25味常用清熱解毒藥提取物對豬源幽門螺桿菌的體外抑菌活性

榮 茜，代鵬飛，鄧 林，秦紅霞，李英倫

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

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25味常用清熱解毒藥提取物對豬源幽門螺桿菌的體外抑菌活性

榮 茜，代鵬飛，鄧 林，秦紅霞，李英倫

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

采用乙醇回流、超聲波等方法提取金果欖等25味常用清熱解毒中藥的抗菌活性成分，分別測定它們對豬源幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration， MIC)，篩選出對豬源Hp具有良好體外抑菌效果的幾味中藥，并評價其體外聯(lián)合抑菌效果。結果顯示，黃連和青果的提取物對豬源Hp的MIC范圍為1.56～3.12 mg·mL-1。金銀花、金果欖、大青葉、玄參、山豆根、白頭翁、紫花地丁、大黃和蒲公英提取物的MIC范圍為12.50～25.00 mg·mL-1。大血藤、虎杖、射干、忍冬藤、菊花、魚腥草、連翹、板藍根、益母草、訶子和白蘞提取物的MIC范圍為50.00～100.00 mg·mL-1。升麻、綿馬貫眾、柴胡提取物的MIC≥200.00 mg·mL-1。兩兩聯(lián)合抑菌試驗結果表明，青果和金果欖的聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)≤0.5，青果或金果欖分別與黃連聯(lián)合的0.52。本研究表明，黃連、青果、金銀花、金果欖對豬源Hp均有很強的體外抗菌活性，青果與金果欖為協(xié)同作用，青果或金果欖分別與黃連聯(lián)合時為相加作用，黃連、青果、金果欖分別與金銀花聯(lián)合時均為拮抗作用。

豬源幽門螺桿菌；中藥提取物；抗菌活性；體外

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是定植于動物胃黏膜表面與黏膜層之間的微需氧菌，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關淋巴組織瘤和胃癌的發(fā)生有著密切聯(lián)系[1]。國內(nèi)外關于Hp的研究多集中在人體上，對于家畜的Hp相關性疾病研究很少。流行病學調查顯示，集約化豬場中豬胃潰瘍病的發(fā)病率達38%，而四川地區(qū)的商品豬中發(fā)病率高達65%，豬場中Hp的檢出率為30%～60%，由此可以推斷Hp感染是造成豬胃潰瘍病的重要因素之一[2-4]。目前，對于豬胃潰瘍病的治療主要采用改良豬種和抗生素治療的方法。抗生素治療存在預防效果不顯著，治療周期過長，效果不明顯，以及藥物殘留嚴重等問題，使得豬胃潰瘍病成為養(yǎng)豬業(yè)亟待解決的難題之一[5]。

中草藥具有調節(jié)動物機體免疫力、殺滅或抑制細菌和病毒等作用，并具有低毒、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[6]。中獸醫(yī)學認為，Hp感染屬“邪氣”范疇，且多具“熱”“毒”性質，故應以清熱解毒、扶正祛邪為治療Hp相關性胃病的指導方針[7]。本研究以常用的25味清熱解毒藥的提取物為研究對象，通過研究其對豬源性Hp的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，篩選得到具有良好體外抗菌活性的中藥提取物，然后通過棋盤稀釋法研究不同中藥提取物兩兩結合對豬源性Hp的體外抑菌效果，為進一步研制治療豬胃潰瘍病的中藥組方制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株豬源性Hp菌株，編號SCYA201401，由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院中獸醫(yī)與中藥學實驗室自行分離，經(jīng)PCR等方法鑒定為細胞毒素相關蛋白A基因陽性(CagA+)和細胞空泡毒素A基因陽性(VacA+)菌株。

