微生物除草劑禾長蠕孢菌孢子助劑篩選

張建萍，段桂芳，楊 爽，周勇軍，陸永良，余柳青

(中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，浙江 杭州 310006)

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微生物除草劑禾長蠕孢菌孢子助劑篩選

張建萍，段桂芳，楊 爽，周勇軍，陸永良，余柳青

(中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，浙江 杭州 310006)

禾長蠕孢菌(Helminthosporiumgramineum)是一株雜草生防潛力菌，對稻田稗草有較強的致病作用，并對水稻等主要作物安全，其活性成分孢子有望開發成微生物除草劑產品。為此，文章以生物相容性、分散力和穩定性等評判指標開展了禾長蠕孢菌孢子助劑篩選研究。結果發現，SP-20為表面活性劑、大豆油為溶劑油、羧甲基纖維素鈉為穩定劑時，與孢子的生物相容性較好，對菌絲生長和孢子萌發都沒有顯著抑制作用。且添加SP-20后，孢子懸浮液I值為0.094，對孢子粉的分散性最佳。添加羧甲基纖維素鈉作為穩定劑時，擬合直線斜率最小，為0.232，因此穩定性最好。以上助劑篩選結果將為禾長蠕孢菌孢子制劑的開發及其應用奠定基礎。

生物防治；稗草；真菌；表面活性劑；穩定劑；溶劑油

我國農田目前主要依賴化學除草劑進行雜草防控，在帶來經濟效益的同時，由于長期大量使用單一品種化學農藥，已使生態平衡遭到嚴重破壞，還影響土壤中動物和微生物菌群的生長[1-3]。而微生物除草劑對生態系統相對安全，是一種比較好的補充和替代方式。

禾長蠕孢菌(Helminthosporiumgramineum)是從自然感病稗草上分離得到的雜草生防潛力菌，經研究發現，其對稗草、鴨舌草等稻田常見雜草有較強的致病性，并對水稻和環境安全，因而具有開發成優良微生物除草劑的潛力[4]。之前的主要利用方法是將有效成分真菌孢子直接釋放到田間，通過病原菌感染雜草發病而達到除草效果，因此對環境的依賴度很高，容易受到外界環境，包括高溫、紫外線、輻射等因子的影響而降低效率，甚至死亡[5-7]。

大部分化學除草劑都需要添加表面活性劑或其他助劑強化其田間應用效果和保存時間[8]。對微生物除草劑來說，添加助劑還能夠降低孢子對結露期的依賴而提高其除草活性[9-11]，有助于病原菌侵染葉片[12-14]。但是與化學農藥制劑單一成分相比，微生物孢子類型眾多，大小不一，且不溶于水，對助劑的相容性要求高。微生物孢子還會直接影響制劑的懸浮性、潤濕性和分散性等物理性能，因此微生物孢子制劑加工難度更大。除此之外，還要考慮外界環境因素，諸如陽光、溫度、濕度等，對微生物孢子活性的影響。因此，在篩選助劑時要考慮的因素很多，不僅包括與活體微生物的生物相容性、懸浮性、潤濕性和分散性等物理性能，還要考慮添加某些特殊的助劑，如紫外防護劑、增效劑、促萌發劑等[15-17]。

本研究主要完成了表面活性劑、溶劑油、穩定劑的篩選研究，探討了助劑對孢子活性的增效作用，為提高禾長蠕孢菌孢子的田間應用效果奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和種子

禾長蠕孢菌分離自自然感病稗草[4]，保藏于中國水稻研究所。稗草種子和水稻秀水-09種子，采集于中國水稻研究所試驗田，曬干后于-20 ℃冷凍保藏備用。

1.2 培養基

PDB培養基：去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蒸餾水。PDA培養基：PDB培養基添加1.7%瓊脂粉。

