天府肉鴨發(fā)育過(guò)程中胸腺Bcl-2，Bax基因及蛋白的表達(dá)

劉春雨，朱盼盼，方 靜，蔣 敏，尹 恒

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

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天府肉鴨發(fā)育過(guò)程中胸腺Bcl-2，Bax基因及蛋白的表達(dá)

劉春雨，朱盼盼，方 靜，蔣 敏，尹 恒

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

為探討胸腺淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，將65只天府肉鴨分為22，24，26 d胚齡3個(gè)組和胚后0(新生雛)，3，5，8，14，17，20，26，29，32周齡10個(gè)組，采用免疫組織化學(xué)和原位雜交方法研究天府肉鴨胚胎及胚后發(fā)育期胸腺中Bcl-2和BaxmRNA及其蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Bcl-2和BaxmRNA及蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)見(jiàn)于胸腺淋巴細(xì)胞及胸腺上皮細(xì)胞。胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2蛋白陽(yáng)性率在22 d胚齡～17周齡恒定，20～32周齡呈下降趨勢(shì)；淋巴細(xì)胞BAX蛋白陽(yáng)性率在22～26 d胚齡恒定，0～8周齡上升，8～17周齡恒定，20～32周齡呈上升趨勢(shì)；淋巴細(xì)胞BCL-2/BAX值在22～26 d胚齡恒定；0～8周齡下降，8～17周齡恒定，20～32周齡下降。胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA和BaxmRNA 陽(yáng)性率分別與其蛋白陽(yáng)性率變化規(guī)律一致。各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA 與蛋白陽(yáng)性率以及BCL-2/BAX值均顯著低于髓質(zhì)；各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BaxmRNA和蛋白陽(yáng)性率均明顯高于髓質(zhì)。推測(cè)BCL-2和BAX蛋白及其基因是天府肉鴨胸腺胚胎及胚后發(fā)育期淋巴細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)物。

鴨；胸腺；Bcl-2；Bax；免疫組化；原位雜交

胸腺是禽類(lèi)的中樞免疫器官，是培育T淋巴細(xì)胞的場(chǎng)所。在胸腺發(fā)育過(guò)程中，凋亡機(jī)制參與淋巴細(xì)胞選擇的全過(guò)程。胸腺中淋巴細(xì)胞凋亡同一般細(xì)胞一樣，受多種基因調(diào)控，其中Bcl-2(B-cell lymphoma-2，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因)和Bax基因家族發(fā)揮著重要的作用[1-3]。

BCL-2具有抗細(xì)胞凋亡的作用，而B(niǎo)AX可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。前人用多種方法探討了Bcl-2和Bax基因及其相關(guān)蛋白在高等動(dòng)物胸腺中的自然表達(dá)[4-7]，但在禽類(lèi)報(bào)道中較少，且集中在雞胸腺發(fā)育的某一或某些特定時(shí)期，如張書(shū)霞等[8]用Northern blot 分子雜交技術(shù)研究了成年雞和胚胎雞胸腺中Bcl-2基因表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系；隨后又用流式細(xì)胞法測(cè)定了雞胸腺中BCL-2蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡率[9]。李奎等[10]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究了BCL-2，BAX凋亡蛋白在雞胸腺胚后發(fā)育期中的表達(dá)。而天府肉鴨胸腺發(fā)育過(guò)程中BCL-2與BAX蛋白及基因的自然表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。

作者前期工作顯示淋巴細(xì)胞凋亡在天府肉鴨胸腺胚胎及胚后發(fā)育過(guò)程中普遍存在，且具有明顯增齡變化特性[11]。在此基礎(chǔ)上本研究應(yīng)用免疫組化方法及原位雜交技術(shù)對(duì)天府肉鴨胸腺胚胎及胚后發(fā)育過(guò)程中BCL-2和BAX蛋白及其基因表達(dá)進(jìn)行定性和定量的動(dòng)態(tài)觀察，以揭示兩種分子的表達(dá)時(shí)序、相互作用關(guān)系，旨在更深入地認(rèn)識(shí)胸腺細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選用四川農(nóng)業(yè)大學(xué)種鴨場(chǎng)同批孵化和飼養(yǎng)的天府肉鴨，按發(fā)育年齡分組，胚胎期分為22，24，26 d胚齡3個(gè)組；胚后期分為0(新生雛)，3，5，8，14，17，20，26，29，32周齡10個(gè)組。每組試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)為5 羽(胚胎期不分性別，胚后期均為雄鴨)。