1.1.2 藥材黃連rhizoma coptidis(產(chǎn)地四川，批次：080406)、青果fructus canarii(產(chǎn)地四川，批次：100310)、金銀花flos lonicerae(產(chǎn)地四川，批次：080919)、金果欖radix tinosporae(產(chǎn)地四川，批次：080406)、大青葉folium isatidis(產(chǎn)地四川，批次：100310)、玄參radix scrophulariae(產(chǎn)地陜西，批次：080919)、山豆根radix sophorae tonkinensis(產(chǎn)地四川，批次：080406)、白頭翁radix pulsatillae(產(chǎn)地四川，批次：100310)、紫花地丁herba violae(產(chǎn)地四川，批次：100310)、大黃radix et rhizome rhei(產(chǎn)地四川，批次：080406)、蒲公英herba taraxaci(產(chǎn)地貴州，批次：100217)、大血藤caulis sargentodoxae(產(chǎn)地河南，批次：101114)、虎杖rhizome polygoni cuspidati(產(chǎn)地四川，批次：081102)、射干rhizoma belamcandae(產(chǎn)地四川，批次：101114)、忍冬藤caulis lonicerae(產(chǎn)地四川，批次：100826)、菊花flos chrysanthemi(產(chǎn)地四川，批次：080406)、魚腥草herba houttuyniae(產(chǎn)地四川，批次：100310)、連翹fructus forsythiae(產(chǎn)地四川，批次：100310)、板藍根radix isatidis(產(chǎn)地四川，批次：080406)、益母草herba leonuri(產(chǎn)地四川，批次：080312)、訶子fructus chebulae(產(chǎn)地云南，批次：090312)、白蘞radix ampelopsis(產(chǎn)地遼寧，批次：080919)、升麻rhizoma cimicifugae(產(chǎn)地四川，批次：080406)、綿馬貫眾rhizoma dryopteris crassirhizomatis(產(chǎn)地黑龍江，批次：101114)、柴胡radix bupleuri(產(chǎn)地河南，批次：100310)25味藥材均購自四川成都惠民堂藥業(yè)連鎖有限責任公司，由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學系范巧佳副教授鑒定均為正品。

1.1.3 培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基為加有7%脫纖維綿羊血和選擇性抗生素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基為加有5%胎牛血清的布氏肉湯，所有材料均購自青島市海博生物技術有限公司。

1.1.4 主要儀器設備和試劑超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、全自動高壓滅菌鍋(東南科儀有限公司)、KH-100B型超聲波清洗機(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)、旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、微需氧產(chǎn)氣袋(三菱瓦斯化學株式會社)、密封培養(yǎng)罐(三菱瓦斯化學株式會社)，2， 3， 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，純度≥95%，BIOSHARP)、二甲亞砜(分析純，成都市科龍化工試劑廠)、無水乙醇(分析純，成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 方法

1.2.1 藥物有效成分的提取按照文獻[8-31]的方法提取金果欖等25味中藥的有效成分，金果欖、黃連、虎杖、蒲公英、魚腥草、紫花地丁、白頭翁、板藍根、益母草、訶子、大青葉、玄參、山豆根、大黃、綿馬貫眾、柴胡、升麻和射干采用乙醇回流提取法，金銀花、菊花和青果采用超聲波提取法，連翹、大血藤、忍冬藤和白蘞采用水煎法提取。醇提液和超聲提取液各自合并濾液后，濃縮制成浸膏，并計算浸膏得率。使用前將浸膏用適量二甲亞砜溶解，制成生藥質量濃度為2 g·mL-1的藥液；水提液合并濾液后用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至生藥濃度為2 g·mL-1的藥液。所有藥液都需經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 Hp菌懸液的制備按文獻[32]的方法將Hp SCYA201401接種于固體培養(yǎng)基上，于微需氧培養(yǎng)條件(5%O2，10%CO2，85%N2，濕度>98%)中37 ℃培養(yǎng)72 h，傳代純化后接種于液體培養(yǎng)基中，經(jīng)麥氏標準比濁管比濁，制備成標準濁度約0.5的菌液(約1×108cfu·mL-1Hp菌懸液)。

1.2.3 藥敏試驗及結果判定取上述方法制備好的約1×108cfu·mL-1Hp菌懸液100 μL，用L型玻棒均勻涂布于整個固體培養(yǎng)基中，然后用無菌手術鑷子在培養(yǎng)基正中放置直徑6 mm牛津杯一個，向其中分別加入25 μL藥液，操作時間必須控制于15 min內(nèi)，然后將藥敏平板放置于微需氧培養(yǎng)條件中培養(yǎng)72 h，觀察抑菌圈，游標卡尺測量直徑。每味中藥提取物重復3次，取中位數(shù)。

