白菜谷胱甘肽過氧化物酶基因GPX的鑒定與分析

齊增園，陶 鵬，李必元，王五宏，岳智臣，雷娟利，鐘新民

(1. 浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021; 2. 南京農業大學 園藝學院，江蘇 南京 210095)

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白菜谷胱甘肽過氧化物酶基因GPX的鑒定與分析

齊增園，陶 鵬，李必元，王五宏，岳智臣，雷娟利，鐘新民

(1. 浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021; 2. 南京農業大學 園藝學院，江蘇 南京 210095)

為研究白菜谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)基因的生物學特征，從白菜全基因組數據庫中篩選了10個GPX基因。基于公開的白菜轉錄組測序數據，分析了GPX基因在胚胎發育和器官中的表達情況，并且通過生物信息學手段對這10個GPX基因進行基因定位、啟動子分析、基因結構、系統樹構建和基因表達等研究。結果表明，BrGPX5基因的編碼區中有6個內含子，其余基因均只有5個內含子，說明BrGPX5基因在進化過程中獲得了一個內含子，導致氨基酸分子量增加；另外，每個GPX基因的啟動子區都有2個及以上的E-box元件。

白菜；GPX基因；啟動子；基因表達

谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX)是抗氧化酶系的重要成員[1]。在長期進化過程中，植物形成了一套酶促和非酶促的活性氧基團(reactive oxygen species，ROS)清除機制來阻止膜脂過氧化，避免受到傷害[2]。谷胱甘肽過氧化物酶是酶促清除機制中的關鍵酶類之一，能催化谷胱甘肽(GSH)轉化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害[3]。這種催化反應研究最早發現于動物，隨后研究人員相繼從柑橘(Citrussinensis)[4]、番茄(Lycopersiconesculentum)[5]、向日葵(Helianthusannuus)[6]和水稻(Oryzasativa)[7-8]等植物中陸續分離到此類基因。研究表明，植物GPX的氨基酸序列攜帶一個半胱氨酸殘基，替代了動物基因組GPX核苷酸UGA終止密碼子處插入的硒代半胱氨酸[9]。番茄LePHGPX基因的過量表達能顯著提高轉基因植株對鹽、高溫等非生物脅迫的耐受性[10]。近年來，對模式植物擬南芥GPX基因(AtGPX)的功能研究取得了重要進展。Milla等[11]通過分析擬南芥基因組序列和表達序列標簽(expressed sequenced tags，ESTs)序列，推測擬南芥基因組中存在7個GPX基因，對不同的非生物脅迫均有應答反應。

白菜為十字花科蕓薹屬(Brassica)植物，其柔嫩的葉球、蓮座葉或花莖可供食用，栽培面積和消費量在中國居各類蔬菜之首。白菜是研究植物多倍化的模式材料之一，多倍化的白菜家族基因成員的擴大和丟失是近年來研究的熱點。十字花科中，擬南芥和白菜的親緣關系較近，并且兩者有大量的共線性基因。目前，白菜全基因組測序已完成[12]，這為白菜的基因組研究提供了便利條件。雖然擬南芥GPX基因的研究已經有較多報道，但白菜GPX基因的功能還未見報道。因此，本研究從白菜全基因組中篩選了10個GPX基因，對其進行了基因定位，分析了啟動子區的調控元件；并與擬南芥GPX基因進行序列比對分析，構建了系統樹并分析了白菜GPX基因的表達模式。

1 材料與方法

1.1 GPX基因序列的獲得

首先從NCBI數據庫獲得擬南芥的GPX基因序列，然后利用擬南芥的GPX基因序列在公共數據庫Brassica Database(http://brassicadb.orgbradindex.php)中進行檢索，獲得了10個白菜GPX基因序列。使用Syntenic Genes軟件分析這些白菜GPX基因的共線性關系，記錄白菜每個GPX亞基因組(LF，MF1和MF2)的分布。

1.2 白菜GPX基因結構

首先從數據庫中獲得GPX基因序列，然后使用ClustalX進行比對，找出內含子的插入點，進行制圖并分析氨基酸序列間的關系。

1.3 序列比對和系統樹分析

使用ClustalX[13]比對分析白菜和擬南芥GPX蛋白的氨基酸序列。然后使用MEGA 5.2[13]，基于Jones-Taylor-Thornton substitution matrix算法，采用鄰接法構建系統發育進化樹，運行重復次數為1 000。