1.2 光鏡標(biāo)本制作

分別采取各組鴨的胸腺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.3 主要試劑

兔抗BCL-2和BAX多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、Bcl-2和BaxmRNA原位雜交試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 BCL-2和BAX免疫組化染色

BCL-2和BAX免疫組化染色方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11](一抗的稀釋濃度為1∶100)，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。BCL-2和BAX陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色。

1.5 原位雜交檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNABcl-2和BaxmRNA原位雜交染色方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其主要步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，30% H2O21份加純甲醇50份混合，室溫30 min以滅活內(nèi)源性酶；滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37 ℃或室溫消化5～120 s；后固定于4%多聚甲醛/0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2～7.6)，含有1/1 000 DEPC，室溫10 min；滴加預(yù)雜交液，38～42 ℃ 24 h；滴加雜交液，恒溫38～42 ℃ 24 h；滴加封閉液37 ℃ 30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛37 ℃ 60 min 或室溫120 min；滴加SABC 37 ℃ 20 min 或室溫30 min；滴加生物素化過(guò)氧化物酶37 ℃ 20 min 或室溫30 min；DAB顯色；蘇木素輕度復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡觀察。以上各步驟均用原位雜交用PBS洗滌。陰性對(duì)照采用兩種方法，方法一用RNA酶預(yù)處理；方法二用不含Bcl-2或Bax寡核苷酸探針雜交液孵育，其余步驟同上。Bcl-2或BaxmRNA陽(yáng)性反應(yīng)物定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。

1.6 定量分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)胸腺標(biāo)本間隔200 μm取一張切片，共取3張切片，每張切片隨機(jī)選取胸腺小葉各10個(gè)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(用江蘇捷達(dá)801形態(tài)分析軟件)。淋巴細(xì)胞BCL-2或BAX陽(yáng)性率=單位面積內(nèi)BCL-2或BAX陽(yáng)性淋巴細(xì)胞總數(shù)/單位面積內(nèi)淋巴細(xì)胞總數(shù)×100%。單位面積為0.001 mm2，相當(dāng)于1 000倍下的視野范圍。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析中的LSD或Dunnett T3法對(duì)組間進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)處理均用SPSS 11.5軟件，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCL-2和BAX蛋白免疫組織化學(xué)

實(shí)驗(yàn)片中，BCL-2和BAX蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性物質(zhì)定位于胞質(zhì)和胞膜(圖1-a—e)；在陰性對(duì)照片中，均為單一藍(lán)色蘇木素染色(圖1-f)。

各組中均可見(jiàn)胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞呈BCL-2和BAX陽(yáng)性反應(yīng)(圖1-a—e)。表1顯示，胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2陽(yáng)性率在22 d胚齡～17周齡無(wú)明顯變化(P>0.05)，20周齡顯著下降(P<0.05)，隨后呈下降趨勢(shì)，32周齡達(dá)最低；各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2陽(yáng)性率均顯著低于髓質(zhì)(P<0.05)。皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BAX陽(yáng)性率在22～26 d胚齡無(wú)明顯變化(P>0.05)，0～8周齡逐漸上升(P<0.05)，8～17周齡恒定(P>0.05)，20周齡顯著升高(P<0.05)，以后呈上升趨勢(shì)，32周齡達(dá)其峰值；各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BAX陽(yáng)性率均明顯高于髓質(zhì)(P<0.05)。皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2/BAX比值在22～26 d胚齡恒定(P>0.05)，0～8周齡下降(P<0.05)，8～17周齡恒定(P>0.05)，20～32周齡呈下降趨勢(shì)； 各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2/BAX值均明顯低于髓質(zhì)(P<0.05)(詳情見(jiàn)表1)。此外，在5～32周齡各組中，部分皮質(zhì)和髓質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞呈BCL-2陽(yáng)性反應(yīng)(圖1-b)；彌散胸腺小體的上皮細(xì)胞呈BCL-2和BAX陽(yáng)性反應(yīng)。

