鮑蒸煮液美拉德反應條件的優化

吳靖娜，路海霞，靳艷芬，位紹紅，劉智禹

(1. 福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013； 2. 福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門 361013； 3. 集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021)

(1. Fisheries Reasearch Instiute of Fujian， Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province， Xiamen 361013， China; 2. Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources， Xiamen 361013， China; 3. College of Food and Biological Engineering， Jimei University， Xiamen 361021， China)

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鮑蒸煮液美拉德反應條件的優化

吳靖娜，路海霞，靳艷芬，位紹紅，劉智禹

(1. 福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013； 2. 福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門 361013； 3. 集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021)

以鮑蒸煮液為原料，利用美拉德反應獲得具有特殊風味的產物。在單因素實驗的基礎上，利用響應面法對美拉德反應工藝進行優化，建立了溫度、時間、糖濃度與褐變程度、中間產物、游離氨基酸含量之間的數學模型。根據模擬得到的二次回歸模型確定了美拉德反應的最佳工藝條件：反應溫度115 ℃、反應時間84 min、糖(葡萄糖∶木糖=2∶3)濃度5%，得到的反應液為紅褐色、燒烤味濃郁，此時D420=0.552、D294=0.653、游離氨基酸含量3.93 mg·mL-1。

鮑蒸煮液；美拉德反應；響應面法

(1.FisheriesReasearchInstiuteofFujian，KeyLaboratoryofCultivationandHigh-valueUtilizationofMarineOrganismsinFujianProvince，Xiamen361013，China; 2.FujianCollaborativeInnovationCenterforExploitationandUtilizationofMarineBiologicalResources，Xiamen361013，China; 3.CollegeofFoodandBiologicalEngineering，JimeiUniversity，Xiamen361021，China)

近年來，鮑產業已成為福建省海水養殖的支柱產業之一，也是增長速度最快、經濟效益最好的水產產業。據報道， 2013年，福建省的鮑養殖量就達到8.85萬t，約占全國鮑產量的80%[1]，產值近80億元，占全省海水養殖總產值的15.2%。同時，鮑加工業也迅猛發展，2014年，福建省有20多家水產加工企業開發生凍、熟凍、罐頭和干制等鮑產品，在鮑加工過程中產生了大量含有豐富多肽及氨基酸的蒸煮液，目前尚未得到充分的利用。

熱反應香精是由食品原料和允許在食品或反應香精中添加的原料加熱制備的產物，利用熱反應形成的香精在國際上被認為是屬于天然香精香料范疇，而在熱反應制備香精中最重要的就是美拉德反應[2]。美拉德反應(Maillard reaction)是一種非酶褐變反應，本質上是羰氨縮合，主要指的是醛、酮、還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質等含氮化合物的氨基之間發生反應，進而生成種類繁多的美拉德反應產物，如揮發性香氣物質、高活性且有紫外吸收的中間產物和復雜的棕黑色大分子物質類黑精[3]，這些產物可賦予食品獨特的色澤和風味[4]。在鮑蒸煮液中添加一定的還原糖，經過美拉德反應制備獨特海鮮味香精基料，既可充分利用鮑蒸煮液提高其附加值，又可用于開發新型香精，具有廣闊的前景和市場價值。因此，本試驗采用鮑蒸煮液為原料，與還原糖在高溫下發生美拉德反應獲取含有鮑特有風味的海鮮香精基料。以褐變程度、中間產物以及游離氨基酸含量為考核指標，在單因素試驗基礎上采用響應面法對其美拉德反應條件進行優化，探索制備具有鮑特有風味香精基料的最優工藝，為實現鮑資源的高值化開發、全值化利用提供技術參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鮑蒸煮液，由廈門島之原生物科技有限公司提供。木糖、葡萄糖均為食品級，無水乙醇、茚三酮等均為分析純。

1.2 儀器和設備

FE20型pH計(梅特勒托利多儀器有限公司)；DU-30G型電熱恒溫油浴鍋(上海恒科學儀器有限公司)；多功能卷式膜小試設備(廈門福美科技有限公司)；5804R型低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；XW-80A型旋渦混合儀(海門市其林貝爾有限公司)；BS124S型分析天平(賽多利亞科學儀器(北京)有限公司)；SP-756P型紫外可見分光光度計(上海光譜有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 鮑蒸煮濃縮液的制備

