農桿菌遺傳轉化西瓜的影響因素及應用研究進展

趙小強，牛曉偉，范 敏

(浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

?

農桿菌遺傳轉化西瓜的影響因素及應用研究進展

趙小強，牛曉偉，范 敏

(浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

農桿菌介導的遺傳轉化是西瓜基因工程的常用方法。在介紹農桿菌介導西瓜遺傳轉化影響因素和西瓜轉基因應用的基礎上，主要分析了影響農桿菌介導西瓜轉化效率的重要因素，包括農桿菌菌株和載體類型、無菌苗苗齡、外植體類型、預培養時間、共培養時間、農桿菌侵染濃度和時間、抗生素的種類和濃度及乙酰丁香酮等，同時總結了西瓜轉基因研究的多種應用價值及研究成果。

西瓜；農桿菌介導；遺傳轉化；轉化效率

西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum & Nakai]是重要的世界性水果，其食用價值及保健價值較高，在全球十大果品中位居第5位。2013年，中國西瓜種植面積約為1.83×106hm2，總產量約為7.29×107t，面積和產量分別占世界的54%和60%以上，均居世界第一位[1]。雖然目前市場上西瓜品種類型較多，但兼顧品質優、抗性好和產量高等特性的優質品種較少。因此，培育優質西瓜品種是提高市場競爭力的前提。由于西瓜種質資源缺乏，遺傳基礎狹窄，利用常規育種選育新品種較為困難，而轉基因技術具有投入成本低、轉化效率高、轉基因拷貝數低、插入片段確定性好、轉基因表達和遺傳穩定等優點。因此，利用基因工程技術手段進行種質創新，培育優質和高產的新品種已成為當前西瓜遺傳育種研究的熱點。

西瓜轉基因研究中常用的遺傳轉化方法為農桿菌介導法，但由于影響因素較多，導致轉化效率較低，到目前為止還沒有一套高效適用的西瓜遺傳轉化體系。本文在現有研究的基礎上，總結并分析了影響西瓜遺傳轉化效率的主要因素，以及西瓜轉化研究的應用，為建立并獲得高效的西瓜遺傳轉化體系提供參考。

1 影響西瓜遺傳轉化率的因素

1.1 農桿菌菌株與載體的類型

菌株和載體的選擇與組合在西瓜遺傳轉化研究中較為重要，對同一植物而言，不同菌株的敏感性也不同，選擇受體植物敏感的菌株是轉化成功的重要因素之一。常用于西瓜遺傳轉化的農桿菌菌株有LBA4404，EHA101，EHA105，AGL1，A208SE，GV3111SE和EHA101等，實際操作中不同的研究者采用的菌株有所不同，大部分研究者選用LBA4404[2-9]。張志忠等[10]研究表明，農桿菌菌株EHA105的侵染能力明顯優于LBA4404和AGL-1。Cho等[11]研究表明，農桿菌菌株EHA101的侵染能力高于GV3101和LBA4404。

常用于西瓜遺傳轉化的植物表達載體有pBI121，pBin19和pPM7等。Ellul等[4]研究表明，植物表達載體pBI121和pPM7對西瓜品種Dulce Maravilla的遺傳轉化效率較低，分別為5.3%和4.7%。從現有文獻來看，LBA4404和pBI121是適宜西瓜遺傳轉化的農桿菌菌株和載體。

1.2 西瓜基因型

西瓜的再生和轉化均受基因型的影響，不同基因型西瓜在相同濃度激素條件下，再生率和轉化率差異較大。Ellul等[4]研究表明，Sugar Baby，Crimson Sweet和Dulce Maravilla三個品種在相同的培養條件下，轉化效率分別為0.6%，3.1%和5.3%。Yu等[8]研究了在相同培養條件下，Feeling，China baby和Quality這3個不同基因型的西瓜轉化效率的差異，結果表明，Feeling轉化效率最高為10%，China baby轉化率為2.1%，而Quality僅為1.0%。同樣，Huang等[7]也研究了Feeling，China baby和Quality轉基因后代PCR陽性率，分別為7.03%，2.2%和1.25%。因此，在具體研究過程中要根據基因型的不同選擇不同的生長調節劑及轉化條件，以獲得最佳的轉化體系。

1.3 無菌苗苗齡

苗齡是影響誘導不定芽高頻再生的重要因素之一。苗齡決定著西瓜的生理狀態，苗齡太大會導致木質化程度增強，太小則易受農桿菌的毒害，因此苗齡過大或過小都會影響轉化效率。大多數研究表明，苗齡5 d的西瓜子葉是誘導不定芽的最佳外植體[2，6，12-15]，然而，也有其他研究認為苗齡2[3，16]，3[4，8，17-19]，7[7，20]和7～10 d[11，21]的西瓜子葉是誘導不定芽的最佳外植體。張志忠等[22]認為，培養條件和基因型等差異會導致種子發育快慢不同，因此不宜以天數來確定苗齡，而以子葉顏色判斷更有效，無菌苗子葉淺綠色時不定芽誘導率最高，深綠色時不定芽誘導率明顯下降，因此，作者認為子葉生長發育的生理狀態是造成上述現象的關鍵因素，而影響子葉發育的可能因素有種子貯藏時間、消毒劑的類型和工作濃度、消毒時間和培養基類型等。

1.4 外植體類型

外植體的類型對再生率和轉化率也有很大的影響。西瓜的多種組織都可作為外植體進行遺傳轉化，常用的外植體有莖尖[22-25]、頂芽[26]、幼胚[27-28]、成熟胚子葉[15-17，29-33]、下胚軸[27，34]和原生質體[35]等。成熟胚取材不受季節的制約，并且其子葉再生率高于其他外植體，因此，成熟胚子葉被認為是進行遺傳轉化的最佳外植體[3，6-8，10，15，21，36-37]。

