丙肝感染宿主親嗜性基因OCLN和CD81在獼猴川西亞種組織中的分布

何 柳，陳正禮，羅啟慧，鄧 娟，夏 玉，史良琴，程安春

(1. 四川農業大學 動物醫學院 實驗動物疾病模型研究室，四川 溫江 611130； 2. 四川農業大學 動物醫學院/動物疾病與人類健康中心四川省重點實驗室， 四川 雅安 625014)

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丙肝感染宿主親嗜性基因OCLN和CD81在獼猴川西亞種組織中的分布

何 柳，陳正禮，羅啟慧，鄧 娟，夏 玉，史良琴，程安春

(1. 四川農業大學 動物醫學院 實驗動物疾病模型研究室，四川 溫江 611130； 2. 四川農業大學 動物醫學院/動物疾病與人類健康中心四川省重點實驗室， 四川 雅安 625014)

丙型肝炎動物模型缺乏限制了丙型肝炎的研究，如果與人類基因背景相似的獼猴能作為丙型肝炎動物模型將有重大意義。文章擬通過檢測決定HCV感染物種特異性的關鍵基因OCLN與CD81在獼猴不同組織的表達量，并以HCV易感的人肝癌細胞系Huh 7.5.1為對照，來探究獼猴作為丙型肝炎動物模型的可能性。結果表明，OCLN與CD81在獼猴川西亞種的肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結和脊髓中均有表達，但表達量均極顯著低于在Huh 7.5.1細胞系中的表達量(P<0.01)。肝臟中的OCLN表達量略低于肺臟中的表達量，而肝臟CD81的表達量均高于其他組織。并且，OCLN在不同組織中的表達水平與人體OCLN表達規律相符合(脾<肝<肺)。該結果提示HCV感染的宿主親嗜性基因OCLN與CD81在獼猴中的低表達量可能導致HCV不能有效地結合組織靶細胞，因此推測，獼猴不能直接用于丙型肝炎動物造模可能與此有關。今后可通過轉基因等技術增強OCLN與CD81基因的表達，從而使獼猴獲得直接感染HCV的能力。

HCV；OCLN；CD81；獼猴川西亞種；動物模型

咬合蛋白Occludin(OCLN)是構成緊密連接(tight junctions，TJ)的組成成分之一，其進化保守，小鼠、人類和犬的OCLN基因有90%的同源性[1]。在正常發育的肺、肝等組織中OCLN具有高表達水平[2]。研究表明，緊密連接蛋白OCLN是HCV進入細胞的關鍵因素之一[3]。Cluster designation 81(CD81)是4次跨膜蛋白超家族成員之一，與細胞的吸附、激活、增殖與分化等有關[4]。研究發現，CD81是HCV入胞的受體，其通過與HCV E2結合，使HCV吸附于細胞表面。Ploss等[5]將人CD81和OCLN以及鼠的CLDN1和SR-BI轉染到非肝來源的細胞中，發現這些原本無法被HCV感染的細胞獲得了HCV易感性，進而將可以感染HCV的Huh 7.5與HepB細胞中的OCLN，CD81分子表達沉默，發現兩種細胞感染HCVpp和HCVcc的能力均有下降。該結論證明，OCLN與CD81是介導HCV感染細胞的關鍵因素之一，并且可能與HCV感染的物種特異性有關[6-7]。

現有研究發現，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)只能感染人類與黑猩猩，丙型肝炎動物模型的缺乏限制了丙型肝炎的研究。獼猴川西亞種作為中國特有的物種，分布廣泛，其親緣關系與人類非常相近，是良好的人類疾病模型動物。然而Bukh[8]研究發現，獼猴不能感染丙型肝炎。由于病毒特異性受體的表達和分布是影響HCV感染的宿主親嗜性的重要限制因素，并且其表達量低會限制HCV的感染，因此研究獼猴不同組織的OCLN與CD81表達量對分析獼猴作為丙型肝炎模型的潛力有重大意義。本試驗通過對獼猴川西亞種的不同組織中OCLN與CD81的表達量進行檢測，并將其與人類肝癌細胞系Huh 7.5.1的OCLN與CD81的表達量相比較，探究獼猴川西亞種作為丙型肝炎動物模型的可能性。丁紅方等[9]發現，丙肝患者除了在肝臟組織中檢測到HCV陽性以外，在肺，脾，淋巴結等肝外組織中均可以檢測到HCV抗原陽性。因此，我們選取了獼猴的肝、脾、肺、淋巴結和脊髓作為材料，通過熒光定量PCR檢測OCLN和CD81在這些潛在HCV易感組織中的表達量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物本試驗所用5只健康雄性成年獼猴川西亞種均由四川農業大學實驗動物工程技術中心/國家實驗用獼猴種源基地(四川雅安)提供[SCXK(川)：2013-105]。所有實驗動物均由四川省雅安市雅安普萊美生物科技有限公司倫理委員會審查批準使用。實驗操作于四川農業大學實驗動物工程技術中心[SYXK(川)2014-187]進行。Huh 7.5.1細胞系由武漢病毒研究所提供。