2.2 Bcl-2和Bax mRNA原位雜交

實(shí)驗(yàn)片中，Bcl-2和BaxmRNA原位雜交免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性物質(zhì)多定位于胞質(zhì)和胞膜，少量定位于核膜和核質(zhì)(圖2-a—e)；在陰性對(duì)照片中，均為單一藍(lán)色蘇木素染色(圖2-f)。

各組中均可見(jiàn)胸腺淋巴細(xì)胞呈Bcl-2和BaxmRNA陽(yáng)性反應(yīng)(圖2-a—e)。表2顯示胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA陽(yáng)性率在22 d胚齡～17周齡無(wú)明顯變化(P>0.05)；20周齡顯著下降(P<0.05)，隨后呈下降趨勢(shì)，32周齡達(dá)最低；各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA陽(yáng)性率均明顯小于髓質(zhì)(P<0.05)。表2還顯示皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BaxmRNA陽(yáng)性率在22～26 d胚齡恒定(P>0.05)，0～8周齡上升(P<0.05)，8～17周齡恒定(P>0.05)，20～32周齡呈上升趨勢(shì)。各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BaxmRNA 陽(yáng)性率均明顯高于髓質(zhì)(P<0.05)。此外，彌散胸腺小體中部分胸腺上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞呈Bcl-2和BaxmRNA陽(yáng)性反應(yīng)(圖2-e)。

表1 胸腺淋巴細(xì)胞BCL-2，BAX蛋白陽(yáng)性率及BCL-2/BAX值

Table 1 The positive ratios of BCL-2 and BAX proteins and the BCL-2/BAX values in lymphocytes of thymus

組別胸腺小葉BCL-2陽(yáng)性率/%胸腺小葉BAX陽(yáng)性率/%胸腺小葉BCL-2/BAX皮質(zhì)髓質(zhì)皮質(zhì)髓質(zhì)皮質(zhì)髓質(zhì)22d胚齡49.53±6.35a54.37±3.50a14.83±2.99h12.02±2.54i3.43±0.65a4.70±0.98a24d胚齡49.08±4.69a55.84±7.50a14.81±3.53h12.01±1.48i3.48±0.78a4.69±0.72a26d胚齡49.60±5.76a54.77±7.26a13.99±1.80h12.18±1.60i3.62±0.79a4.59±1.06a0周齡50.56±6.01a57.50±4.88a18.49±2.67g15.02±1.07h2.80±0.62b3.85±0.51b3周齡50.82±4.39a56.45±8.24a22.27±4.49f18.11±1.56g2.37±0.53c3.13±0.51c5周齡50.85±4.62a57.29±5.31a30.61±3.73e24.73±3.13f1.69±0.29d2.34±0.34d8周齡48.74±5.11a53.48±2.83a34.38±4.73d29.91±5.28e1.44±0.28e1.83±0.33e14周齡49.58±4.89a55.61±5.54a35.02±4.13d30.47±3.44e1.43±0.24e1.84±0.28e17周齡49.71±5.86a55.61±4.51a35.39±4.14d30.03±1.96e1.42±0.21e1.85±0.13e20周齡37.36±6.12b46.87±5.03b39.81±4.43c35.12±3.30d0.96±0.26f1.34±0.21f26周齡25.95±3.31c34.35±3.16c46.30±4.42b40.92±3.70c0.56±0.06g0.84±0.08g29周齡19.13±4.38d28.31±5.31d46.75±2.56b44.89±2.59b0.41±0.10g0.63±0.10h32周齡14.61±3.85e21.47±3.62e51.94±5.02a48.64±5.01a0.28±0.07h0.44±0.06i