1.4 白菜GPX基因啟動子分析

從數據庫下載每個GPX基因起始密碼子上游2 000 bp的核苷酸序列，使用Softberry軟件(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)預測轉錄起始位點，用序列作為標準，找出E-box，ABRE，CBF和2SSEEDPROTBANAPA基序，然后記錄每個GPX基因中E-box，ABRE，CBF和2SSEEDPROTBANAPA的定位信息，使用Excel進行作圖。

1.5 白菜GPX基因表達水平的數據來源

蕓薹屬全基因組測序、蕓薹屬器官表達和胚胎發育的轉錄組測序工作已完成。白菜器官表達的RNA序列已公布[14]，從NCBI網站獲得了白菜器官的轉錄組測序的原始數據(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)(收錄號：GSE43245)，從中獲得10個白菜GPX基因在不同器官中的表達數據。白菜在胚胎發育階段RNA序列數據也已公布[15]，從中獲得了白菜GPX基因在胚胎發育階段的表達數據。然后使用Excel作圖分析白菜GPX基因在不同時期的表達量。

2 結果與分析

2.1 白菜GPX基因的識別及定位

利用擬南芥的GPX基因序列，在公共數據庫Brassica Database進行檢索，結合共線性基因分析，找到了10個白菜GPX基因?；跀M南芥的GPX基因，對10個白菜GPX基因進行命名，名稱以及基因編碼等信息見表1。同時也分析了這些GPX蛋白的等電點和分子量。結果顯示，大多數GPX蛋白的等電點在8.3～9.9之間，為堿性蛋白，分子量在18～27 ku之間；而AtGPX2，BrGPX2a和BrGPX2b是分子量相對較小的酸性蛋白。BrGPX4b和BrGPX6a的等電點和分子量與AtGPX4和AtGPX6存在差異，BrGPX5與AtGPX5在分子量上差異較明顯。

2.2 白菜GPX基因的結構

表1 擬南芥和白菜的GPX基因詳細信息

Fig.1 Detailed information ofGPXgenes in Chinese cabbage andArabidopsisthaliana

基因名稱物種基因編號基因定位等電點分子量/uAtGPX1ArabidopsisthalianaAT1G25080Chr2(-):10670467..106726539.4226015.7BrGPX1BrassicarapaBra007819A09(-):32571059..325723519.2925775.4AtGPX2ArabidopsisthalianaAT2G31570Chr2(-):13437974..134398815.6018944.5BrGPX2aBrassicarapaBra018232A05(+):6855186..68565696.3418930.5BrGPX2bBrassicarapaBra022853A03(-):7414014..74156625.6018974.6AtGPX3ArabidopsisthalianaAT2G43350Chr2(-):18010751..180132389.2423257.9BrGPX3BrassicarapaBra000302A03(-):10450132..104515198.5521966.4AtGPX4ArabidopsisthalianaAT2G48150Chr2(-):19687962..196891738.8713900.1BrGPX4aBrassicarapaBra004409A05(-):3861..49339.0519212.0BrGPX4bBrassicarapaBra021456A04(-):19260148..192620269.5923369.1AtGPX5ArabidopsisthalianaAT3G63080Chr3(+):23309737..233113869.2819327.0BrGPX5BrassicarapaBra003522A07(+):16885041..168896959.8226758.8AtGPX6ArabidopsisthalianaAT4G11600Chr4(-):7009769..70113759.3825584.2BrGPX6aBrassicarapaBra035211A09(+):17014703..170159008.3218788.3BrGPX6bBrassicarapaBra033140A02(-):16553322..165545509.2125261.8AtGPX7ArabidopsisthalianaAT4G31870Chr4(+):15410205..154116179.5325774.3BrGPX7BrassicarapaBra023978A03(+):28513404..285147759.6025941.6

通過對GPX基因的各個成員進行比對，發現多個保守程度較高的特征結構，且序列差異一般都在起始端和末尾端出現，從第1個內含子到第5個內含子的插入位置高度保守。一般GPX基因都含有5個內含子，而且位點相似或相同，但BrGPX5基因有6個內含子，比其他基因多出1個內含子(圖1)。