1.5 子葉的部位

子葉部位也是影響誘導不定芽的關鍵因素之一，它包括完整子葉、子葉基端部分和子葉頂端部分。

Tabei等[17]和Monacelli等[38]試驗表明，子葉基端部分不定芽的誘導能力要遠遠高于子葉頂端部分。Compton等[39]僅從子葉基端部分誘導獲得不定芽，而從相同子葉頂端切取的外植體則不能誘導出芽，表明西瓜子葉不定芽的誘導受葉片空間位置的限制，而且子葉基端部分具有極性，這與王春霞等[40]、王果萍[14]和Cho等[41]的試驗結果基本一致。切碎的子葉由于傷口的增多，與培養基的緊密接觸而容易吸收養分，誘導時間短，誘導率較高。

萬勇等[42]研究表明，帶完整子葉的頂芽誘導不定芽的效果最好；Li等[37]認為，利用整個子葉誘導不定芽誘導效率高于其他外植體，誘導率為89.67%；而林友豪等[43]研究表明，西瓜帶全子葉、帶半片子葉和不帶子葉上胚軸培養對不定芽的發生有影響，并且前二者形成的不定芽數量顯著多于后者。然而，Choi等[2]研究發現，光照條件下，西瓜子葉頂端部分比子葉基端部分更有利于不定芽的分化，同時他們認為子葉是否能誘導出再生芽取決于有無光源，而非取決于子葉的位置，他們研究發現在黑暗培養條件下，測試品種Sweet Gem和Gold Medal子葉不能誘導出不定芽。

對于不同基因型西瓜子葉外植體最佳位置的選取，要結合選用的激素、培養基和培養條件，并通過預試驗來確定。

1.6 外植體預培養時間

預培養可以調節外植體的生理狀態，使組織代謝活躍進而促進細胞分裂，從而使細胞處于“轉化感受態”狀態，易整合外源DNA從而提高轉化率。但預培養時間不能過長或者過短。未經預培養或預培養時間過短，幼嫩柔弱的外植體經農桿菌侵染后容易受農桿菌的毒害作用，從而褐化并萎蔫，導致不能進一步分化；反之，預培養時間過長，外植體的傷口處于愈合狀態，不利于農桿菌的侵染。張志忠等[10]研究發現，預培養可以避免子葉卷曲和變形而導致的切口邊緣無法接觸培養基等缺點，從而提高轉化效率。秦新民等[44]研究發現預培養1～2 d可提高潮霉素(Hyg)抗性芽的分化，隨著預培養時間的延長抗性芽分化率隨之下降。陳銀華等[21]、李建勇等[45]、孫玉宏等[6]和趙爽[33]研究均表明，預培養時間為2 d 時，西瓜子葉轉化效率最高；Huang等[7]和Yu等[8]研究表明，外植體暗培養3 d有利于轉化效率的提高；而王春霞等[3]研究發現，子葉預培養3～4 d可以顯著提高抗卡那霉素(Kan)芽的分化。結合作者的試驗經驗，適宜的預培養時間應為黑暗條件下培養2～3 d。

1.7 農桿菌侵染濃度和時間

農桿菌菌液濃度和侵染時間均是影響轉化效率的重要因素。在侵染過程中農桿菌會對植物細胞產生毒害從而導致植物細胞產生過敏反應，如果菌液濃度過高，既會對外植體造成傷害，又因菌體相互聚結而影響其在外植體上的附著，從而降低轉化效率；濃度過低不利于外源基因的導入。同樣，侵染時間也要嚴格控制，外植體在菌液中浸泡時間過長，會受農桿菌毒害缺氧而軟腐；浸泡時間太短則農桿菌尚未附著到傷口面，在共培養時無農桿菌生長，不能完成轉化。Park等[19]認為，將子葉置于D600為0.7～0.9的農桿菌菌液中侵染30 min可達到較好的侵染效果；秦新民等[44]研究發現，西瓜子葉侵染時間在10～15 min效果較好；而張志忠等[10]研究表明，子葉在農桿菌菌液D600為0.3的菌液中侵染10 min效果較佳，侵染效率較高，這與李建勇等[45]和孫玉宏等[6]的研究結果一致。因此，應在前人的研究基礎上設計不同梯度試驗，根據結果分析并選擇最佳的菌液濃度和侵染時間。

1.8 乙酰丁香酮

農桿菌轉化植物時常需要誘導物來提高轉化效率，常用的誘導物為乙酰丁香酮(AS)和羥基乙酰丁香酮(HO-AS)，試驗證明AS效果優于HO-AS。張志忠等[10]研究表明，共培養基中添加100 μmol·L-1的AS可以提高GUS基因的瞬時表達，瞬時表達率可達到74.8%，遠遠高于不加AS的瞬時表達率(46.6%)；李建勇等[45]認為，共培養基中添加100 μmol·L-1的AS，可使GUS的瞬時表達率達到70%，遠遠高于沒有添加AS的瞬時表達率(20%)；而Lin等[9]研究發現，農桿菌懸液中添加200 μmol·L-1的AS可明顯提高轉化效率。

1.9 外植體與農桿菌共培養時間

共培養是農桿菌侵染外植體傷口細胞、實現目的基因轉化的關鍵。研究表明，農桿菌在傷口部位附著16 h后，T-DNA才會轉移到植物細胞DNA，實現與植物基因組的整合。共培養時間太短，T-DNA轉移不能完成，外源基因很難整合到植物基因組，導致轉化效率降低；時間太長，農桿菌大量增殖導致外植體過度感染而褐化死亡。大多數研究表明，共培養2～3 d可以提高T-DNA的轉移率，從而提高轉化效率。李建勇等[45]研究發現，共培養3 d時外植體轉化效率達到最高，這與張志忠等[10]、Park等[19]、秦新民等[44]和孫玉宏等[6]的試驗結果一致。而趙爽[33]研究發現，共培養4 d有利于抗性芽的分化。王春霞等[3]研究發現，共培養4 d，Kan抗性芽分化率迅速提高到35%～37%。