參考相關文獻制定藥敏試驗結果判定標準[33]，分為高度敏感：抑菌圈直徑≥20 mm；中度敏感：10 mm≤抑菌圈直徑<20 mm；低度敏感：6 mm<抑菌圈直徑<10 mm；不敏感：無抑菌圈。

1.2.4 MIC測定改良文獻[34]中采用的試管2倍稀釋法：取12支滅菌試管，將其中1支作為陰性對照管，1支作為陽性對照管，其余10支作為試驗組并依次編號。首先向試驗組1號管加入藥液2 mL，其余11支試管加入滅菌雙蒸水1 mL。從1號管吸取1 mL藥液至2號管中，混勻后從2號管取出1 mL至3號管中，依次類推，直至10號管，混勻后從10號管吸取1 mL棄去。然后，向所有12支試管中各加入4 mL的液體培養(yǎng)基，混勻。使得試驗組1～10號試管的藥物濃度依次為400.00，200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.12，1.56，0.78 mg·mL-1。最后，取出制備好的約1×108cfu·mL-1Hp菌懸液，在15 min內(nèi)向試驗組和陽性對照組的每一支試管中各加入100 μL菌懸液，置于微需氧培養(yǎng)條件中培養(yǎng)60 h。取出全部試管，每管分別加入5%TTC溶液100 μL，混勻后再次置于微需氧培養(yǎng)條件中培養(yǎng)12 h。以無顯色反應的最低稀釋度為該中藥提取物的MIC。

1.2.5 體外聯(lián)合抑菌試驗及結果判定根據(jù)單味中藥的體外抑菌結果，選擇其中抑菌活性較強的幾味中藥提取物進行兩兩聯(lián)合抑菌活性的研究。改良文獻[35]中采用的瓊脂稀釋棋盤法為肉湯棋盤稀釋法：以各中藥提取物對應的4倍MIC，2倍MIC，1倍MIC，1/2倍MIC，1/4倍MIC 5個濃度分別進行聯(lián)合抑菌試驗。以金果欖和青果為例：取25支滅菌試管，5支一組，1～5組每組分別加入用滅菌雙蒸水稀釋好的4 MIC，2 MIC，1 MIC，1/2 MIC，1/4 MIC的金果欖藥液各500 μL。然后，向每一組的5支試管分別加入用滅菌雙蒸水稀釋好的4 MIC，2 MIC，1 MIC，1/2 MIC，1/4 MIC的青果藥液各500 μL。之后每支試管中各加入4 mL的液體培養(yǎng)基，混勻。加Hp菌懸液及后續(xù)操作同1.2.4節(jié)。

試驗結果以聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI)來判斷聯(lián)合效應[36]：

FICI=MIC(A)聯(lián)合/MIC(A)單獨+MIC(B)聯(lián)合/MIC(B)單獨當FICI≤0.5時為協(xié)同作用；0.52時為拮抗作用。

2 結果與分析

2.1 25味清熱解毒中藥提取物對豬源Hp的體外抑菌活性

25味清熱解毒中藥提取物對豬源Hp的體外抑菌結果見表1。

由表1可知，黃連、青果、金果欖和金銀花4味中藥提取物的抑菌圈直徑≥20.00mm，MIC范圍為1.56～12.50 mg·mL-1，抑菌效果最好。大青葉、玄參、山豆根等18味中藥提取物的抑菌圈直徑為10.00～20.00 mm，MIC范圍為12.50～100.00 mg·mL-1，抑菌效果較好。升麻、綿馬貫眾和柴胡提取物的抑菌圈直徑<10.00 mm，MIC范圍≥200.00 mg·mL-1，抑菌效果差。

