痹痛合劑對OA大鼠關節軟骨形態學變化及軟骨細胞Bcl-2基因表達的影響*

李素明，杭柏亞

南京市中醫院，江蘇南京210001

痹痛合劑對OA大鼠關節軟骨形態學變化及軟骨細胞Bcl-2基因表達的影響*

李素明，杭柏亞△

南京市中醫院，江蘇南京210001

目的：觀察痹痛合劑對骨性關節炎（OA）關節軟骨細胞形態學變化的影響并探討其可能的作用機制。方法：將SD雄性大鼠64只隨機分為假手術組（A組）、模型組（B組）、硫酸氨基葡萄糖組（C組）和痹痛合劑組（D組），A組行假手術，B、C、D組采用Hulth法復制OA模型，A組常規飼養，其余各組術后分別加服生理鹽水，硫酸氨基葡萄糖溶液和痹痛合劑。術后第8周處死，分別大體觀察、光鏡400×和電鏡下觀察關節軟骨細胞形態學變化，原位雜交法檢測關節軟骨細胞中Bc1-2 mRNA表達。結果：B組關節軟骨呈典型OA形態學改變，關節軟骨細胞中Bc1-2 m RNA表達減弱；C、D組關節軟骨輕度退變，形態學方面與A組接近，關節軟骨細胞中Bc1-2 m RNA表達顯著增強，與B組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。結論：痹痛合劑與硫酸氨基葡萄糖能延緩OA大鼠關節軟骨的退變，其可能的作用機制是通過提高關節軟骨細胞中Bc1-2基因的表達，抑制關節軟骨細胞的凋亡。

骨性關節炎；軟骨細胞；細胞形態學；B細胞淋巴瘤/白血病-2；痹痛合劑

骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常見病、多發病，已成為影響老年人運動及致殘的重要原因之一。其主要的病理特征為關節軟骨形態發生變化（退變）。關節疼痛是其主要的臨床表現。因此，既能止痛又能延緩關節軟骨退變的藥物是較為理想的選擇。痹痛合劑是院內制劑，臨床應用治療骨性關節炎幾十年，能有效緩解膝骨性關節炎患者的疼痛［1］。但能否有效緩解或阻止病情發展有待進一步研究。本實驗通過建立OA大鼠模型，觀察痹痛合劑對骨性關節炎軟骨細胞形態學變化的影響并探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗設計隨機對照動物實驗。

1.2實驗動物SD雄性大鼠64只，體質量200～220 g，2月齡，購于常州卡文斯實驗動物有限公司；南京中醫藥大學動物試驗中心鼠類實驗室提供SPF級醫學實驗動物環境設施，動物許可證號：SYXK（蘇）2012-0042。實驗過程中對動物的處置符合醫學倫理學標準。

1.3試劑及儀器痹痛合劑（南京市中醫院院內制劑，蘇藥制字Z04000864）；硫酸氨基葡萄糖膠囊（浙江海正藥業股份有限公司生產，國藥準字H20041316）；磷酸鹽緩沖液（PBS）；Bc1-2預雜交液和雜交液，Bc1-2原位雜交檢測試劑盒及探針（南京建成生物工程公司）；流式細胞儀（貝克曼庫特FC500）；全自動化學發光凝膠成像分析系統（Chemi Doc XRS+）；熒光顯微鏡（奧林巴斯BX43）；研究型倒置熒光顯微鏡（徠卡DMI3000B）；恒溫箱（Thermo HRRAce11 150i）；掃描式電鏡（日本JSM-6010LA）。

1.4實驗方法

1.4.1分組將64只大鼠按隨機數字表法分為假手術組（A組）、模型組（B組）、硫酸氨基葡萄糖組（C組）和痹痛合劑組（D組），每組16只。

1.4.2動物模型的建立A組皮膚切開后，隨即縫合，不作其他處理；B、C、D組用硫噴妥鈉從耳靜脈麻醉，固定，常規備皮消毒，沿髕骨韌帶內側緣切口，切斷雙后肢內側副韌帶及膝前內側筋膜擴張部，并在斷端處修剪去除約2 mm，造成雙后肢膝外翻畸形，逐層縫合傷口，無菌敷料及繃帶包扎固定，術后連續3天肌肉注射青霉素2萬U預防感染。術后1周將造模大鼠置于拖箱內，每天趕其行走30分鐘，16周后X線檢查，關節邊緣變尖銳，并逐漸發展成為骨贅者證實造模成功。

1.4.3給藥A組予正常水和飼料喂養，B組生理鹽水灌胃（3次/d，3 mL/次），C組硫酸氨基葡萄糖溶液3 mL（含藥0.037 68 g）灌胃，3次/d，D組痹痛合劑水溶液3mL（含藥1.25 mL）灌胃，3次/d。灌服藥物劑量按人與大鼠體表面積換算［2］。各組術后第2天開始給藥，連續8周。