鮑蒸煮液經200 nm陶瓷膜除雜，再經反滲透膜和截留分子量150 u的納濾膜濃縮過濾，獲得2 800 mL可溶性固形物含量為10%的鮑蒸煮濃縮液。經測定，鮑蒸煮液的蛋白質含量為4.50%，多肽含量為0.35 mg·mL-1，游離氨基酸的含量為1.58 mg·mL-1。

1.3.2 美拉德反應產物制備

取10 mL按1.3.1節制備的濃縮液于250 mL錐形瓶內，按照一定比例添加葡萄糖、木糖，混勻使糖充分溶解，密封，置于恒溫油浴鍋進行熱反應。

1.3.3 美拉德反應條件的優化

單因素試驗：糖配比的選擇：取10 mL濃縮液，分別加入不同比例的葡萄糖和木糖，分成7組，分別為(1)0 g；(2)1.0 g 葡萄糖(P)+0 g 木糖(M)；(3)0.8 g P+0.2 g M；(4)0.6 g P+0.4 g M；(5)0.4 g P+0.6 g M；(6)0.2 g P+0.8 g M；(7)0 g P+1.0 g M；于110 ℃反應30 min。反應溫度的選擇：選定溫度為80，90，100，110，120，130 ℃的體系環境進行美拉德反應，研究溫度對美拉德反應體系的影響。反應時間的選擇：在110 ℃溫度下設定反應時間分別為0，15，20，25，30，60，90，120 min，研究反應時間對美拉德反應的影響。糖濃度的選擇：按照最適添加比例配制不同糖濃度的反應液，測定反應產物中還原糖含量，選出最適糖濃度。

響應面試驗：根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理[5]，以褐變程度、中間產物、游離氨基酸含量為響應值，在單因素實驗的基礎上，選取反應溫度、反應時間、糖濃度進行響應面設計，因子編碼及各自變量水平見表1。

1.4 測定方法

1.4.1 美拉德反應產物pH值的測定

待反應產物冷卻至室溫后，用pH計直接測定反應產物的pH。

1.4.2 美拉德反應產物中間產物的測定

將美拉德反應產物稀釋500倍，在294 nm處測定吸光度[6]。

表1 試驗因素水平表

Table 1 Analytical factors and levels

因素水平-101反應溫度/℃105110115反應時間/min8090100糖濃度/%567

1.4.3 美拉德反應產物褐變程度的測定

將美拉德反應產物稀釋200倍，在420 nm處測定吸光值[7]。

1.4.4 游離氨基酸的測定

采用茚三酮比色法[5]進行游離氨基酸的測定。用亮氨酸為標準品，以亮氨酸濃度mg·mL-1為x，以D值為y，繪制標準曲線，得到回歸方程：y=0.051 8x-0.004 8，R2=0.991 8。

1.4.5 還原糖的測定

測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[8]進行還原糖的測定。用葡萄糖標準液代替樣品進行測定，以每mg葡萄糖為x，以D值為y，繪制標準曲線，得到回歸方程：y=9.416 1x+0.011 2，R2=0.997 0。

反應率/%=

2 結果與分析

2.1 糖配比的確定

糖類對美拉德反應產物褐變程度影響大小為:五碳糖>六碳糖>雙糖，醛糖>酮糖，五碳糖中木糖反應性好、風味良好、價廉易得[9]。六碳糖中葡萄糖屬于醛糖，美拉德反應速率較其他醛糖更快。其中木糖是產生呋喃類物質的良好前體物，呋喃類物質具有甜味和焦糖香，對產物香味有重要貢獻[10]。木糖和葡萄糖同時添加所得的產物中低分子量中間體的含量較單獨添加一種還原糖高[11]。