1.10 抗生素的選用

共培養之后，為了防止農桿菌過度增殖對植物組織細胞造成傷害和影響植株的再生，在保證不傷害或少傷害外植體的基礎上，選擇最佳濃度的抗生素來完全抑制農桿菌的生長。在西瓜遺傳轉化中常用的抗生素有羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)、氨芐青霉素(Amp)和特美汀(Timentin)等。張志忠等[10]試驗表明，為了防止高濃度的Carb造成外植體水漬化，可采用500 mg·L-1的Cef來抑制農桿菌的生長。李文蘭等[46]研究結果表明，Amp，Carb和Cef濃度低于600 mg·L-1，對西瓜子葉芽分化沒有明顯的影響，高于600 mg·L-1對西瓜子葉芽分化有明顯的抑制作用。3種抗生素中，西瓜子葉對Cef的耐受性更強，250 mg·L-1的Cef有良好的抑制效果。李建勇等[45]認為，Cef最佳的抑菌濃度為300 mg·L-1；孫玉宏等[6]在試驗中發現，300 mg·L-1的Carb適合用于外植體篩選培養；Huang等[7]和Yu等[8]在轉基因植株篩選的過程中發現，100～200 mg·L-1的Carb能較好地抑制農桿菌的生長；而?ürük等[47]研究表明，在西瓜遺傳轉化中添加400 mg·L-1的特美汀，可以在不影響轉化體正常生長的條件下抑制農桿菌的生長。

1.11 篩選劑

對獲得的不定芽進行篩選是獲得轉基因植株的關鍵。不同基因型植株對篩選劑的濃度要求不一致，所以在遺傳轉化之前必須通過預試驗來確定篩選劑的最佳濃度。由于大多數研究者選用的植物雙元表達載體為pBI121，其T-DNA區帶有新霉素磷酸轉移酶基因NPTII表達盒，其轉化子具有Kan抗性。不同的基因型在篩選其轉基因后代時所用Kan濃度不同，如75[48]，100[2-3，5，7-8，49]，125[6]和125～175mg·L-1[4]。

此外，一些表達載體中含有HPT基因，使轉化子具有潮霉素(Hyg)抗性。李文蘭等[46]發現，低濃度Hyg能嚴重抑制根和芽的形成，20 mg·L-1的Hyg為不定芽分化的適宜篩選濃度，6 mg·L-1的Hyg可抑制根的分化。Park等[19]認為，7.5 mg·L-1Hyg篩選效果比40 mg·L-1Kan好。同樣，張志忠等[10]和李建勇等[45]研究表明，西瓜子葉對Hyg較為敏感，15 mg·L-1Hyg可明顯抑制非轉化子的生長。

2 西瓜轉基因研究的應用

2.1 優化遺傳轉化體系

Choi等[2]、張志忠等[10]、孫玉宏等[6]和李建勇等[45]把GUS基因導入不同西瓜品種，通過分析GUS基因的表達來研究影響農桿菌介導西瓜遺傳轉化的若干因素。這為探索并建立西瓜高效遺傳轉化體系奠定了基礎。

2.2 提高西瓜非生物脅迫抗性

Ellul等[4]在優化遺傳轉化體系的基礎上，將酵母耐鹽基因(HAL1)成功導入不同西瓜品種，獲得高耐鹽的轉基因西瓜株系。孫治圖[50]將滲透調節相關的甜菜堿基因通過農桿菌介導轉入西瓜，但僅利用PCR證實獲得了轉基因植株，還沒有進行抗逆性分析。這為利用基因工程技術獲得抗逆西瓜新材料奠定了基礎。

2.3 研究外源基因作用機制

王慧中等[51]將西瓜花葉病毒2號外殼蛋白(WMV-2 CP)基因轉化西瓜，并分析了后代植株抗病性、WMV-2CP基因表達水平和農藝性狀，為進一步明確花葉病毒2號外殼蛋白在西瓜抗病毒病中的作用機理奠定基礎。

2.4 用于改善西瓜品質

王春霞等[3]利用農桿菌介導法成功將番茄的ACC合成酶基因及其反義基因導入西瓜，檢測乙烯釋放指標，結果表明，正反義轉基因植株的ACC氧化酶均有不同程度的表達；常尚連[52]將甜瓜反義酸性轉化酶基因導入西瓜，獲得陽性植株。這為培育耐貯藏和高品質西瓜奠定了基礎。

2.5 用于提高西瓜抗病性

將抗病基因整合到西瓜基因組，有望獲得抗病新品種或新的育種材料，目前這類研究主要集中在抗病毒、真菌和細菌的研究。

Jaynes等[53]研究發現，在西瓜中轉入抗菌肽編碼基因可以有效地抑制西瓜細菌性果斑病的發生。Park等[19]將編碼黃瓜綠葉斑駁病毒外殼蛋白基因(CGMMC-CP)的cDNA轉化到西瓜中，轉化率只有0.1%～0.3%，經抗性鑒定，140株轉基因植株中有10株抗黃瓜綠葉斑駁病毒。王慧中等[48，54]將WMV-1-cp基因導入西瓜后，又將CMV-2cp基因導入浙蜜2號，并培育成高抗WMV-2的轉基因高代純合株系。牛勝鳥等[55]利用西瓜花葉病毒(WMV)外殼蛋白(CP)基因、西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)復制酶基因(Nib)和黃瓜花葉病毒(CMV)復制酶基因構建三價植物表達載體并成功導入西瓜品系H-1，對后代進行病毒接種試驗和抗病性篩選鑒定，獲得感病、抗病、免疫和癥狀恢復等轉基因株系，這為獲得抗病毒病新材料奠定了良好的基礎。Yu等[8]利用農桿菌介導法將小西葫蘆黃化花葉病毒殼蛋白基因(ZYMVCP)和木瓜輪點病毒殼蛋白基因(PRSVWCP)成功導入西瓜并獲得抗病毒的轉基因植株。Huang等[7]利用農桿菌介導法將含有西瓜銀色斑駁病毒的核蛋白基因(WSMoVN)轉入西瓜，獲得了抗病毒的轉基因植株。Lin等[9]將4個病毒外殼蛋白基因片段導入西瓜，經檢測轉基因植株可以抵抗多種病毒。以上這些研究為西瓜抗病毒病育種奠定了基礎。