注：同列不同小寫(xiě)字母標(biāo)注示差異顯著(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母標(biāo)注示差異不顯著(P>0.05)。下同。

a： 26 d胚齡胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2蛋白陽(yáng)性反應(yīng)； b： 胚后20周齡皮質(zhì)淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞(箭頭)BCL-2蛋白陽(yáng)性反應(yīng)； c： 胚后29周齡髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2蛋白陽(yáng)性反應(yīng)； d： 22 d胚齡皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BAX蛋白陽(yáng)性反應(yīng)； e： 胚后32周齡皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BAX蛋白陽(yáng)性反應(yīng)； f： 胚后3周齡胸腺BAX蛋白陰性對(duì)照。 C: 皮質(zhì); M: 髓質(zhì)； 標(biāo)尺=20 μm。圖1 胸腺BCL-2、BAX蛋白免疫組織化學(xué)染色Fig.1 The immunohistochemistry for BCL-2 and BAX protein in thymus

3 討論

胸腺是培育T淋巴細(xì)胞的重要場(chǎng)所，其中95%的T淋巴細(xì)胞通過(guò)凋亡而死亡[1]。凋亡對(duì)胸腺T淋巴細(xì)胞的發(fā)育、分化和成熟以及保持其功能穩(wěn)定性均發(fā)揮著重要作用。方靜等[11]前期研究結(jié)果顯示，天府肉鴨胸腺胚后發(fā)育可分為繼續(xù)發(fā)育期(0～8周齡)、成熟持續(xù)期(8～17周齡)和退化期(20～32周齡)；胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞凋亡率在22～26 d胚齡恒定；0～8周齡上升，8～17周齡恒定，20～32周齡上升。

表2 胸腺淋巴細(xì)胞Bcl-2和BaxmRNA陽(yáng)性率

Table 2 The positive ratios ofBcl-2 andBaxmRNA in lymphocytes of thymus

組別胸腺小葉Bcl-2mRNA陽(yáng)性率/%胸腺小葉BaxmRNA陽(yáng)性率/%皮質(zhì)髓質(zhì)皮質(zhì)髓質(zhì)22d胚齡12.30±2.14a30.69±5.28a7.31±0.28h4.23±0.41h24d胚齡13.17±4.17a32.46±4.17a8.47±0.89h4.39±0.55h26d胚齡11.47±3.78a31.24±4.99a8.17±0.54h5.23±0.28h0周齡12.14±4.01a30.07±3.57a12.14±2.47g9.41±0.37g3周齡11.89±1.70a30.71±4.23a17.54±4.17f14.28±3.71f5周齡12.56±2.07a31.05±5.17a22.36±3.09e19.23±2.39e8周齡13.06±3.01a32.36±3.27a26.05±4.71d22.47±2.75d14周齡12.34±4.27a30.01±4.28a25.06±3.33d23.99±3.04d17周齡13.43±1.99a31.45±3.66a26.99±2.78d23.01±2.75d20周齡8.27±0.29b25.17±4.78b32.80±5.45c24.65±4.69c26周齡7.12±0.37b18.27±2.47c36.47±4.41b25.10±5.12c29周齡4.13±0.21c16.24±4.89c35.31±4.17b29.33±5.98b32周齡4.97±0.38c10.14±3.01d42.01±6.89a36.09±6.25a

a： 胚后3周齡皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA陽(yáng)性反應(yīng)； b： 胚后29周齡皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA陽(yáng)性反應(yīng)； c： 22 d胚齡皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞Bax mRNA陽(yáng)性反應(yīng)； d： 胚后32周齡髓質(zhì)淋巴細(xì)胞Bax mRNA陽(yáng)性反應(yīng)； e： 胚后29周齡彌散胸腺小體(＊)中上皮細(xì)胞(粗箭頭)和淋巴細(xì)胞(細(xì)箭頭)Bax mRNA陽(yáng)性反應(yīng)； f： 胚后3周齡胸腺Bax mRNA陰性對(duì)照。 C： 皮質(zhì)； M： 髓質(zhì)；標(biāo)尺=20 μm。圖2 胸腺Bcl-2，Bax mRNA原位雜交染色Fig.2 In situ hybridization techniques for Bcl-2 and Bax mRNA in thymus