1.3 菌種活化

將4 ℃斜面保存的禾長蠕孢菌轉接到新鮮PDA培養基上，28 ℃黑暗培養7 d備用。

1.4 表面活性劑的篩選

1.4.1 不同表面活性劑對禾長蠕孢菌菌絲體生長及產孢量影響

分別配制含2%表面活性劑成分(蔗糖脂肪酸酯SE-11、脂肪醇聚氧乙烯醚MOA-7、烷基酚聚氧乙烯醚NP-9、烷基萘磺酸鹽Morwet EFW、羥基聚環氧乙烷嵌段共聚物Ethylan NS-500LQ、Silwet L-77、山梨醇酐單月桂酸酯SP-20)的PDA篩選培養基。將直徑5.5 mm活化禾長蠕孢菌菌塊接種于培養基中央，28 ℃黑暗培養7 d后采用交叉測量法測定菌落直徑，與不含表面活性劑成分的對照相比較，測定表面活性劑成分對真菌菌絲體生長的影響。繼續培養至11 d，用血球計數板測定孢子產量，以不含表面活性劑的PDA為對照，比較不同表面活性劑對菌株產孢量的影響。每個處理重復3次，每個試驗重復3次。

1.4.2 表面活性劑分散力的測定

將初篩獲得對菌株生長和產孢量無明顯抑制作用的3種表面活性劑，蔗糖脂肪酸酯SE-11、羥基聚環氧乙烷嵌段共聚物Ethylan NS-500LQ和山梨醇酐單月桂酸酯SP-20，分別配制成濃度為0.25%的溶液，稱0.006 g真菌孢子粉置于其中充分混勻，立刻在上、中、下3層中取樣，并于顯微鏡下計數孢子數量，測定表面活性劑的分散力。每個處理重復3次，每個試驗重復3次。表面活性劑的分散力優良與否以分散指數(I)為指標進行評價。當I<1時，孢子均勻分布；當I=1時，孢子隨機分布；當I>1時，孢子聚集分布。因此，當I<1時，I值越小，溶液的分散力越好。I值計算公式：

1.4.3 不同濃度SP-20對孢子萌發率的影響

分別稱取0.03 g孢子粉與山梨醇酐單月桂酸酯SP-20，在研缽中輕輕研磨混合均勻，加水配制成濃度分別為0.01%，0.025%，0.05%，0.10%，0.25%和0.50%的SP-20溶液，室溫保藏2周后，采用平板表面萌發法測定孢子萌發率。取1/3孢子粉混合物與10 mL無菌水混勻(孢子濃度約106mL-1)，取樣均勻涂布于PDA培養基上，4 h后取樣鏡檢計算孢子萌發率，以不添加SP-20的孢子萌發率為對照。每個處理設3次重復。

1.5 溶劑油的篩選

1.5.1 溶劑油對真菌菌絲體生長及產孢量的影響

分別配制含5%溶劑油[大豆油(福臨門一級大豆油，中糧東海糧油工業(張家港)有限公司)、菜籽油(金龍魚精煉一級菜籽油，上海嘉里食品工業有限公司)、玉米油(金龍魚植物甾醇玉米油，上海嘉里食品工業有限公司)、葵花籽油(魯花濃香葵花籽油，內蒙古魯花葵花籽油有限公司)]的PDA篩選培養基。以不含溶劑油的PDA培養基為空白對照。其余方法同表面活性劑測定1.4.1節。

1.5.2 溶劑油對孢子萌發率的影響

將0.03 g孢子粉分別與大豆油、玉米油、菜籽油和葵花籽油以2∶1(m/V)混勻，室溫保藏2周后測定孢子萌發率。以不添加溶劑油的孢子萌發率為對照。測定方法同表面活性劑1.4.3節。

1.6 穩定劑的篩選

1.6.1 不同穩定劑對真菌菌絲體生長及產孢量的影響

在PDA培養基中分別添加0.5%的穩定劑：羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、海藻酸鉀，充分混勻，配制成含有不同穩定劑的篩選培養基。以不含穩定劑的PDA培養基為空白對照。其余方法同表面活性劑測定1.4.1節。

1.6.2 不同穩定劑的穩定性測定

將3種穩定劑羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉和海藻酸鉀配制成濃度為0.2%的溶液，分別與0.03 g孢子粉混勻，放置0，1，5，15，30，45，60 min后，置于分光光度計中，在370 nm波長下，測定其透光度。分別以測定的透光度值擬合出一條直線，比較各穩定劑直線的斜率，篩選出穩定性最佳的穩定劑。

