C1發(fā)酵液在約9.5 min時(shí)也能檢測到相對應(yīng)的光譜吸收峰，說明梭菌C1在體外具有將大豆素轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚的能力。

2.3梭菌C1和S-雌馬酚對沙門氏菌的體外抑制試驗(yàn)

平板抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果顯示，無論有氧還是厭氧條件下，四環(huán)素對沙門氏菌均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，而梭菌C1菌懸液及其上清液周圍沒有出現(xiàn)明顯的抑菌圈(圖3)，說明梭菌C1在體外對沙門氏菌的抑制效果不明顯。從圖3可以看出，S-雌馬酚溶液在體外對沙門氏菌的生長有一定的抑制作用，但其抑制作用具有濃度依賴性，只有5 mg·mL-1S-雌馬酚溶液周圍出現(xiàn)了較明顯的抑菌圈。

A： S-雌馬酚標(biāo)準(zhǔn)品； B： 梭菌C1發(fā)酵液樣品。圖2　HPLC檢測梭菌C1發(fā)酵液中的雌馬酚含量Fig.2　Equol concentration in Clostridium C1 fermentation broth using HPLC

1： 梭菌C1菌懸液； 2： 梭菌C1發(fā)酵液上清； 3： 四環(huán)素； 4： 甲醇； 5： 0.2 mg·mL-1 S-雌馬酚； 6： 1 mg·ml-1 S-雌馬酚； 7： 5 mg·mL-1 S-雌馬酚。圖3　不同處理對沙門氏菌的體外抑制效果Fig.3　Inhibition effects on the growth of Salmonella by different treatments

2.4梭菌C1對小雞的促生長作用

如圖4所示，四環(huán)素組小雞生長速度最快，在沙門氏菌感染后第9天小雞平均體質(zhì)量就明顯高于對照組(P<0.01)，一直到試驗(yàn)結(jié)束即沙門氏菌感染后第23天，四環(huán)素組小雞平均體質(zhì)量仍明顯高于對照組(P<0.05)。梭菌C1組在沙門氏菌感染后第2天生長速度就比對照組快，尤其是在沙門氏菌感染后第16和23天，其平均體質(zhì)量顯著高于對照組(P<0.05)。雖然在沙門氏菌感染后第9天，四環(huán)素平均體質(zhì)量顯著高于梭菌C1組，但到感染后第16和23天，梭菌C1組與四環(huán)素組之間沒有顯著差異(P>0.05)，說明梭菌C1與四環(huán)素對小雞具有類似的促生長功能。

沙門氏菌感染后，相同時(shí)間不同處理間無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4　小雞平均體質(zhì)量Fig.4　Average weight of chicken

2.5梭菌C1對小雞肓腸內(nèi)容物中沙門氏菌活菌數(shù)的影響

如圖5所示，與對照組相比，四環(huán)素組沙門氏菌活菌數(shù)持續(xù)下降，在沙門氏菌感染后第2天，四環(huán)素組小雞肓腸內(nèi)容物中沙門氏菌活菌數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)，到感染后第23天，已經(jīng)檢測不到沙門氏菌活菌的存在。梭菌C1組的沙門氏菌活菌數(shù)在感染后第2天即少于對照組，從感染后第9天直到試驗(yàn)結(jié)束即感染后第23天，梭菌C1組的沙門氏菌活菌數(shù)均顯著低于對照組。但在試驗(yàn)中，只在感染后第2和9天，梭菌C1組與四環(huán)素組間沙門氏菌活菌數(shù)無顯著差異(P> 0.05)；在感染后第16和23天，梭菌C1組沙門氏菌活菌數(shù)極顯著高于四環(huán)素組(P<0.01)，說明梭菌C1處理只在短期內(nèi)具有與四環(huán)素類似的抵御沙門氏菌繁衍和定殖的效果。

沙門氏菌感染后，相同時(shí)間不同處理間無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5　小雞盲腸內(nèi)容物沙門氏菌活菌計(jì)數(shù)Fig.5　Numbers of live Salmonella in chicken cecal contents