1.1.2 主要試劑TaKaRa RNAiso Plus、反轉錄試劑盒TaKaRa PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、ExTaq酶、dNTPs與SYBRⅡ均購自寶生物工程(大連)有限公司；DEPC、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇為國產分析純試劑。實時熒光定量PCR儀為Bio-Rad CFX96TM。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR引物設計參照GenBank中注冊的獼猴OCLN，CD81及內參β-actin基因序列(序列號分別為XM_002804403.1，NM_001266249.1與NM_001033084.1)，分別選取種屬間保守序列，參考PCR引物設計原則，借助計算機軟件Primer 6設計擴增引物。OCLN上游引物：5′-ATGACCCGCAGACCACCAA-3′，下游引物：5′-CCAGGAAGCCGACGAACATC-3′；CD81上游引物：5′-ATGACCCGCAGACCACCAA-3′，下游引物：5′-CCAGGAAGCCGACGAACATC-3′；β-actin上游引物：5′-AAGGAGAAGCTGTGCTACG-TCG-3′，下游引物5′-TGCCCAGGAAGGAAGGTT-

G-3′。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2 標本采集解剖獼猴，采集肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結和脊髓，凍存于-20 ℃冰箱中以備使用。

1.2.3 RNA提取

取0.1 g組織，置于預冷的經DEPC水處理的滅菌研缽中，液氮研磨后加入1 mL Trizol混合，并移至2 mL滅菌離心管中，按照操作說明分別從獼猴的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結以及脊髓組織中提取總RNA。離心收集培養好的Huh 7.5.1細胞，提取細胞總RNA。

1.2.4 反轉錄獲得模板cDNA分別將提取的獼猴組織和細胞的總RNA用RNase-free水溶解后，采用以下體系去除基因組DNA：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL， gDNA Eraser 1 μL， 總RNA 3 μL， RNase Free dH2O 4 μL配置成10 μL體系，42 ℃水浴2 min，置于冰上冷激。抽取上述反應液，采用反轉錄體系：反應液10 μL， PrimerScriptRT Enzyme Mix1 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimerScript Buffer 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL配置成20 μL體系，37 ℃保溫15 min，85 ℃加熱5 s，置于冰上冷激后得到可用于熒光定量PCR的cDNA。

1.2.5 PCR擴增為鑒定引物的擴增特異性，采用上述合成的特異性擴增引物，以反轉錄獲得的cDNA為模板，分別進行丙肝感染關鍵基因OCLN和CD81、內參基因β-actin的PCR擴增。將獲得的PCR產物進行1.2 %瓊脂糖電泳，并將PCR產物送至上海生工測序。

1.2.6 實時熒光定量PCR對5只獼猴的各個組織cDNA進行定量擴增，采用25 μL熒光定量體系如下：cDNA模板2 μL， SYBR ?PremixExTaqTMⅡ 12.5 μL，上下游引物各1 μL，RNase free dH2O 8.5 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，58.6 ℃延伸30 s，72 ℃復性30 s，40個循環。

2 結果與分析

2.1OCLN，CD81與β-actin基因PCR擴增結果與測序分析用設計的引物進行PCR擴增，分別從獼猴組織細胞系中得到約169，126與179 bp的目的片段，與預期的條帶大小一致，見圖1。將PCR產物送檢測序，將其測序結果與GenBank進行BLAST比對，結果證實該擴增產物與基因模板序列同源性為100%。

泳道1為DL 2 000 marker； 泳道2為以獼猴川西亞種組織cDNA為模板擴增出的β-actin片段(169 bp)； 泳道3為以獼猴川西亞種組織cDNA作為模板擴增出的CD81片段(126 bp)； 泳道4為以獼猴川西亞種組織cDNA作為模板擴增出的OCLN片段(179 bp)。圖1 OCLN和CD81基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification product of OCLN and CD81 genes

2.2 實時熒光定量PCR

采用實時定量PCR對獼猴川西亞種的肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結和脊髓組織，以及Huh7.5.1細胞中的OCLN，CD81和β-actin進行擴增，所有的樣品均出現單一的S型擴增曲線，且重復性好，結果見圖2。