張明方等[5]將葡聚糖酶基因和幾丁質酶基因成功導入浙蜜2號，為獲得抗枯萎病植株奠定了基礎。張志忠等[36]構建了同時含有番茄幾丁質酶基因(Chi3)和β-1， 3-葡聚糖酶基因(Glu-Ac)的雙價抗真菌基因植物表達載體，采用農桿菌介導法將Chi3和Glu-Ac同時導入西瓜栽培種中育一號，并獲得抗病性增強的轉基因植株。肖守華[56]成功獲得含有煙草幾丁質酶基因(CHI)、煙草β-1，3-葡聚糖酶基因(GLU)和小麥硫堇蛋白基因(THI)的三價抗真菌融合基因的高抗轉基因植株，抗病檢測表明幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性比對照高出5～6倍。高寧寧[57]將銀杏抗菌肽基因Gnk2-1成功轉入到西瓜，獲得的轉基因植株對枯萎病抗性有所增強。這些研究結果為西瓜抗真菌病害育種奠定了基礎。

2.6 雄性不育基因的轉入及其他方面的研究

陳銀華等[21]利用農桿菌介導法將帶有雄性不育基因、除草劑基因及卡那霉素抗性基因的質粒pBI-TBSbar成功導入京欣一號及親本自交系，獲得轉基因植株。這為開展西瓜雄性不育基因工程研究奠定了基礎。

Kato等[58]在干旱誘導轉錄因子CLMYB1功能基因篩選的基礎上，對西瓜進行遺傳轉化，進而研究其對野生西瓜根系生長的影響。此外，Youk等[59]以轉CGMMV-CP西瓜為材料，通過研究轉基因植株的拷貝數、整合位點及轉錄元件表達水平，建立西瓜轉基因砧木分子遺傳評估的科學體系。

3 西瓜遺傳轉化涉及的主要問題及展望

3.1 轉化植株水漬化現象

3.2 西瓜自身優良基因的挖掘及克隆

雖然已經獲得抗病毒病、枯萎病和抗逆等優良性狀的西瓜轉基因株系，但是這些基因幾乎都來源于其他物種，從西瓜自身獲得優良基因的研究鮮有報道。野生種質PI296341是抗枯萎病的優質資源，從中獲得抗病基因并轉入栽培品種顯得尤為重要。相信隨著分子標記的深入研究和西瓜基因組測序技術的完成，西瓜優良基因的克隆也將會迎來新的轉機。

3.3 功能基因的多樣化

目前，大多研究者把注意力集中在西瓜抗病毒病和枯萎病的研究上，而對改良西瓜品質、抗逆和控制生長發育等方面的研究較少，因此下一步應加強關于品質改良、抗逆和控制生長發育基因的遺傳轉化研究。與此同時，多基因替代單基因的轉化也是西瓜轉基因發展的主要方向。

3.4 轉基因西瓜的安全性

隨著轉基因技術在蔬菜品種改良中的廣泛應用，其安全性問題日益受到重視。Kim等[65]試驗表明，轉基因西瓜的外源基因會漂移到非轉基因西瓜中。而應奇才等[66]在研究抗病毒轉基因西瓜時發現，與對照相比，轉基因西瓜抗病毒能力顯著提高，而生物學性狀、含糖量和越冬能力等沒有顯著差異；并且毒性試驗、突變試驗和飼喂小鼠試驗均表明，該轉基因西瓜屬于安全食品[67]。為了避免不安全因素，研究者可通過無標記轉化、西瓜內源基因挖掘及轉化、加強安全性評價等工作來有效地解決安全問題。

4 結論

總之，西瓜遺傳轉化受多因素的影響，其中基因型、外植體類型及無菌苗苗齡對轉化率的提高至關重要，選擇適宜的試驗材料是西瓜轉基因研究的基礎。遺傳轉化過程中，預培養、共培養、侵染時間和菌液濃度、抗生素等均會影響到轉化效率，對這些因素進行探索有利于建立一套高效適用的西瓜遺傳轉化體系，對提高西瓜抗病性、抗逆性和改良品質并獲得新的種質具有重要意義。

[1] 農業部. 2013年全國各地蔬菜、西瓜、甜瓜、草莓、馬鈴薯播種面積和產量[J]. 中國蔬菜， 2015 (1): 12.

[2] CHOI P S， SOH W Y， KIM Y S， et al. Genetic transformation and plant regeneration of watermelon usingAgrobacteriumtumefaciens[J].PlantCellReports， 1994， 13(6): 344-348.

[3] 王春霞， 簡志英， 劉愚， 等. ACC合成酶基因及其反義基因對西瓜的遺傳轉化[J]. 植物學報， 1997， 39(5): 445-450.

[4] ELLUL P， RIOS G， ATARé A， et al. The expression ofSaccharomycescerevisiaeHAL1 gene increases salt tolerance in transgenic watermelon [Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum.& Nakai.][J].TheoreticalandAppliedGenetics， 2003， 107(3): 462-469.