進而測定不同濃度下最佳穩定劑羧甲基纖維素鈉對孢子懸浮率的影響。分別配制0.005%，0.01%，0.025%，0.05%，0.1%，0.25%的羧甲基纖維素鈉溶液，參照《中華人民共和國國家標準——農藥可濕性粉劑懸浮率測定方法》測定其孢子懸浮率。試驗重復3次，每個處理重復3次。

1.6.3 不同濃度的羧甲基纖維素鈉對孢子萌發率的影響

根據穩定劑的穩定性能，測試不同添加比率羧甲基纖維素鈉對孢子萌發率的影響。分別稱取0.03 g孢子粉與羧甲基纖維素鈉混勻，配制成羧甲基纖維素鈉濃度為0.005%，0.01%，0.025%，0.05%，0.10%，0.25%和0.50%的溶液，室溫保藏2周，以不添加羧甲基纖維素鈉處理作為對照，檢測不同濃度穩定劑對孢子萌發率的影響，試驗方法同1.4.3節。

1.7 數據統計

采用DPS數據處理系統進行統計分析[18]。

2 結果與分析

2.1 表面活性劑對菌絲體生長及孢子產量、分散力和萌發率的影響

真菌孢子大多數具有疏水特性，不易在水中潤濕而漂浮于水面形成一層薄膜。因此，需要篩選分散性好且對孢子活性無抑制作用的表面活性劑，促進其在水溶液中的分散。在篩選的7種潤濕性、分散性、乳化性均較好的非離子表面活性劑中，禾長蠕孢菌菌絲生長速率和產孢變化如圖1所示。在SE-11和Ethylan NS-500LQ中，菌絲體生長速率與未處理對照無顯著差異，而在Ethylan NS-500LQ和SP-20中孢子產量與未處理對照無差異，表明添加這些表面活性劑不會顯著影響菌絲體的生長和產孢量。以此為依據，做了SE-11，Ethylan NS-500LQ和SP-20對孢子分散力的試驗，結果表明：在0.25% Ethylan NS-500LQ溶液中孢子分散力(I值)大于1，達到3.94，孢子容易聚集成團分布，分散力較差。而在相同濃度的SP-20和SE-11溶液中，I值均小于1，且添加SP-20的I值為0.094，遠小于添加SE-11的I值0.76，證明添加SP-20孢子粉的分散性最佳。不同濃度SP-20對孢子萌發率的影響實驗發現，與不添加SP-20孢子萌發率33%相比，0.01%～0.50% SP-20添加量孢子萌發率在25%～36%之間，沒有顯著差異，表明添加0.01%～0.50% SP-20對孢子萌發沒有顯著影響。因此SP-20是較為理想的對孢子活性無顯著負面影響的分散性能良好的表面活性劑。

MEFW，ENS-500LQ和SL-77分別是MorwetEFW，EthylanNS-500LQ和SilwetL-77的縮寫。圖1 不同表面活性劑對禾長蠕孢菌菌絲生長及產孢的影響Fig.1 Effect of surfactant on mycelial growth and conidia production of Helminthosporium gramineum

2.2 溶劑油對禾長蠕孢菌菌絲生長、孢子產量和萌發率的影響

添加5%大豆油、菜籽油、玉米油和葵花籽油均對菌絲生長和產孢有顯著促進作用(圖2)。其中，添加大豆油處理菌絲生長和產孢量數值最高。室溫條件下溶劑油對孢子萌發的影響研究發現：添加大豆油和菜籽油處理，孢子萌發率顯著高于未處理對照CK(圖3)，表明大豆油和玉米油對孢子萌發有促進作用。而添加葵花籽油孢子幾乎不萌發，表明葵花籽油會抑制孢子萌發。

SO，RO，CO和SSO分別是大豆油、菜籽油、玉米油和葵花籽油的縮寫。圖3同。圖2 不同溶劑油對禾長蠕孢菌菌絲生長及產孢的影響Fig.2 Effect of vegetable oil adjuvants on mycelial growth and conidia production of Helminthosporium gramineum