本試驗選取不同比例的葡萄糖和木糖作為反應糖，在110 ℃，反應30 min，結果見表2。由表2可知，各體系的pH逐漸降低，這是由于美拉德反應過程中產生了甲酸和乙酸等有機酸[12-13]，使得體系的pH降低，pH值下降的程度是衡量美拉德反應劇烈程度的一個指標。褐色的類黑精是美拉德反應的重要產物，褐變程度提供了一個可視化的測量手段，各體系中D420隨木糖含量的增加總體呈升高的趨勢，在0 g P+1.0 g M組，D420已升至0.387，反應液的顏色太深，不宜作為美拉德反應的糖配比。美拉德反應產物中的低分子量香味中間體可以用294 nm紫外吸收值表示，吸收值越大，香味物質越多，由表2可知中間產物含量隨木糖含量的升高總體呈現上升的趨勢。游離氨基酸與糖或糖降解產物之間的反應對產物風味物質的形成具有重要的貢獻[14]，由表2我們可以看出氨基酸含量的變化趨勢沒有規律，這是由于游離氨基酸含量主要取決于Strecker降解、氨基酸與糖的交聯以及肽的降解反應[15]，這3個反應可能是一個動態平衡，隨著糖比例的不同，反應移動的方向不同。綜合分析各個指標，最終選取第5組作為美拉德反應的糖配比，即糖配比為0.4 g P+0.6 g M(葡萄糖0.4 g+木糖0.6 g)。

表2 糖配比設計方案與實驗結果

Table 2 Experimental design and results in the treatments with different ratios of sugar

組號反應后pHD420值D294值游離氨基酸含量/(mg·mL-1)15.960.0640.0802.0625.710.0620.1081.8335.230.1100.2212.2644.960.1370.3072.3054.520.2570.5622.8864.540.2230.5112.8874.150.3870.8062.57

2.2 美拉德反應條件優化

2.2.1 溫度對熱降解和美拉德反應規律的影響

取濃縮液10.0 mL，糖加量1.0 g(葡萄糖∶木糖=2∶3)于恒溫油浴鍋內反應1 h，對反應產物的pH、褐變程度、中間產物和游離氨基酸含量進行分析，結果見圖1。由圖1可知，美拉德反應組的溫度越高，反應產物pH越低，中間產物、褐變程度越高，說明溫度越高，美拉德反應進行得越完全；熱降解組因無美拉德反應進行，產物pH、中間產物、褐變程度變化不明顯；其中游離氨基酸的含量為1.58～9.82 mg·mL-1，表明鮑蒸煮液經熱降解可以釋放出游離氨基酸，由于熱降解組無美拉德反應進行，其游離氨基酸幾乎無消耗，所以熱降解組比美拉德反應組的游離氨基酸含量更高。但考慮到實際操作中，120，130 ℃反應較難控制，反應產物易出現焦糊味，所以選取110 ℃作為最佳反應溫度。

圖1 反應溫度對產物pH值、D420、D294和游離氨基酸含量的影響Fig.1 Effects of reaction temperature on pH value， D420， D294 and free amino acid content of the products

2.2.2 反應時間對熱降解和美拉德反應規律的影響

取濃縮液10.0 mL，糖加量1.0 g(葡萄糖∶木糖=2∶3)于110 ℃恒溫油浴鍋內反應，對反應產物的pH、褐變程度、中間產物和游離氨基酸含量進行分析，結果見圖2。由圖2可知，隨著反應時間的延長，美拉德反應組產物的pH呈明顯下降趨勢，褐變程度和中間產物含量呈現升高趨勢；熱降解組由于沒有發生美拉德反應，pH下降趨勢不明顯，褐變程度和中間產物含量基本不變；美拉德反應組和熱降解組的游離氨基酸含量隨著時間延長均呈現上升趨勢，說明持續的高溫促進了樣品中多肽類等水解成氨基酸，而美拉德反應組由于美拉德反應消耗部分游離氨基酸，所以其含量均低于熱降解組的游離氨基酸含量。雖然隨著時間的延長，產物中游離氨基酸含量增高，但是反應產物會有焦糊味，這是在制備調味品時不期望的，故選取最佳反應時間為90 min。

2.2.3 糖濃度對美拉德反應的影響

取濃縮液10 mL，糖添加量按照比例(葡萄糖∶木糖=2∶3)梯度添加0～0.1 g·mL-1，于110 ℃恒溫油浴鍋內反應90 min，結果如表3所示：隨著糖濃度的增加，pH持續下降，褐變程度、中間產物持續升高，游離氨基酸先上升后下降，說明開始時美拉德反應速率小于多肽、蛋白質類水解速率，隨后水解達到飽和，美拉德反應速率增大，產生更多風味物質，所以氨基酸含量又呈現下降趨勢。隨著糖濃度的增加，0～0.06 g·mL-1時，糖反應率呈升高趨勢，美拉德反應進程一直在增大；0.06～0.10 g·mL-1糖反應率呈下降趨勢，說明糖濃度高于0.06 g·mL-1時糖反應率開始下降，所以選取反應糖濃度為0.06 g·mL-1。