BCL-2是BCL-2家族蛋白成員中的主要抗凋亡分子[12-14]。本研究結(jié)果顯示，在胸腺胚胎及胚后發(fā)育過(guò)程中BCL-2蛋白表達(dá)于皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞，其陽(yáng)性率在22 d胚齡～17周齡恒定，20～32周齡呈下降趨勢(shì)。比較鴨胸腺淋巴細(xì)胞BCL-2蛋白陽(yáng)性率與其凋亡率[11]的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者在22 d胚齡～17周齡無(wú)明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系，在20～32周齡呈反向關(guān)系，說(shuō)明BCL-2蛋白主要在退化期對(duì)胸腺淋巴細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用。Veis等[5]報(bào)道15.5～16.5 d胚齡小鼠胸腺中有60%～70%的淋巴細(xì)胞表達(dá)BCL-2，而發(fā)育到17.5 d胚齡時(shí)，表達(dá)BCL-2的淋巴細(xì)胞數(shù)降至20%～30%，說(shuō)明在胚胎發(fā)育期，BCL-2蛋白在胸腺中表達(dá)呈現(xiàn)階段性變化；李奎等[10]研究發(fā)現(xiàn)BCL-2蛋白在胚后不同發(fā)育階段固始雞胸腺內(nèi)的表達(dá)沒(méi)有階段性差異，這與本文觀察到BCL-2蛋白在鴨胸腺淋巴細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律不同。本研究中，各組胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2陽(yáng)性率均明顯小于髓質(zhì)，說(shuō)明BCL-2蛋白優(yōu)勢(shì)定位于髓質(zhì)，這與小鼠、人、雞中的研究結(jié)果相似[5，7，10]。

BAX蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12-14]。本研究結(jié)果顯示，BAX蛋白表達(dá)于胸腺小葉皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞，且陽(yáng)性率在22～26 d胚齡及8～17周齡恒定，而在0～8周齡和17～32周齡呈上升趨勢(shì)。比較鴨胸腺淋巴細(xì)胞BAX陽(yáng)性率與其凋亡率[11]的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者的變化趨勢(shì)基本一致，提示BAX在胸腺胚胎及胚后發(fā)育過(guò)程中對(duì)其淋巴細(xì)胞凋亡具有明顯的促進(jìn)作用。李奎等[10]研究顯示，BAX在固始雞胸腺淋巴細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，主要分布于胸腺小葉髓質(zhì)，其次是皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處；BAX蛋白在胸腺不同發(fā)育階段，其表達(dá)量不同，1～8周齡與12～20周齡相比有差異，后者比前者維持較高的表達(dá)量。本研究觀察到天府肉鴨胸腺中BAX在胸腺皮質(zhì)中的表達(dá)量高于髓質(zhì)。由此可見(jiàn)BAX蛋白在天府肉鴨胸腺內(nèi)的表達(dá)部位以及胚后表達(dá)規(guī)律與固始雞均不相同。