圖3 不同溶劑油對孢子萌發率的影響Fig.3 Effects of vegetable oil adjuvant on germination rate of conidia

2.3 穩定劑對禾長蠕孢菌菌絲生長及孢子產量、懸浮率和萌發率的影響

由圖4可見，3種穩定劑對菌絲生長影響均較小，但對產孢量影響有較大的波動。海藻酸鈉能顯著促進產孢，而海藻酸鉀則對產孢有明顯抑制作用，羧甲基纖維素鈉與對照相比產孢量沒有顯著差異。對CK和3種穩定劑穩定性測試研究，擬合出4條直線：yCK=0.75x+33.41(R2=0.906)，y海藻酸鉀=0.499x+16.41(R2=0.974)，y海藻酸鈉=0.322x+7.149(R2=0.950)，yCMC=0.232x+14.44(R2=0.976)，其R值均大于0.9，表明擬合度均較好。其中，當羧甲基纖維素鈉作為穩定劑時，直線斜率值最小，穩定性最好，其次為海藻酸鈉和海藻酸鉀。綜合考慮對菌絲生長和產孢量的影響，選擇羧甲基纖維素鈉作為待試穩定劑。不同濃度羧甲基纖維素鈉處理孢子后，懸浮率測定結果表明，隨羧甲基纖維素鈉濃度增加，孢子懸浮率逐漸升高。當羧甲基纖維素鈉濃度大于0.05%時，孢子溶液的懸浮率均在60%以上(圖5)。而不同濃度的羧甲基纖維素鈉對孢子萌發率的影響研究發現，與不添加羧甲基纖維素鈉處理孢子萌發率36%相比，添加0.005%～0.50%的羧甲基纖維素鈉處理后對孢子萌發率在31%～49%之間，沒有顯著差異，表明添加羧甲基纖維素鈉對孢子萌發率沒有顯著影響，其中0.05%羧甲基纖維素鈉與孢子均勻混合2周后，孢子萌發率最高，達到49%。

CMC，SA和PA分別是羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉和海藻酸鉀的縮寫。圖4 不同穩定劑對禾長蠕孢菌菌絲生長及產孢的影響Fig.4 Effect of stabilizer on mycelial growth and conidia production of Helminthosporium gramineum

圖5 不同濃度羧甲基纖維素鈉(CMC)對孢子懸浮率的影響Fig.5 Effect of different concentrations of sodium salt of caboxy methyl cellulose (CMC) on suspension percentage rate of conidia

3 討論

生物農藥制劑化后可以降低活性成分對環境的依賴和使用劑量[19]。生物農藥制劑通常由活性成分、惰性載體材料和助劑3部分組成[20]。而真菌作為生物除草劑時大多數是利用其孢子作為活性成分發揮效用[21-22]。禾長蠕孢菌孢子具有高除草活性[4]，但是其孢子的大小為(15～17) μm×(11～23) μm，是一類體積較大的真菌孢子，因此在水中不易懸浮，且孢子具有強疏水性，不易在水中分散潤濕，因此在田間應用時需要添加表面活性劑、穩定劑和一些惰性材料才能發揮高除草效率。與化學除草劑助劑不同，真菌孢子助劑篩選首要是看其是否能與活性成分有良好的生物相容性。因此，篩選過程中都測定了表面活性劑、溶劑油以及穩定劑對菌絲生長、產孢以及孢子萌發的影響。另外，考慮孢子在制劑中的分散性和穩定性以及田間噴施的效果，還評價了孢子在助劑中的分散性和穩定性。

由于大多數真菌孢子都具有疏水特性，因此表面活性劑是真菌孢子殺蟲劑、殺菌劑以及除草劑的必選助劑[23]。有些表面活性劑能夠顯著促進孢子萌發和菌絲生長，但是有些會抑制孢子萌發。通常非離子表面活性劑與生物農藥有效成分生物相容性更好。報道表明，添加Silwet L-77或 Silwet 408有效提高了丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)經由氣孔或傷口感染靶標雜草的效率[24]。含有0.2% SilwetL-77的疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)菌絲體制劑對外來入侵雜草野葛也有高除草效率[22]。本研究發現，Silwet L-77與禾長蠕孢菌生物相容性較差(圖1)，但是綜合評價生物相容性試驗和分散力數據，發現非離子型表面活性劑SP-20添加后不僅有利于孢子均勻分散于水中，而且對孢子生長和萌發都沒有抑制作用，更適合用作禾長蠕孢菌的助劑。