2.2 金果欖等4味中藥提取物對豬源Hp的體外聯(lián)合活性

通過單味藥的體外抑菌結果，選擇黃連、青果、金果欖和金銀花提取物進行兩兩體外聯(lián)合抑菌試驗，結果見表2。

根據(jù)FICI值的判斷標準，青果提取物和金果欖提取物的FICI≤0.5，為協(xié)同作用；黃連提取物和金果欖、青果提取物的0.52，為拮抗作用。

3 討論

清熱解毒藥是一類臨床應用極為廣泛的中藥，大量研究表明它們對許多細菌、病毒都具有抑制作用，但由于提取方法的不同導致結果差異性很大。眾所周知，中藥成分非常復雜，所以提取其中的有效成分的方法對于提高藥效具有十分重要的作用。本研究根據(jù)25味清熱解毒藥的不同有效成分，分別采用文獻報道中最佳的提取工藝，采用乙醇回流法、超聲波提取法以及煎煮法對它們進行有效成分的提取，以求獲得最大量的有效成分，從而使得藥效達到最佳。

表1 25味清熱解毒藥提取物對豬源幽門螺桿菌的體外抑菌活性

Table 1 Antimicrobial activities of active ingredients extracts of twenty-five tradition antipyretic and antidote medicine toHelicobacterpylorifrom swineinvitro

中藥提取物抑菌圈直徑/mmMIC/(mg·mL-1)中藥提取物抑菌圈直徑/mmMIC/(mg·mL-1)黃連32.321.56虎杖16.5050.00青果35.503.12大血藤14.9250.00金銀花24.9012.50忍冬藤14.2250.00金果欖21.2212.50菊花13.4250.00玄參19.2812.50訶子19.42100.00大青葉14.5412.50板藍根18.40100.00紫花地丁16.4625.00白蘞10.82100.00大黃12.6025.00益母草10.48100.00白頭翁11.4025.00連翹10.26100.00山豆根11.2025.00綿馬貫眾6.68200.00蒲公英10.9025.00升麻6.42200.00射干22.8050.00柴胡0.00>400魚腥草17.3450.00

表2 四味中藥提取物兩兩聯(lián)合用藥對豬源幽門螺桿菌的FICI

Table 2 The FICI to pairwise combination of active ingredients extracts of four herbs againstHelicobacterpylorifrom swine

聯(lián)合藥物MIC/(mg·mL-1)黃連青果金果欖金銀花MIC單MIC合MIC單MIC合MIC單MIC合MIC單MIC合FICI作用效應黃連+青果1.560.783.120.780.75相加黃連+金果欖1.560.7812.506.251.00相加黃連+金銀花1.560.7812.5025.002.50拮抗青果+金果欖3.120.7812.503.120.50協(xié)同青果+金銀花3.126.2512.5012.503.00拮抗金果欖+金銀花12.5012.5012.5025.003.00拮抗

25味常用清熱解毒藥的體外抑菌活性試驗結果表明，除柴胡外的其他24種藥物對豬源Hp都具有抑制作用，其中黃連、青果、金果欖、金銀花的抑制作用最強。大部分結果與文獻報道中它們對人源Hp的抑制作用基本一致，比較突出的是青果、金銀花和菊花對豬源Hp的抑菌活性顯著優(yōu)于人源，可能是因為提取方法的不同導致的，即在超聲波提取法下這3種藥物的有效成分含量可能顯著高于其他提取方法。Ma等[34]報道板藍根對人源Hp有很好的抑菌活性，但在本研究中效果并不特別理想，根據(jù)胡曉燕等[37]報道的板藍根抑菌的主要活性部位是總有機酸部位，分析是由于在乙醇回流提取過程有機酸成分的流失造成的抑菌效果降低。

聯(lián)合抑菌試驗結果顯示，金果欖和青果聯(lián)合可產(chǎn)生協(xié)同作用，抗菌作用非常明顯，鑒于之前未見有報道將二者聯(lián)合應用于Hp相關性胃病的治療中，可以組成一個復方，用于豬，甚至人的Hp相關性胃病的治療研究。有報道指出，2009年四川省青果年產(chǎn)量高達800萬kg，已成為全國青果的主產(chǎn)區(qū)之一[38]。同時，四川省還是金果欖的主產(chǎn)地之一，生長著2種被藥典收錄的金果欖藥材基源植物，特別是道地藥材峨眉青牛膽(其塊根入藥即為金果欖)又被研究證明具有良好的抗炎抗菌活性。若將二者組方開發(fā)為臨床用藥，將具有原材料豐富、成本相對較低的天然優(yōu)勢。相關二者的后續(xù)研究應從其抑制Hp的機制入手，為Hp相關性胃炎、胃潰瘍的治療提供依據(jù)。