2.2.4 響應面優化試驗

響應面法克服了正交設計只能處理離散水平值，無法找出整個區域上因素的最佳組合和響應最優值的缺陷。響應面分析方法是研究幾種因素間交互作用的回歸分析方法。在單因素試驗的基礎上，以反應時間(A)、反應溫度(B)、糖濃度(C)為自變量，以D420值、D294值、游離氨基酸含量為響應值，通過三因素三水平的響應面分析方法，優化鮑蒸煮液美拉德反應的工藝條件，試驗設計方案及結果見表4。

將表4所得的試驗數據采用Design Expert8.0.6軟件進行分析，得到以反應產物的Y1(D420)為目標函數的二次回歸方程：

Y1=447.41902-7.85548A-2.33698B-40.40620C+0.037215AB+0.71855AC-6.87500×10-3BC+0.035439A2+1.55975×10-3B2+0.12598C2-1.64000×10-4A2B-3.26000×10-3A2C

由表4的試驗結果得到以反應產物的Y2

圖2 反應時間對產物pH值、D420、D294和游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effects of reaction time on pH value， D420， D294 and free amino acid content of the products

表3 糖濃度對美拉德反應的影響

Table 3 Effect of sugar concentrations on Maillard reaction

糖濃度/(g·mL-1)反應后pHD420值D294值游離氨基酸含量/(mg·mL-1)糖反應率/%06.930.0270.0402.1100.025.320.0610.1442.4291.00.045.010.0800.1792.5693.20.064.810.0880.2432.3495.30.084.670.1040.2532.1293.60.104.470.1310.3232.0391.0

表4 響應面設計方案與實驗結果

Table 4 Design and results of the response surface method

實驗號A反應溫度/℃B反應時間/minC糖濃度/%D420值D294值游離氨基酸含量/(mg·mL-1)11108050.2330.2971.6621109060.2080.2551.63310510060.1580.1751.93411010070.6310.7142.6651109060.2150.2601.65611510060.8010.8123.8971109060.2330.2921.6181159050.6150.7194.0991159070.6280.7313.45101059070.1170.1541.43111059050.1310.1591.92121109060.2070.2501.60131109060.2310.2861.69141058060.1180.1431.311511010050.6060.6912.60161158060.5340.5943.44171108070.5330.7033.28

表5D420顯著性檢驗

Table 5 Significance test for the established regression model forD420

項目平方和自由度均方F值P值顯著性模型0.85110.077341.59<0.0001**A-溫度0.5310.532327.70<0.0001**B-時間0.05510.055244.79<0.0001**C-糖濃度0.02610.026116.550.0001**AB0.01310.01356.860.0006**AC1.822×10-411.822×10-40.800.4109BC0.01910.01983.450.0003**A23.295×10-313.295×10-314.540.0125*B20.1010.010452.13<0.0001**C20.06710.067294.93<0.0001**A2B3.362×10-313.362×10-314.840.0120*A2C0.01310.01358.640.0006**殘差1.133×10-352.266×10-4失擬項5.120×10-415.120×10-43.300.1435

注：P值是方差齊次性檢驗的結果；**表示極顯著水平(P<0.01)；*表示顯著水平(0.01

(D294)為目標函數的二次回歸方程:

Y2=492.06005-8.68093A-2.20083B-52.24090C+0.035030AB+0.92925AC-9.57500×10-3BC+0.039308A2+1.61450×10-3B2+0.17120C2-1.55000×10-4A2B-4.2200×10-3A2C

由表4的數據得到以Y3(游離氨基酸含量)為目標函數的二次回歸方程：Y3=1501.4980-27.1011A+8.6599B-341.2190C-0.16585AB+6.17450AC-0.03900BC+0.12468A2+4.1700×10-3B2+0.49700C2+7.5000×10-4A2B-0.02810A2C

表6D294顯著性檢驗

Table 6 Significance test for the established regression model forD294

項目平方和自由度均方F值P值顯著性模型1.01110.092262.72<0.0001**A-溫度0.6210.621762.72<0.0001**B-時間0.04110.041116.810.0001**C-糖濃度0.04610.046131.06<0.0001**AB8.649×10-318.649×10-324.640.0042**AC7.225×10-517.225×10-50.210.6691BC0.03710.037104.460.0002**A23.800×10-613.800×10-60.0110.9212B20.1110.11312.63<0.0001**C20.1210.12351.53<0.0001**A2B3.003×10-313.003×10-38.550.0328*A2C0.02210.02263.410.0005**殘差1.755×10-353.511×10-4失擬項3.001×10-413.001×10-40.820.4151