溶劑油也常添加在農藥中，以提高農藥效率。綜合考慮到安全性和除草效率，植物油或甲酯化植物油已成為重要的生物農藥助劑。研究表明，添加植物油比礦物油更有利于提高煙嘧磺隆控草活性[25]。通常添加的植物油有未精煉玉米油、大豆油、菜籽油等。不同種類植物油與不同真菌孢子的生物相容性不同。Sandrin等[26]報道添加大豆油和玉米籽油能增加膠孢炭疽菌菟絲子專化型(C.gloeosporioidesf. sp.aeschynomene)對皂角(Aeschynomenevirginica)的防效。本研究發現，添加大豆油和玉米油都能促進孢子萌發，而添加葵花籽油則抑制孢子萌發，添加大豆油還能顯著促進菌絲生長速度，因此選擇大豆油作為禾長蠕孢菌的助劑。

穩定劑有助于孢子均一噴施至雜草葉片上。常用的生物農藥穩定劑有海藻酸鈉、黃原膠等[19]。本研究表明，海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉與禾長蠕孢菌孢子的生物相容性都較好，但通過穩定性測定發現，羧甲基纖維素鈉的穩定性要優于海藻酸鈉。

本文初步篩選出了幾種助劑，并研究了其在短時間內與孢子的生物相容性，結果表明，SP-20、大豆油和羧甲基纖維素鈉對孢子活性無顯著負面影響。接下來還需對延長保存時間后孢子活性進行研究，以及試制出制劑配方和評價其除草效率等，如有必要，還可擴大助劑的篩選范圍，為禾長蠕孢菌孢子制劑配方和田間防效試驗提供參考。

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(責任編輯 張 韻)

Screening of adjuvants for bioherbicidal fungus Helminthosporium gramineum

ZHANG Jian-ping，DUAN Gui-fang， YANG Shuang， ZHOU Yong-jun， LU Yong-liang*， YU Liu-qing

(StateKeyLaboratoryofRiceBiology，ChinaNationalRiceResearchInstitute，Hangzhou310006，China)

Helminthosporiumgramineumwas isolated from infected barnyard grass and considered as a potential biocontrol candidate based on its epidemiological traits and crop safety. Its conidia showed great promise as a bioherbicidal agent for control of barnyard grass in rice fields. Thus， this study was conducted to screen conidia adjuvants for bioherbicidal fungusH.gramineumbased on the biological compatibility， dispersion force， stability and other evaluation indictors. The results showed that there was better biological compatibility when SP-20， soybean oil and CMC were considered as surfactants， vegetable oil adjuvant and stabilizer, respectively. They did not significantly inhibit the mycelia growth and conidia germination. The dispersion index (I) of conidia suspensions was 0.094 after addition of SP-20 as surfactants， which indicated higher dispersion force. The slope of linear fitting was minimal as 0.232 when CMC was used as stabilizer， which showed better stability. These results of adjuvants would be helpful for developingH.gramineumformulations.

biological control; barnyard grass; fungi; surfactant; stabilizer; vegetable oil adjuvant

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.16

2015-05-20

863計劃子課題(2011AA10A206)；國家科技支撐計劃課題(2012BAD19B02)；國家自然科學基金青年科學基金(31101454)；國家水稻產業技術體系項目“雜草防控”(CARS-01)；中國農科院創新工程團隊項目

張建萍(1973—)，女，山西原平人，博士，副研究員，主要從事雜草生物防治研究。E-mail: nkzhang_jp@163.com

*通信作者，陸永良，E-mail: luyongliang@caas.cn

S451.1

A

1004-1524(2016)01-0090-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):90-95

張建萍，段桂芳，楊爽，等. 微生物除草劑禾長蠕孢菌孢子助劑篩選[J].浙江農業學報，2016，28(1)：90-95.