2.3 白菜GPX蛋白的進化分析

為了研究這些GPX蛋白的進化關系，運用MEGA 5.2[16]軟件，采用鄰接法構建了GPX蛋白的系統發育進化樹。由于擬南芥和白菜是共線性關系，所以擬南芥與它共線性的白菜直系同源基因聚在一起。AtGPX2，BrGPX2a，BrGPX2b和AtGPX3，BrGPX3蛋白的親緣關系較近，而AtGPX7，BrtGPX7和AtGPX1，BrGPX1蛋白的關系較近，AtGPX5，BrGPX5和AtGPX4，BrGPX4a，BrGPX4b蛋白的親緣關系也較近(圖2)。

2.4 白菜GPX基因結構啟動子分析

從公共數據庫中下載了白菜10個GPX基因起始密碼子上游2 000 bp的DNA序列，分析了這些序列中E-box，ABRE，CBF和2SSEEDPROT-BANAPA的數量和分布。結果顯示，所有GPX基因的起始密碼子上游2 000 bp的啟動子區域都存在E-box元件，而ABRE，CBF和2SSEEDPROT-BANAPA只部分存在于啟動子區域，其中ABRE元件存在于BrGPX7，BrGPX6b，BrGPX6a，BrGPX5，BrGPX4b，BrGPX4a中，在1 700～1 900 bp區域相對集中，BrGPX6b基因上有位置很近、幾乎重疊的2個ABRE元件；CBF元件存在于BrGPX7，BrGPX6b，BrGPX6a，BrGPX4b，BrGPX4a，BrGPX3，BrGPX2b，在BrGPX3基因上存在位置較近的CBF元件。只有BrGPX6b，BrGPX5，BrGPX3的2 000 bp啟動子區域里存在2SSEEDPROTBA-NAPA元件，BrGPX6b啟動子區有2個2SSEEDP-ROTBANAPA元件(圖3)。

2.5 白菜GPX基因的表達模式

從NCBI數據庫和已發表文獻中獲得白菜GPX基因的轉錄組測序數據，分析白菜GPX基因在不同組織器官的表達情況。如圖4所示，在胚胎發育過程中，BrGPX1，BrGPX2a，BrGPX2b和BrGPX6a在早期子葉胚中的表達量較高，在成熟胚中表達較低；在子葉期，BrGPX1基因的表達量顯著高于其他基因。BrGPX4a和BrGPX4b在胚胎發育過程中幾乎不表達或表達量極少。2個旁系同源基因BrGPX2a和BrGPX2b的表達譜類似。與BrGPX6a相比，BrGPX6b基因在整個白菜胚胎發育過程中表達量明顯上升，且表達量是BrGPX6a的3倍以上。BrGPX7基因在胚胎發育時期表達量較低，在子葉期相對較高。

黑色三角所示為BrGPX5的第6個內含子插入位點。圖1 擬南芥和白菜GPX基因的結構Fig.1 Structure of GPX genes in Chinese cabbage and Arabidopsis thaliana

圖2 擬南芥和白菜GPX蛋白的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of GPX proteins in Chinese cabbage and Arabidopsis thaliana

圖3 白菜GPX基因啟動子序列分析Fig.3 Promoter sequence analysis of GPX genes in Chinese cabbage

如圖5所示，與其他器官中的表達水平相比，BrGPX1在愈傷組織中的表達量較高。2個旁系同源基因BrGPX2a和BrGPX2b表達差異明顯。BrGPX2b在花和長角果中表達量較高，BrGPX2a在所有器官中均有表達，且器官之間的表達量差異不顯著。BrGPX3和BrGPX5分別在角果和葉片表達量較高。而BrGPX6a和BrGPX6b在所有器官中表達量均較高，BrGPX6a在葉子和花中表達量較高，在愈傷組織的表達量也較高，而BrGPX6b在葉子、花和長角果中的表達量較高，BrGPX7在花器官中表達量較高。

圖4 白菜GPX基因在胚胎發育不同時期的表達Fig.4 Expression levels of GPX genes in Chinese cabbage at different stages of embryonic development

圖5 白菜GPX基因在各個器官中的表達Fig.5 Expression levels of GPX genes in Chinese cabbage in different organs