2.3 熔解曲線分析

所有樣品中OCLN的熔解溫度為79.5～80.0 ℃，差值范圍≤0.5 ℃，屬于正常差值范圍，CD81的熔解溫度為86 ℃，β-actin的熔解溫度為88.5 ℃。所有基因的熔解曲線有一個特異峰，說明實驗所用引物特異性好，見圖3。

2.4 相對表達量分析

采用Fold=2-△△CT對數據進行處理。結果發現，在Huh7.5.1中，CD81的表達量是OCLN的3.84倍(圖4)。獼猴不同組織中OCLN基因表達量明顯不同，一般肺部表達量最高，而淋巴結中最少，均極顯著低于Huh7.5.1中兩種基因的表達量(P<0.01)。針對OCLN在肝、脾和肺這3個主要臟器的表達量分析發現，5只獼猴符合以下規律：脾<肝<肺。淋巴結中OCLN的表達量最低，僅為Huh 7.5.1細胞中表達量的0.13%，遠遠低于Huh 7.5.1細胞中的表達量。獼猴肝臟中OCLN的表達量僅為Huh 7.5.1細胞中OCLN表達量的2.0%～3.5%，所檢測的所有肝臟樣品中，最高表達量是最低表達量的2.2倍，個體之間具有明顯差異(圖5、圖6)。而CD81在獼猴肝臟中的表達量最高，為Huh 7.5.1細胞中CD81表達量的4%～14%，最高表達量是最低表達量的3.5倍，不同個體之間差異明顯。在脊髓中表達量最低，脊髓中的CD81表達量僅為Huh 7.5.1細胞中表達量的1%，個體差異不明顯。與Huh 7.5.1細胞中CD81的表達量相比，淋巴結與脾臟中CD81表達量分別為Huh 7.5.1細胞的1%～6%與2%～5%，兩者表達量相當(圖5、圖6)。

圖2 Huh7.5.1細胞系與獼猴不同組織中OCLN，CD81和β-actin擴增曲線Fig.2 Quantitative PCR amplification plot of OCLN， CD81 and β-actin mRNA in Huh7.5.1 cells and different tissues of macaque

圖3 OCLN，CD81和β-actin熔解曲線Fig.3 Melting curve of OCLN， CD81 and β-actin

圖4 Huh 7.5.1中OCLN與CD81的表達量Fig.4 The expression of OCLN and CD81 in Huh 7.5.1

圖5 OCLN和CD81在Huh7.5.1與不同獼猴組織中的表達量Fig.5 The expression level of OCLN and CD81 in Huh7.5.1 and different macaque tissues

圖6 不同獼猴個體肝臟中OCLN和CD81的表達量Fig.6 The expression level of OCLN and CD81 in macaque liver

對比發現，獼猴組織中OCLN與CD81的表達量均遠低于Huh7.5.1細胞中的基因表達量。

3 討論

OCLN蛋白是介導丙型肝炎病毒(HCV)入侵細胞并且完成完整增殖周期的關鍵蛋白，其異常表達會降低HCV以及HCVpp對人體細胞的感染[3，10]。丙型肝炎由于其多突變型而難以治愈，疫苗研制困難。由于HCV具有感染物種特異性，從而大大限制了實驗動物模型種類[11]，故尋找可替代的染病狀態與人類盡可能接近的新的模型動物是近年來研究的熱點。普遍認為黑猩猩模型是最為理想的動物模型，因為黑猩猩的HCV感染、致病和免疫等過程與人類相似，但是由于倫理爭議而被限制使用。盡管已有的樹鼩模型和人鼠嵌合肝模型等均可用于HCV感染的研究，但是由于感染陽性率低，肝臟病理變化輕微等原因而限制其使用[12-13]。

Kohaar等[6]研究發現，OCLN在人體不同組織的表達具有明顯的差異。通過實驗我們發現，獼猴川西亞種也具有該特點，但是組織中OCLN的表達量均顯著低于Huh 7.5.1中OCLN的表達量。除此之外，OCLN在獼猴川西亞種不同組織之間表達量明顯不同，這可能與HCV感染的組織特異性有關。本研究結果表明，OCLN在獼猴組織中表達量大小為脾<肝<肺，該結果也與Kohaar等[6]測得人類的OCLN表達規律相符合。Sourisseau等[14]研究發現，豚尾猴OCLN與獼猴OCLN的E2區氨基酸排布一致，兩者與人類OCLN的E2區僅有一個氨基酸差別，但是該差別并不影響HCV入胞過程，OCLN的表達量低則是限制HCV感染豚尾猴的原因。因此推測，獼猴OCLN可能具有介導HCV感染細胞的能力，但是由于其表達量極低，HCV感染可能受到限制。