著，二次項AB，AC對響應值的影響不顯著。

2.2.5 最優工藝條件的確定及結果驗證

通過數學模型優化美拉德反應工藝，得到最優工藝條件為反應溫度為115 ℃、反應時間84.14 min、糖濃度5.00%時，預測的響應值分別為：D420=0.558、D294=0.648、游離氨基酸含量3.860 mg·mL-1。考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：反應溫度為115 ℃、反應時間84 min、糖濃度5%，為了檢驗模型預測的準確性，采用響應面優化工藝條件進行驗證試驗，所測得的美拉德反應檢測指標為D420=0.552、D294=0.653、游離氨基酸含量3.930 mg·mL-1，實際實驗值與模型預測值基本一致，可見該模型能較好地預測美拉德反應。

表7 游離氨基酸顯著性檢驗

Table 7 Significance test for the established regression model for free amino acid content

項目平方和自由度均方F值P值顯著性模型14.13111.281008.51<0.0001**A-溫度8.5718.576726.69<0.0001**B-時間0.02610.02620.090.0065**C-糖濃度0.7110.71553.85<0.0001**AB7.225×10-317.225×10-35.670.0631AC5.628×10-315.628×10-34.420.0896BC0.6110.61477.55<0.0001**A21.4611.461148.51<0.0001**B20.7310.73574.70<0.0001**C21.0411.04816.36<0.0001**A2B0.07010.07055.190.0007**A2C0.9910.99774.74<0.0001**殘差6.370×10-351.274×10-3失擬項1.250×10-311.250×10-30.980.3790

3 結論

鮑蒸煮液中含有大量的氨基酸、小肽以及蛋白質，以其為反應基液，添加還原糖進行美拉德反應，可以產生較為理想的香味。反應溫度、反應時間和糖濃度對美拉德反應風味物質的產生有一定的影響。通過單因素試驗和響應面分析，確定了美拉德反應最佳工藝條件為：反應溫度為115 ℃、反應時間84 min、糖濃度5%。本文采用的響應面優化得到的最優工藝條件可靠，建立的數學模型能很好地分析各因素和美拉德反應各指標之間的關系，可真實地反映美拉德反應各指標變化的動態過程。然而，所獲得的香味物質易揮發，不易貯藏，如何長時間保持香氣，這將是今后研究的重點。

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(責任編輯 張 韻)

Optimization of Maillard reaction conditions of abalone cooking liquor

WU Jing-na1，2， LU Hai-xia1，2，JIN Yan-fen3，WEI Shao-hong1，2，LIU Zhi-Yu1，2，*

Abalone cooking liquor, Maillard reaction product with special flavor, was obtained through Maillard reaction. On the basis of single factor experiments， response surface method was used to optimize Maillard reaction process， and the mathematical model among temperature， time， sugar concentration and the degree of browning， intermediate， free amino acid content， was established. The technological conditions were optimized by the quadratic regression model， which were temperature 115 ℃， time 84 min， sugar concentration (glucose∶xylose=2∶3) 5%. In such conditions， the reaction liquid was red brown with strong toasty， and the indexes of Maillard reaction were measured asD420=0.552，D294=0.653， and free amino acid content was 3.93 mg·mL-1.

abalone cooking liquor; Maillard reaction; response surface method

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.26

2015-05-31

國家海洋公益性科研專項(201405016)；福建省科技重大專項(2014NZ0001-1)；廈門市海洋經濟發展專項 (14CZP041HJ15)； 福建省海洋高新產業發展專項

吳靖娜(1984—)，女，福建南安人，助理研究員，研究方向為水產品加工與綜合利用研究。E-mail: 31301863@qq.com

*通信作者，劉智禹，E-mail：13906008638@163.com

TS 254.9

A

1004-1524(2016)01-0157-08

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):157-164

吳靖娜，路海霞，靳艷芬，等. 鮑蒸煮液美拉德反應條件的優化[J].浙江農業學報，2016，28(1)：157-164.