[5] 張明方， 于天祥， 楊景華， 等. 農桿菌介導西瓜轉葡聚糖酶及幾丁質酶雙基因[J]. 果樹學報， 2006， 23(3): 475-478.

[6] 孫玉宏， 韓長磊， 張椿雨， 等. 根癌農桿菌介導獲得轉基因西瓜植株[J]. 華中農業大學學報， 2007， 26(5): 684-688.

[7] HUANG Y C， CHIANG C H， LI C M， et al. Transgenic watermelon lines expressing the nucleocapsid gene ofWatermelonsilvermottlevirusand the role of thiamine in reducing hyperhydricity in regenerated shoots[J].PlantCell，TissueandOrganCulture， 2011， 106(1): 21-29.

[8] YU T A， CHIANG C H， WU H W， et al. Generation of transgenic watermelon resistant toZucchiniyellowmosaicvirusandPapayaringspotvirustype W[J].PlantCellReports， 2011， 30(3): 359-371.

[9] LIN C Y， KU H M， CHIANG Y H， et al. Development of transgenic watermelon resistant toCucumbermosaicvirusandWatermelonmosaicvirusby using a single chimeric transgene construct[J].TransgenicResearch， 2012， 21(5): 983-993.

[10] 張志忠， 吳菁華， 呂柳新. 根癌農桿菌介導的西瓜遺傳轉化研究[J]. 果樹學報， 2005， 22(2): 134-137.

[11] CHO M A， MOON C Y， LIU J R， et al.Agrobacterium-mediated transformation inCitrulluslanatus[J].BiologiaPlantarum， 2008， 52(2): 365-369.

[12] DONG J Z， JIA S R. High efficiency plant regeneration from cotyledons of watermelon (CitrullusvulgarisSchrad.)[J].PlantCellReports， 1991， 9(10): 559-562.

[13] 黃學森， 焦定量， 那麗. 西瓜子葉離體培養獲得再生植株[J]. 中國西瓜甜瓜， 1994 (3): 15-16.

[14] 王果萍. 西瓜高效組織培養技術體系研究[J]. 中國西瓜甜瓜， 2002 (2): 1-3.

[15] PIRIN? V， ONAY A， YILDIRIM H， et al. Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of diploid diyarbakir watermelon (Citrulluslanatuscv. “Sürme”)[J].TurkishJournalBiology， 2003， 27: 101-105.

[16] COMPTON M E， GRAY D J. Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of tetraploid watermelon[J].HortScience， 1993， 29(3): 211-213.

[17] TABEI Y， YAMANAKA H， KANNO T. Adventitious shoot induction and plant regeneration from cotyledons of mature seed in watermelon (CitrulluslanatusL.)[J].PlantTissueCultureLetters， 1993， 10(3): 235-241.

[18] KRUG M G Z， STIPP L C L， RODRIGUEZ A P M， et al.Invitroorganogenesis in watermelon cotyledons[J].PesquisaAgropecuriaBrasileira， 2005， 40(9): 861-865.

[19] PARK S M， LEE J S， JEGAL S， et al. Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (Cucumbergreenmottlemosaicvirus) infection[J].PlantCellReports， 2005， 24(6): 350-356.

[20] CHATURVEDI R， BHATNAGAR S P. High-frequency shoot regeneration from cotyledon explants of watermelon cv. Sugar Baby[J].InVitroCellularandDevelopmentalBiologyPlant， 2001， 37(2): 255-258.

[21] 陳銀華， 張廣平. 雄性不育基因Barnase對西瓜的遺傳轉化 [J]. 湖南農業大學學報(自然科學版)， 2006， 32(2): 128-130.

[22] 張志忠， 吳菁華， 呂柳新. 西瓜高頻再生系統的研究[J]. 中國農學通報， 2004， 20(2): 151-153.

[23] ANGHEL I， ROSU A.Invitromorphogenesis in diploid， triploid and tetraploid genotypes of watermelon-Citrulluslanatus(Thump.) Mansf [J].RevueRoumaineDeBiologieBiologieVegetable， 1985， 30: 43-55.

[24] COMPTON M E， GRAY D J， ELMSTROM G W. A simple protocol for micropropagating diploid and tetraploid watermelon using shoot-tip explants[J].PlantCellTissueandOrganCulture， 1993， 33(2): 211-217.

[25] 秦新民， 張麗珍， 李文蘭. 西瓜高效再生系統的研究[J]. 廣西師范大學學報(自然科學版)， 2003， 21(2): 75-78.

[26] 任春梅， 董延瑜， 洪亞輝， 等. 基因槍介導的西瓜遺傳轉化研究[J]. 湖南農業大學學報(自然科學版)， 2000， 26(6): 432-435.

[27] AHAD A， ISLAM R， HOSSIAN M， et al. Plant regeneration from immature and mature embryo axes of watermelon[J].PlantTissueCulture， 1994， 4: 39-44.

[28] 董炎， 張潔， 張海英， 等. 西瓜未成熟胚高效再生體系的建立[J]. 中國瓜菜， 2014， 27(3): 10-13.

[29] LI J， TANG Y， QIN Y G， et al.Agrobacterium-mediated transformation of watermelon (Citrulluslanatus)[J].AfricanJournalofBiotechnology， 2012， 11(24): 6450-6456.

[30] WANG X Z， SHANG L M， LUAN F S. A highly efficient regeneration system for watermelon (CitrulluslanatusThunb.)[J].PakistanJournalofBotany， 2013， 45(1): 145-150.

[31] SHASTHREE T， RAMAKRISHNA D， IMRAN M A， et al. Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from leaf and cotyledon explants ofCitrulluscolocynthis[J].JournalofHerb，Spices&MedicinalPlants， 2014， 20(3): 235-244.

[32] ZHANG L， LAI J， TANG Y， et al. Improved induction of somatic in watermelon[Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum. et Nakai][J].JournalofAgriculturalScience， 2014， 6(2): 82-89.