本研究改良了研究中藥對Hp體外抑菌活性的方法，由于中藥中成分復雜，其提取物大部分具有“黑”的特點，使得MIC范圍難以準確界定。在Hp培養(yǎng)后期加入濃度為5%的TTC溶液，可使得抑菌結果更加準確直觀。本研究還首次報道了中藥對豬源Hp的體外抑菌活性，為獸醫(yī)臨床抗幽門螺桿菌的中藥組方提供了參考，并指出了后續(xù)的研究方向。

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(責任編輯 盧福莊)

Effects of twenty-five traditional antipyretic and antidote medicine extracts against Helicobacter pylori from swine in vitro

RONG Qian， DAI Peng-fei， DENG Lin， QIN Hong-xia， LI Ying-lun*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Using ethanol reflux， water decoction or ultrasonic method， extracts of 25 different traditional antipyretic and antidote medicines were obtained. Inhibition zone diameters of above 25 extracts onHelicobacterpylori(Hp) from swine were detected by Oxford cup method. Minimal inhibitory concentration(MIC) were detected by macrodilution broth method， and combined antibacterial effectsinvitroof them were also observed. MICs of the extracts obtained from rhizome coptidis， fructus canarii against Hp ranged from 1.56 to 3.12 mg·mL-1. MICs of the extracts obtained from flos lonicerae， radix tinosporae， folium isatidis， radix scrophulariae， radix sophorae tonkinensis， radix pulsatillea， herba violae， radix et rhizome rhei and herba taraxaci ranged from 12.50 to 25.00 mg·mL-1. MICs of the extracts obtained from caulis sargentodoxae， rhizome polygoni cuspidati， rhizoma belamcandae， caulis lonicerae， flos chrysanthemi， herba houttuyniae， fructus forsythiae， radix isatidis， herba leonuri， fructus chebulae and radix ampelopsis ranged from 50.00 to 100.00 mg·mL-1. MICs of the extracts obtained from rhizome cimicifugae， rhizome dryopteris crassirhizomatis and radix bupleuri exceeded 200.00 mg·mL-1. The results of pairwise joint bacteriostatic test showed that the fractional inhibitory concentration index (FICI) of the extracts from fructus canarii and radix tinosporea against Hp was less than or equal to 0.5. The FICI of fructus canarii/radix tinosporea with rhizome coptidis were more than 0.5， but less than or equal to 1. The FICI of fructus canarii/radix tinosporea/rhizome coptidis with flos lonicerae were more than 2. It was concluded that fructus canarii， radix tinosporea， rhizome coptidis， flos lonicerae showed a good antibacterial effect against Hpinvitro. The combination of fructus canarii and radix tinosporea was characterized by a synergism effect， whereas the combination of fructus canarii and rhizome coptidis， radix tinosporea and rhizome coptidis， respectively， was characterized by an additive effect. The combination of fructus canarii or radix tinosporea or rhizome coptidis with flos lonicerae showed a antagonism effect.

swine-derivedHelicobacterpylori; traditional Chinese medicine extract; antimicrobial activity;invitro

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.07

2015-05-29

四川省科技支撐計劃(2013NZ0019)

榮茜(1990—)，女，在讀碩士研究生，研究方向為藥理學與毒理學。E-mail：rongqian1213@163.com

*通信作者，李英倫，E-mail：liyinglun01@163.com

S853.74

A

1004-1524(2016)01-0038-06

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):38-43

榮茜，代鵬飛，鄧林，等. 25味常用清熱解毒藥提取物對豬源幽門螺桿菌的體外抑菌活性[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28(1):38-43.