BCL-2和BAX是BCL-2家族中功能相反的兩個(gè)重要成員，分別有抑制和促進(jìn)凋亡的作用。Oltvai等[12]認(rèn)為，BCL-2和BAX比值是決定細(xì)胞生死存亡的關(guān)鍵機(jī)制之一，比值升高，表現(xiàn)抗凋亡作用；反之，則促進(jìn)凋亡。本研究結(jié)果顯示，胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BCL-2/BAX值在22～26 d胚齡恒定，0～8周齡下降，8～17周齡恒定，20～32周齡下降，將這一結(jié)果與胸腺淋巴細(xì)胞凋亡率[11]進(jìn)行比較，可見(jiàn)BCL-2/BAX值在22～26 d胚齡以及8～17周齡當(dāng)?shù)蛲雎授呌诤愣〞r(shí)也維持恒定，其余各組則基本與凋亡率呈反向關(guān)系。說(shuō)明總體上胸腺淋巴細(xì)胞凋亡的發(fā)生與否與BCL-2/BAX的比值有關(guān)。前期研究結(jié)果顯示，胸腺淋巴細(xì)胞凋亡率在0～8周齡和20～32周齡呈上升態(tài)勢(shì)[11]。本試驗(yàn)觀察到0～8周齡，BCL-2陽(yáng)性率變化不大，但BAX陽(yáng)性率則逐漸升高，提示在此期間，淋巴細(xì)胞凋亡逐漸活躍，可能主要受BAX的上調(diào)，BCL-2/BAX值的減小實(shí)現(xiàn)的；胚后20～32周齡，BCL-2陽(yáng)性率呈顯著下降趨勢(shì)，而B(niǎo)AX陽(yáng)性率呈明顯上升態(tài)勢(shì)，說(shuō)明在胸腺退化期，淋巴細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)，不僅受BAX的上調(diào)，而且還受BCL-2的下調(diào)，BCL-2/BAX值減小，促進(jìn)了淋巴細(xì)胞的凋亡。

本文結(jié)果表明在胚胎及胚后發(fā)育過(guò)程中胸腺淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA陽(yáng)性率與其蛋白陽(yáng)性率的變化規(guī)律基本一致，且各組胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞Bcl-2 mRNA及其蛋白陽(yáng)性率均明顯小于髓質(zhì)，說(shuō)明二者的組織分布一致，均優(yōu)勢(shì)定位于髓質(zhì)，以上結(jié)果提示該基因在天府肉鴨胸腺中的表達(dá)調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。關(guān)于Bcl-2基因在胸腺中的調(diào)控機(jī)制報(bào)道不一。Chleg-Deschamps等[6]報(bào)道人胸腺組織內(nèi)均有BCL-2蛋白和Bcl-2 mRNA陽(yáng)性反應(yīng)，但二者定位彼此分離，前者主要分布于髓質(zhì)，后者則相對(duì)密集于皮質(zhì)，說(shuō)明人胸腺Bcl-2基因表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。而陳協(xié)群等[7]研究顯示，Bcl-2 mRNA及其蛋白均優(yōu)勢(shì)定位于人胎兒胸腺髓質(zhì)區(qū)，僅少數(shù)BCL-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞和Bcl-2 mRNA弱陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于皮質(zhì)，因而B(niǎo)cl-2基因在人胸腺中的表達(dá)調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。由于Chleg-Deschamps等采用“有意義”或正鏈Bcl-2寡核苷酸探針作為陰性對(duì)照時(shí)，胸腺皮質(zhì)仍出現(xiàn)明確且較強(qiáng)的“陽(yáng)性”雜交信號(hào)[6]，因此陳協(xié)群等[7]對(duì)Chleg-Deschamps等設(shè)計(jì)的BCL-2反義寡核苷酸探針是否具有可靠的特異性及敏感性提出疑問(wèn)。我們的結(jié)果和結(jié)論與陳協(xié)群等相似，而與Chleg-Deschamps等的不同，與Chleg-Deschamps等的不同是否也與陳協(xié)群等提出的疑問(wèn)有關(guān)，尚需進(jìn)一步探討。此外，Yutaka等[15]報(bào)道Bcl-2 mRNA在胚胎和成年雞胸腺中均有表達(dá)，其中在胚胎雞中的表達(dá)較成年雞高；張書(shū)霞等[8]研究顯示，雞胚及成年雞胸腺中均有Bcl-2 mRNA的高效表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，鴨胸腺中均有Bcl-2 mRNA的表達(dá)，其中在胚胎期中的表達(dá)高于胚后20～32周齡，這一結(jié)果與Yutaka等[15]和張書(shū)霞等[8]的報(bào)道具有相似之處。