[33] 趙爽. 西瓜非生物脅迫響應R2R3MYB轉錄因子基因鑒定[D]. 武漢: 華中農業大學， 2014.

[34] ISLAM R， AHAD A， REZA M A， et al.Invitroplant regeneration from zygotic embryos ofCitrulluslanatusThunb[J].PakistanJournalofScientificandIndustrialResearch， 1997， 38(11): 445-447.

[35] MA C P， ZHANG X P， RHODES B B. Protoplast isolation and culture of watermelon cotyledons[J].ReportCucurbitGeneticsCooperative， 1993， 16: 81-83.

[36] 張志忠， 吳菁華， 呂柳新. 雙價抗真菌基因表達載體的構建及轉基因西瓜的研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2005， 13(5): 369-374.

[37] LI J， LI X M， QIN Y G， et al. Optimized system for plant regeneration of watermelon (CitrulluslanatusThumb.)[J].AfricanJournalofBiotechnology， 2011， 10(48): 9760-9765.

[38] MONACELLI B， ALTAMURA M M， PASQUA G， et al. The histogenesis of somaclones from tomato (LycopersiconesculentumMill.) cotyledons[J].Protoplasma， 1988， 142(2): 156-163.

[39] COMPTON M E， GRAY D J. Shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of diploid， triploid， and tetraploid watermelon[J].JournaloftheAmericanSocietyHorticulturalScience， 1993， 118(1): 151-157.

[40] 王春霞， 簡志英， 劉愚， 等. “京欣一號”西瓜子葉組織培養的研究[J]. 園藝學報， 1996， 23(4): 401-403.

[41] CHO S M， OH S A， CHOI Y S， et al. Effect of plant growth regulators regeneration from the cotyledon explants in watermelon (Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum. & Nakai.)[J].KoreanJournalPlantResearch， 2014， 27(1): 51-59.

[42] 萬勇， 張錚， 劉紅梅， 等. 西瓜組織培養快速繁殖的初步研究[J]. 江西農業學報， 2002， 14(4): 47-50.

[43] 林友豪， 周謨兵， 孫玉宏， 等. 基本培養基、激素在西瓜組織培養中對不定芽發生的影響[J]. 湖北農業科學， 2003 (6): 71-73.

[44] 秦新民， 張麗珍， 李文蘭， 等. 西瓜NPR1抗病基因的遺傳轉化[J]. 廣西師范大學學報(自然科學版)， 2006， 24(2): 81-85.

[45] 李建勇， 丁淑麗， 孫利祥， 等. 影響西瓜農桿菌介導的高效遺傳轉化效率的主要因子[J]. 浙江農業學報， 2007， 19(3): 197-201.

[46] 李文蘭， 秦新民， 海洪， 等. 基因轉化過程中抗生素對西瓜外植體分化的影響[J]. 桂林工學院學報， 2007， 27(3): 406-411.

[47] ?üRüK S， MEE E. Watermelon transformation withZucchiniyellowmosaicviruscoat protein gene and comparison with parental cultivar[J].PesquisaAgropecuriaBrasileira， 2012， 47(1): 66-75.

[48] 王慧中， 周曉云， 張西寧. 西瓜基因轉化及其轉基因植株再生的研究[J]. 實驗生物學報， 1997， 30(4): 453-459.

[49] AKASHI K， MORIKAWA K， YOKOTA A.Agrobacterium-mediated transformation system for the drought and excess light stress-tolerant wild watermelon (Citrulluslanatus)[J].PlantBiotechnology， 2005， 22(1): 13-18.

[50] 孫治圖. 農桿菌介導的甜菜堿基因轉化西瓜的初步研究[D]. 重慶: 西南大學， 2008.

[51] 王慧中， 趙培潔， 徐吉臣， 等. 轉WMV-2外殼蛋白基因西瓜植株的病毒抗性[J]. 遺傳學報， 2003， 30(1): 70-75.

[52] 常尚連. 西瓜糖代謝及甜瓜酸性轉化酶反義基因的西瓜遺傳轉化[D]. 泰安: 山東農業大學， 2006.

[53] JAYNES J M， XANTHOPOULOS K G， DESTéFANO-BELTRN L， et al. Increasing bacterial disease resistance in plants utilizing antibacterial genes from insects[J].Bioessays， 1987， 6(6): 263-270.

[54] 王慧中， 趙培潔， 周曉云. 農桿菌法轉化獲得轉基因西瓜植株[J]. 浙江大學學報(農業與生命科學版)， 2000， 26(1): 111-113.

[55] 牛勝鳥， 黃學森， 王錫民. 三價轉基因抗病毒西瓜的培育[J]. 農業生物技術學報， 2005， 13(7): 10-15.

[56] 肖守華. 西瓜、甜瓜遺傳轉化體系的建立及轉基因植株的抗病性分析[D]. 濟南: 山東農業大學， 2006.

[57] 高寧寧. 銀杏抗菌肽基因Gnk2-1轉化甜瓜和西瓜的研究[D]. 楊凌: 西北農林科技大學， 2011.

[58] KATO A， KAJIKAWA M， NANASATO Y， et al. Functional analysis of drought-induced transcriptional regulatory factorCLMYB1 in the roots of wild watermelon[J/OL].Plant&animalgenome， 2015 [2015-06-01]. https://pag.confex.com/pag/xxiii/webprogram/Paper15888.html.

[59] YOUK E S， PACK I S， KIM Y J， et al. A framework for molecular genetic assessment of a transgenic watermelon rootstock line[J].PlantScience， 2009， 176(6): 805-811.

[60] VINOTH A， RAVINDHRAN R. Reduced hyperhydricity in watermelon shoot cultures using silver ions[J].InVitroCellularandDevelopmentalBiology-Plant， 2015， 51(3): 258-264.