Sourisseau等[14]發現，豚尾猴與人類CD81共有4個氨基酸的差別，而該差別導致的結構差異則是限制HCV入胞以及限制HCV感染物種特異性的重要因素，其表達量低也是影響HCV感染豚尾猴肝細胞的因素。而獼猴與豚尾猴CD81的HCV結合區域氨基酸排序一致，因此推測獼猴CD81與HCV結合過程可能受到限制。我們發現，CD81在獼猴組織中均有表達，但表達量顯著低于Huh 7.5.1中的表達量，CD81在肝臟的表達量相比其他組織最高，也僅為4%～14%。我們推測，獼猴CD81表達量低以及其結構變異可能阻礙HCV結合過程，可能是導致獼猴無法直接感染HCV的因素之一。Bitzegeio等[15]發現，小鼠CD81與HCV的結合效率低，但是突變型HCV則可以有效地與小鼠CD81結合，進而感染細胞。因此，可在提高獼猴CD81表達量的同時，培養出適應獼猴CD81的突變型HCV，用以感染獼猴進行造模。

Dorner等[16]利用轉基因技術構建了能夠表達人類OCLN，CD81分子的轉基因小鼠模型，Ouyang等[17]建立了具有完整免疫功能的人鼠嵌合肝模型，Wu等[18]通過免疫組化證明了在該模型中有人類蛋白的存在，并且支持HCV復制及感染。但是上述兩種模型均不能用于免疫機制方面的研究[19-21]。與小鼠等實驗動物相比，獼猴擁有與人更加相近的基因背景和生理狀態，是良好的用于人類疾病造模的動物。針對OCLN在獼猴川西亞種的組織中表達量相比于Huh 7.5.1極低，可能不易感染HCV這一問題，或許可以從基因角度進行研究，通過提高OCLN的表達量來解決。由于結構差異導致的獼猴CD81可能無法有效與HCV結合這一問題，可以通過轉基因等技術解決，從而得到可以直接感染HCV的獼猴個體。

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(責任編輯 張 韻)

Distribution of HCV infection related OCLN and CD81 in different tissues of Macaca mulatta lasiotis

HE Liu1，CHEN Zheng-li1，2，LUO Qi-hui1，2，*，DENG Juan1，XIA Yu1，SHI Liang-qin1，CHENG An-chun2

(1.LaboratoryofExperimentalAnimalDiseaseModel，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince/CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

The study on hepatitis C virus (HCV) was restricted by lack of suitable animal model.Macacamulattalasiotis， known as macaque which has the similar genetic background with human， may be a suitable animal model for studying HCV infection. By testing the expression level of species tropism geneOCLNandCD81 in different macaque tissues， the possibility of using macaque as an effective animal model was explored with the expression level of HCV-susceptible human liver cancer cell line of Huh 7.5.1 as the control. The results showed thatOCLNandCD81 were expressed in liver， spleen， lungs， lymph nodes and spinal cord of macaque， but the expression levels were significantly lower than that in Huh 7.5.1(P<0.01). The expression ofOCLNin liver was lower than that in lung， butCD81 expression in liver was higher than other tissues. In addition， the expression ofOCLNin different tissues of macaque showed a similar pattern as that in human， with a decreasing order of lung>liver>spleen. It was concluded that the low expression level ofOCLNandCD81 in macaque could lead to the ineffective combination of HCV and target tissue， which was possibly related to the inefficiency of macaque as a suitable animal model for HCV. In future， the expression level of OCLN and CD81 in macaque may be enhanced by genetic manipulation， so as to improve the HCV-infection of macaque.

HCV; OCLN; CD81;Macacamulattalasiotis; animal model

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.08

2015-07-16

國家科技支撐計劃課題(2014BAI03B01)；國家重大科學儀器設備開發專項(2013YQ49085906)；四川省青年科技創新研究團隊項目(2013TD0015)

何柳(1994—)，女，河南許昌人，在讀本科生，研究方向為實驗動物疾病模型方向。E-mail：heliu.july@gmail.com

*通信作者，羅啟慧，E-mail：lqhbiology@163.com

S852

A

1004-1524(2016)01-0044-07

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):44-50

何柳，陳正禮，羅啟慧，等. 丙肝感染宿主親嗜性基因OCLN和CD81在獼猴川西亞種組織中的分布[J].浙江農業學報，2016，28(1)：44-50.