3 討論

擬南芥含有7個GPX基因，白菜在進化過程中發生了3倍化，因此白菜存在3個亞基因組(LF，MF1和MF2)，但鑒定結果中只有10個GPX基因，說明白菜在進化過程中GPX基因存在丟失現象。在分析白菜GPX蛋白的等電點時，發現大部分GPX蛋白是堿性蛋白，而BrGPX6a的等電點和分子量相較于AtGPX6和BrGPX6b有所偏低，BrGPX4a的等電點和分子量相較于AtGPX4和BrGPX6b也有所偏低，說明在進化過程中很有可能發生了基因片段的丟失。在分析BrGPX5基因的內含子時，發現BrGPX5基因比其他GPX基因多了一個內含子，表明BrGPX5基因在進化過程中獲得了新的內含子，導致一段新的序列插入到編碼區中，從而使BrGPX5蛋白分子量大于AtGPX5。

目前，白菜基因組和轉錄組測序數據越來越多，能夠從NCBI數據庫和已發表的文獻中下載獲得轉錄組測序的原始數據，從而分析白菜GPX基因在轉錄水平的表達。旁系同源基因BrGPX6a和BrGPX6b在胚胎發育過程中的表達量上相差3倍以上，這可能與BrGPX6a和BrGPX6b啟動子區的調控元件有關。BrGPX6b起始密碼子上游1 500～2 000 bp存在2個2SSEEDPROTBA-NAPA元件，而BrGPX6a中不存在這種元件。2SSEEDPROTBANAPA元件(核心序列5’-CAAACAC-3’)大量存在于甘藍型油菜種子儲藏蛋白的啟動子區，參與調控儲藏蛋白在胚胎發育階段的表達[17]。BrGPX6b基因在胚胎發育過程中轉錄表達明顯上調，表明其表達與2SSEEDPROTB-ANAPA元件密切相關。Milla等[11]采用RT-PCR的方法對擬南芥GPX基因表達進行了分析，結果表明，AtGPX1基因編碼一個葉綠體蛋白，在葉、莖和花中表達比較強，在根中幾乎檢測不到，這說明該蛋白的功能可能是抵御由光氧化脅迫造成的損傷[1]。擬南芥AtGPX1和AtGPX7表達量的下降，會降低擬南芥抵御光氧化脅迫的能力[18]。將擬南芥AtGPX3基因敲除后，擬南芥對干旱和氧化脅迫的抵抗能力都顯著下降[19]。Gapinska等[20]的研究表明，番茄根部在受到150 mmol·L-1的NaCl處理時，GPX活性顯著增強。GPX參與植物的抗氧化脅迫，在轉基因植物中過量表達GPX基因可以提高植物對非生物脅迫的耐受力[21-22]。

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(責任編輯 侯春曉)

Identification and analysis of GPX genes in Chinese cabbage

QI Zeng-yuan1，2， TAO Peng1， LI Bi-yuan1， WANG Wu-hong1， YUE Zhi-chen1， LEI Juan-li1， ZHONG Xin-min1，*

(1.InstituteofVegetables，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 2.CollegeofHorticulture，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

To study the biological characteristics of glutathione peroxidase (GPX) genes in cabbage， 10GPXgenes were screened from the whole genome database of cabbage. Then expression levels of theseGPXgenes were analyzed based on cabbage transcriptome RNA-Seq data at embryonic development and in different organs. Meantime， gene mapping， promoter， gene structure， phylogenetic tree and expression level of these 10GPXgenes were studied using bioinformatics tools. The results showed that there were six introns in the coding region ofBrGPX5， while other genes only had five introns， which indicated thatBrGPX5 gene obtained an intron during evolution， resulting in increased molecular weight of the amino acid. In addition， there were two and above E-box elements in the promoter region of eachGPXgene in Chinese cabbage.

Chinese cabbage;GPXgenes; promoter; gene expression

http://www.zjnyxb.cn齊增園， 陶鵬， 李必元， 等. 白菜谷胱甘肽過氧化物酶基因GPX的鑒定與分析[J]. 浙江農業學報， 2016， 28(1): 64-69.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.11

2015-05-27

國家自然科學基金(31372058，31301788)；浙江省重大科技專項(2012C12903-6-2，2012C12903-3-7)

齊增園(1990—)，女，山東萊蕪人，碩士，研究方向為大白菜甘藍分子遺傳育種。E-mail: qizengyuan1409@126.com

*通信作者，鐘新民，E-mail: zhongxm@mail.zaas.ac.cn

S634

A

1004-1524(2016)01-0064-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):64-69