[61] SIVANESAN I， SONG J Y， HWANG S J， et al. Micropropagation ofCotoneasterwilsoniiNakai-a rare endemic ornamental plant[J].PlantCell，TissueandOrganCulture， 2010， 105(1): 55-63.

[63] BRAND M H. Agar and ammonium nitrate influence hyperhydricity， tissue nitrate and total nitrogen content of serviceberry (Amelanchierarborea) shootsinvitro[J].PlantCell，TissueandOrganCulture， 1993， 35(3): 203-209.

[64] SAHER S， PIQUERAS A， HELLIN E， et al. Prevention of hyperhydricity in micropropagated carnation shoots by bottom cooling: implications of oxidative stress[J].PlantCell，TissueandOrganCulture， 2005， 81(2): 149-158.

[65] KIM C G， LEE B， KIM D I， et al. Detection of gene flow from GM to non-GM watermelon in a field trial[J].JournalofPlantBiology， 2008， 51(1): 74-77.

[66] 應奇才， 徐祥彬， 施農農， 等. 轉WMV-2CP基因西瓜中間試驗的農藝性狀評價[J]. 浙江農業科學， 2010 (3): 482-484.

[67] 應奇才， 薛大偉， 徐祥彬， 等. 轉WMV-2CP基因西瓜的安全性評價[J]. 浙江農業科學， 2009 (5): 966-970.

(責任編輯 侯春曉)

《浙江農業學報》投稿須知

《浙江農業學報》——北大版中文核心期刊，中國科學引文數據庫(CSCD)核心庫來源期刊，RCCSE中國核心學術期刊(武大版)，中國科技核心期刊，英國CAB文摘數據庫來源期刊，國內外公開發行的綜合性學術期刊(月刊)，由浙江省農業科學院和浙江省農學會聯合主辦。主要刊登涉農各學科領域具有原創性或較高學術水平的研究論文及綜述，常設欄目有：作物科學、動物科學、園藝科學、植物保護、環境資源、食品科學、生物系統工程、農業經濟與發展等。熱忱歡迎相關領域科研人員及高等院校師生投稿。

1 投稿方式

請登陸本刊唯一官方網站http://www.zjnyxb.cn/CN/volumn/home.shtml，點擊左側的“作者投稿”，按提示步驟操作(對于首次投稿的作者，請先注冊)。編輯部在收到稿件并入庫以后，系統會自動發出一封收稿回執。如未收到，請及時與編輯部取得聯系。聯系電話：0571-86404055。E-mail：zjnyxb@126.com。請勿一稿多投。

投稿時，請注意上傳word文檔，無需提供PDF文檔。對于圖件、含有原始數據的EXCEL文件或其他文檔，可統一壓制成壓縮包，以附件形式上傳。投稿文檔格式詳見網站《論文格式》。

本刊在稿件錄用之前，不收取任何形式的審稿費或初審費，作者謹防上當。

2 投稿約定

作者所投稿件應為國內外尚未公開發表過的原創論文，不涉及學術不端行為。在向我刊投稿期間，作者不得將稿件同時投往其他期刊。部分稿件可能外審時間較長，如果作者決定改投他刊，請及時與編輯部取得聯系。

來稿應注意保守國家秘密，無涉外保密內容。多作者稿件，投稿前務必征得所有作者同意。否則，一切責任和損失均由作者自行承擔。

來稿在本刊發表后，論文的數字化復制權、發行權、匯編權及信息網絡傳播權即轉讓本刊編輯部，其版權為《浙江農業學報》所有。論文的著作權使用費在本刊的稿酬中一次性支付，作者可使用該文章進行展覽、匯編，或展示在自己的網站上，仍享有非專有使用權。本刊已加入中國科學引文數據庫、中國科技論文統計分析數據庫、中國學術期刊綜合評價數據庫、萬方數據資源系統數字化期刊群數據庫等。本刊發表的所有文章，均同時在上述載體發布。作者若不同意將文章編入上述數據庫，請改投他刊。

稿件正式刊發后，待印刷完畢，寄樣刊2本。另酌致稿酬。

3 稿件處理流程

一般情況下，稿件從入庫到終審完成所需時間在3個月以內，在此期間，作者可隨時登陸系統，查看稿件處理進程。具體處理流程為： 收稿→初審→外審→終審→編輯加工→校對→發稿。

4 行文要求

4.1 文稿

應為國內外尚未公開發表過的原創論文，其中，研究論文應具有一定的學術創新性，文章內容要求論點明確、方法得當、數據可靠、圖表清楚、文字簡潔，邏輯連貫。投稿時請提供相應的Word文件，圖表插入在文檔中適當位置，并單獨提供圖的原始文件(含原始數據)。

4.2 題目與標題

文章題目務求簡明，準確涵蓋文章內容，標題長度一般不應超過20個字。中英文題目須一致。文章內容可采用分級標題，但各級標題一般不超過3個層次，用阿拉伯數字連續編號，分別以如1，1.1，1.1.1的方式表示。

4.3 作者與單位

署名應僅限于參加本工作并能解答論文中有關問題者，中國作者英文姓名用漢語拼音拼寫，姓氏大寫，名字的首字母大寫，雙名間用連字符隔開，如CHEN Jian-ping，ZHENG Tao；外國作者按其習慣書寫，姓前名后，名可用縮寫，字母間不加縮略點。多位作者的署名之間應用逗號隔開，對于不同單位的作者，應在姓名右上角加注不同的阿拉伯數字序號，并在其工作單位名稱之前加與作者姓名序號相同的數字。作者單位須至系、所一級，并注明工作單位所在省份、城市名及郵政編碼，各工作單位之間以“；”隔開。中英文姓名與單位須保持一致。