本試驗(yàn)中，胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴細(xì)胞BaxmRNA陽(yáng)性率與其蛋白陽(yáng)性率的變化規(guī)律基本一致，且各組皮質(zhì)淋巴細(xì)胞BaxmRNA及其蛋白陽(yáng)性率均明顯高于髓質(zhì)，說(shuō)明二者的組織分布一致，均優(yōu)勢(shì)定位于凋亡活躍的皮質(zhì)區(qū)T淋巴細(xì)胞，而髓質(zhì)區(qū)長(zhǎng)命T淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性反應(yīng)相對(duì)較少，據(jù)上述結(jié)果推測(cè)胸腺中Bax基因表達(dá)涉及轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。

綜上所述，在天府肉鴨胸腺發(fā)育過(guò)程中，其淋巴細(xì)胞可表達(dá)BCL-2、BAX蛋白及其Bcl-2和BaxmRNA，它們是免疫細(xì)胞亞型選擇的重要調(diào)節(jié)物，直接調(diào)控胸腺淋巴細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)和控制胸腺的生長(zhǎng)、發(fā)育和退化。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Expression of mRNA and proteins of Bcl-2 and Bax during the development in duck thymus

LIU Chun-yu*， ZHU Pan-pan*， FANG Jing**， JIANG Min， YIN Heng

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

In order to study the expression ofBcl-2 andBaxmRNA and their proteins during the embryonic and post embryonic development of Tianfu duck thymus， 65 Tianfu ducks were divided into 3 groups as follows: 22， 24 and 26 days at embryonic stage， and 0 (neonatal stage)， 3， 5， 8， 14， 17， 20， 26， 29 and 32 weeks after hatching. Immunohistochemisty andinsituhybridization techniques were used in this study. The results showed thatBcl-2 andBaxmRNA and their proteins were distributed in the thymic lymphocytes and epithelial cells. The BCL-2 positive ratios of lymphocytes in the thymic cortex and medulla were not changed from 22 days at embryonic stage to 17 weeks after hatching， but were decreased from 20 to 32 weeks after hatching. The BAX positive ratios of lymphocytes in the thymic cortex and medulla were kept unchanged from 20 to 26 days at embryonic stage and from 8 to 17 weeks after hatching， but were increased from 0 to 8 weeks and from 20 to 32 weeks after hatching. The BCL-2/BAX values of lymphocytes in the thymic cortex and medulla were not changed from 22 to 26 days at embryonic stage and from 8 to 17 weeks after hatching， but were decreased from 0 to 8 weeks and from 20 to 32 weeks after hatching. The change patterns ofBcl-2 mRNA andBaxmRNA positive ratios of lymphocytes in the thymic cortex and medulla were similar to their protein positive ratios， respectively. In each group， the BCL-2 protein，Bcl-2 mRNA positive ratios and BCL-2/BAX value of lymphocytes in the follicle cortex were significantly lower than those in the medulla， while the BAX protein andBaxmRNA positive ratios of lymphocytes in the follicle cortex were significantly higher than those in the medulla， respectively. This study indicated thatBcl-2，Baxgenes and their proteins are important modulators for the lymphocyte apoptosis of Tianfu duck thymus.

duck；thymus；Bcl-2；Bax；immunohistochemisty；insituhybridization

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.03

2015-06-09

教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(0848)

劉春雨(1993—)，女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物解剖與組織胚胎學(xué)，E-mail：liuchunyucyl@163.com ；朱盼盼(1994—)，女，河南南陽(yáng)人，本科生，E-mail：suyitianya123@163.com

**通信作者，方靜，E-mail：fang jing4109@163.com

S834.89；S852

A

1004-1524(2016)01-0015-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):15-21

劉春雨，朱盼盼，方靜，等. 天府肉鴨發(fā)育過(guò)程中胸腺Bcl-2，Bax基因及蛋白的表達(dá)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(1):15-21.

*劉春雨，朱盼盼對(duì)本論文具有同等貢獻(xiàn)，為共同第一作者。