3　結(jié)論與討論

沙門氏菌感染是一種動物源性人畜共患病，嚴(yán)重影響公共健康、食品安全和動物生產(chǎn)[11]。迄今為止，疫苗和抗菌素對沙門氏菌的防治效果還不是很理想[12-13]。竟?fàn)幮耘懦庖嫔徽J(rèn)為是一種防治沙門氏菌感染的替代療法[14]。目前，很多學(xué)者正在試圖從環(huán)境樣品中分離對沙門氏菌具有防治作用的益生菌。Yang等[15]對小豬和小雞腸道來源乳酸產(chǎn)生菌防治沙門氏菌的效果和防治機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)乳酸產(chǎn)生菌雖然在體外對沙門氏菌生長具有抑制作用，但在小雞腸道內(nèi)卻不能減少沙門氏菌活菌數(shù)，本研究結(jié)果與此存在一定的差異。盡管益生菌可能通過多種途徑抑制沙門氏菌在胃腸道內(nèi)的定殖和繁衍，但產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)仍是其最直接和最主要的途徑[16]。Yang等[15]推測乳酸產(chǎn)生菌在體內(nèi)不能減少腸道沙門氏菌定殖的原因可能是乳酸產(chǎn)生菌在腸道環(huán)境中沒有分泌抗菌類物質(zhì)。本研究中，雖然體外試驗(yàn)沒有觀察到梭菌C1對沙門氏菌有明顯的抑制效果，但動物試驗(yàn)卻表明，梭菌C1組小雞肓腸內(nèi)容物中沙門氏菌活菌數(shù)明顯減少。這可能是由于梭菌C1在體內(nèi)分泌或積累了更多的抗菌類物質(zhì)如S-雌馬酚，或者梭菌C1具有刺激宿主免疫的功能，從而達(dá)到在體內(nèi)間接抑制沙門氏菌的功效。雖然已有大量學(xué)者對益生菌的益生效果和作用機(jī)制進(jìn)行了研究，但各自研究結(jié)果間存在著一定的差異，這可能是不同益生菌的防治效果和作用機(jī)制有所不同所致。Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸產(chǎn)生菌防治沙門氏菌的益生機(jī)制可能是減少脾臟和肝臟沙門氏菌的數(shù)量及降低沙門氏菌毒力基因的表達(dá)。Eloe-Fadrosh等[17]研究報(bào)道，鼠李糖乳桿菌LGG的益生機(jī)制可能是通過促進(jìn)其他腸道菌群(包括擬桿菌屬、雙歧桿菌屬等)的生長，從而促進(jìn)免疫系統(tǒng)的健康發(fā)育。

綜上所述，不同益生菌防治沙門氏菌感染的生理活性表現(xiàn)形式和作用機(jī)制存在差異。本研究從小雞肓腸內(nèi)容物中分離獲得了一株雌馬酚產(chǎn)生梭菌C1，雖然體外抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，梭菌C1或其發(fā)酵液上清對沙門氏菌的生長并沒有明顯的抑制作用；但動物試驗(yàn)結(jié)果表明，梭菌C1不僅可以減少小雞體內(nèi)沙門氏菌活菌數(shù)，還能促進(jìn)小雞生長，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

大豆異黃酮具有促進(jìn)畜禽生長和乳腺發(fā)育、提高動物繁殖力和泌乳性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能，且食品中大豆異黃酮等天然植物雌激素對人類健康有益。因此，大豆異黃酮作為一種新型飼料添加劑具有較大的開發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。臨床上大豆異黃酮的療效主要?dú)w功于其代謝產(chǎn)物S-雌馬酚[18]。S-雌馬酚是一種植物雌激素，是大豆異黃酮在哺乳動物腸道中經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的代謝產(chǎn)物，其生物學(xué)活性包括雌激素樣活性[19]、抗氧化活性[20]等均較其前體大豆素強(qiáng)。但機(jī)體將大豆素代謝轉(zhuǎn)化為雌馬酚的能力具有個(gè)體差異，亞洲人群中只有30%～50%的人具有將大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為雌馬酚的能力，在大白母豬糞便中雌馬酚的個(gè)體差異系數(shù)也可以達(dá)到60%以上[21]。所以在以豆制品為主要飼料來源的養(yǎng)殖業(yè)中，以雌馬酚產(chǎn)生菌作為益生菌將能更好地發(fā)揮大豆異黃酮的生物功能。

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(責(zé)任編輯侯春曉)

Protective effect of an equol-producing Clostridium C1 against Salmonella infection in chicken

YIN Ye-shi1， FANG Dan2， ZHU Li-ying1， LIU Wei1， WU Jian2， WANG Xin1，*

(1.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences/StateKeyLaboratoryofBreedingBaseforAgriculturalProductQualitySecurity，Hangzhou310021，China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

SomeClostidiumcould regulate the development of the host immune system. Hence， theseClostidiumstrains had the potential to be used as probiotics. Since the population ofClostridiumin chicken cecal contents was relative high， the aims of this study were to isolate functionalClostidiumstrains from chicken cecal contents and subsequently study their protective effect againstSalmonellainfection. In this study， a Gram-positive filamentousClostridiumsp C1 which could transfer daidzein to equol， was isolated from chicken cecal contents and then the animal experiments were conducted to study the protective effect ofClostridiumsp C1 onSalmonellainfection. As the tetracycline treated group did， theClostridiumsp C1 also had effect on decreasing the number ofSalmonellain cecal contents and promoting the growth of chicken. Thus， theClostridiumsp C1 had the potential to be used as a tetracycline substitute. Although， the high concentration of S-equol (5 mg·mL-1) had the function on inhibiting the growth ofSalmonellainvitroand theClostridiumsp C1 had the function of transfering daidzein to S-equol， the inhibition effects ofClostridiumsp C1 onSamonellagrowth was not observedinvitro. The probiotic mechanism ofClostridiumsp C1 need to be further studied.

Clostridium; equol; chicken;Salmonella

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.09

2015-07-06

國家自然基金(3100097)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃(2013BAD10B02-03)

尹業(yè)師(1982—)，男，湖南邵陽人，博士，副研究員，主要從事腸道微生態(tài)與微生物資源研究。E-mail: yinyeshi@126.com

，王欣，xxww101@sina.com

S831.7

A

1004-1524(2016)02-0234-06

尹業(yè)師， 方丹， 朱立穎， 等. 產(chǎn)雌馬酚梭菌C1對小雞沙門氏菌攻毒保護(hù)效果[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 28(2): 234-239.