4.4 摘要和關鍵詞

摘要應用簡明的語言對文章的實質內容進行全面而具體的概述、提煉，使摘要的信息與論文等價，并具有獨立性和自明性。研究類論文的摘要一般應主要闡明研究目的(或擬解決的主要問題)、研究方法、主要結果與結論，重點突出研究的創新之處。建議選擇如“采用…方法對…進行了研究，結果表明：……”等類似句式進行表述。綜述類論文的摘要主要闡明概況性的論述內容，盡量應包括文章的主要論點與重要的論證、數據等內容。摘要中請使用第三人稱，盡量避免使用“我們”“作者”“本文”等作為主語。英文摘要務必與中文摘要保持核心內容的一致性，并請注意語言的連貫性，避免使用中式英語或點對點的中英對譯。在寫作時，用過去時態敘述作者的研究工作和試驗結果。

關鍵詞應選用能反映文章特征內容并較為通用的規范性詞匯和專業術語，一般每篇3～8個，文章的中、英文關鍵詞須一致。

4.5 首頁腳注

主要包括收稿日期、基金項目、作者簡介與通信作者。其中，收稿日期由編輯部填寫；基金項目主要標注產生論文的科研資助項目類別和項目編號，無須給出詳細的課題名稱，多項基金項目并列時依次羅列，以“；”隔開；作者簡介只需給出第一作者的個人信息，包括姓名、出生年份、性別、籍貫、民族(漢族可不標注)、學位、職稱、研究方向、E-mail、辦公電話與手機)；通信作者，只需給出通信作者的E-mail、辦公電話與手機。若有兩名通信作者并列時，請分別給出每位通信作者的聯系方式。

4.6 物理量和計量單位

請使用符合國家標準和國際規范的物理量與計量單位，不可使用M(物質的量濃度)、畝、rmp(轉速)等已廢棄的單位。在正文和圖表中，計量單位一律使用規定的單位字母符號書寫，而不使用中文。表示體積單位升的符號為“L”，字母大寫，不使用“l”。由多個單位組合而成的單位，使用“·”連接，如r·min-1(轉速)、mol·L-1(物質的量濃度)。數字與單位之間統一空一英文字符，百分號除外，如“3 L，37 ℃，4 000 r·min-1，25%，4 mol·m-2·s-1”。

凡在文章中出現的外文字母和文種、正斜體、黑體等易混淆的地方務必書寫清楚。對于公式中出現的變量，應使用斜體。計量單位、化學元素符合等為正體，矩陣、矢量、張量符號為黑斜體。生物學名中的屬以下分類單元名的有關部分，如OryzasativaL.subsp.indicaKato；基因名，如actin等；限制性內切酶，如EcoRⅠ等(前3個字母用斜體，序號用正體)，耐熱性DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶等；期刊名，如Science，Genetics，JournalofAgricultureandFoodChemistry等需排斜體。

4.7 數字

文章中出現的公元世紀、年代、年、月、日、時刻等各種數字，一律用阿拉伯數字表示。年份不得簡寫，如“1993—1994”不能寫成“1993—94”；圖表中表示時間的年、月、日之間用英文連字符，如1999年5月8日應寫成1999-05-08。4位以上數字及小數點后含多位的數字每3位空半格(不用逗號隔開)，如：19367寫成19 367。

4.8 外文縮略語

采用國際上慣用的縮略語。如名詞術語DNA(脫氧核糖核酸)、ATP(三磷酸腺苷)、ABA(脫落酸)、LSD(最小顯著差)等，機構名縮略語FAO(聯合國糧農組織)等。對于文中有些需要臨時寫成縮寫的詞，需在第一次出現處寫出全稱，表及圖中則用注解形式在下方注明，以便讀者理解。

4.9 圖和表

文稿中，凡能用文字簡述清楚的問題，盡量不用圖、表。如使用圖、表，則在正文中請勿重復其數據，僅說明主要結果和趨勢即可。圖、表的設計應科學美觀，具有自明性。所有表格均使用“三線表”，線圖盡量用Excel制作，圖表均需給出中英文圖題和表題，表內各欄、圖的標目(物理量的符號和計量單位)、圖注和表注均需中英對照，圖表插入文中適當的位置。表內各欄以及圖的標目均須表示成“量名稱或指標名稱/單位符號”，如“質量/g”；對于組合單位，則加括號，如“產量/(t·hm-2)”。

Influencing factors and research progress on transformation of watermelon by Agrobacterium

ZHAO Xiao-qiang， NIU Xiao-wei， FAN Min*

(InstituteofVegetables，AcademyofZhejiangAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Agrobacterium-mediated genetic transformation was the commonly used method in the watermelon genetic engineering. On the basis of an introduction about the influencing factors ofAgrobacterium-mediated transformation of watermelon and the application of transgenic watermelon， this study summarized the major influencing factors in genetic transformation process of watermelon， such as the strain ofAgrobacterium， the type of vector， the age of seedling， the type of explants， pre-culture time， co-culture time， the concentration and time of infection， the type and concentration of antibiotics and the concentration of acetosyringone. The application value and achievement of transgenic watermelon were also reviewed.

watermelon;Agrobacterium-mediated; genetic transformation; transformation efficiency

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.28

2015-06-11

浙江省農業新品種選育重大科技專項(2012C12903)；浙江省自然科學基金(LQ13C150004)

趙小強(1985—)，男，甘肅天水人，博士，主要從事西瓜遺傳育種與生物技術研究。E-mail: wushan2002zxq@163.com

*通信作者，范敏，E-mail: fanminfm@sina.com

S651

A

1004-1524(2016)01-0171-08

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):171-178

趙小強，牛曉偉，范敏. 農桿菌遺傳轉化西瓜的影響因素及應用研究進展[J]. 浙江農業學報， 2016， 28(1): 171-178.