1.4.4關節軟骨形態學大體觀察每組隨機抽取8只大鼠進行大體觀察，停止給藥后處死大鼠，立即將大鼠于仰臥位固定，取材部位消毒，切開膝關節囊，大體觀察后股骨髁關節面病理改變按照以下標準評分：1）關節面光整、色澤如常為O分；2）關節面粗糙不平，有小的裂隙且色澤灰暗為1分；3）關節面糜爛，缺損深達軟骨表中層為2分；4）關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層為3分；5）軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露為4分。

1.4.5關節軟骨細胞的形態學觀察同“1.4.4”項方法，取材部位消毒，用銳利刀片切取股骨內髁軟骨，做成2 mm×1 mm全層軟骨標本，2.5%戊二醛溶液固定，HE染色，光鏡400×和電鏡下觀察。

1.4.6原位雜交法檢測關節軟骨細胞中bc1-2 m RN A表達同“1.4.4”項，剩下的股骨內髁軟骨連同脛骨平臺關節面一并切下，立即用PBS洗凈，用新鮮配制的4%多聚甲醛0.1m（含有1/1000DEPC）固定過夜。10%EDTA（含1/1000DEPC）脫鈣10天，石蠟包埋，切片。原位雜交：切片脫蠟至水；3%H2O2室溫處理10分鐘以滅活內源性過氧化物酶；3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37℃消化5分鐘；滴加20 μL預雜交液至bc1-2原位雜交檢測試劑盒中。放入恒溫箱37℃20分鐘；滴加20 μL雜交液，恒溫箱37℃雜交過夜（12小時）；滴加封閉液37℃30分鐘；滴加生物素過氧化酶37℃20分鐘；滴加DAB，顯色10分鐘。自來水沖洗10分鐘；蘇木素復染1秒，充分水洗；乙醇脫水，二甲苯透明封片。標本切片置于光鏡下（×400），將圖像輸入圖像處理系統，每張切片選擇10個不同視野，對軟骨細胞中bc1-2mRNA陽性表達用陽性面積和灰度值進行量化（灰度值系統設定白色最大灰度為255，黑色最小灰度為0?；叶戎翟叫。f明其陽性反應程度越高，表達越強，反之則表達越弱）。

1.4.7陽性結果判斷以細胞質及細胞核內出現棕黃色著色者為陽性，未加探針者為陰性對照。

1.5主要觀察指標觀察各組大鼠關節軟骨細胞形態學變化及關節軟骨細胞bc1-2基因表達水平的變化。

1.6統計學方法數據采用SPSS 21.0統計學軟件完成，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較用SNK-q檢驗，等級資料采用Ridit分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1大體觀察A組脛骨平臺及股骨外側髁關節面光滑平整清楚，有光澤，關節軟骨完好；B組脛骨平臺及股骨外側髁關節面不平整模糊不清，關節軟骨層無光澤、顏色灰暗，關節軟骨損壞嚴重，關節邊緣及關節內均可見有骨贅形成，外髁負重區見軟骨剝脫；C、D組關節面大體形態基本相同，關節面清楚，光滑平整，有光澤，關節軟骨基本完好，外髁負重區軟骨基本完好，關節邊緣無骨贅形成，見表1。

2.2光鏡下H E染色大鼠關節軟骨細胞形態學表現A組：軟骨表面光滑，軟骨細胞排列整齊，且四層結構清晰可辨，潮線完整，軟骨基質染色為粉紅色，著色均勻；B組：關節軟骨破壞最為嚴重，軟骨表面粗糙糜爛不整，形成缺損區；C組：細胞四層結構基本清晰，潮線基本完整，有少許軟骨細胞存在輕度變性；D組：細胞四層結構基本清晰，潮線基本完整，關節軟骨有少許炎性細胞侵潤，關節軟骨細胞有輕度變性，見圖1。

表1　各組大鼠股骨髁關節面病理改變評分分布

圖1　光鏡下各組大鼠關節軟骨細胞形態學表現（H E 400×）

2.3電鏡下觀察軟骨細胞的形態學變化A組：膝關節內髁部軟骨細胞分布均勻，細胞壁連續，細胞核飽滿，線粒體及內質網排列整齊無擴張腫脹，染色體分布均勻，膠質纖維連續性好，排列密集而整齊，有完整的結構。B組：膝關節內髁部軟骨細胞分布不均勻，軟骨細胞增多，主要表現為細胞核形態不規則且細胞壁破裂不整齊，細胞核縮小，染色體分布不均勻，胞質內可見線粒體腫脹、粗面內質網擴張，胞漿內微絲堆積，膠質纖維斷裂，排列紊亂，見大量軟骨細胞凋亡。C組：膝關節內髁部軟骨細胞分布較均勻，細胞壁連續，細胞核飽滿，線粒體及內質網排列整齊，染色體分布均勻，膠質纖維連續排列密集整齊，偶見部分軟骨細胞凋亡。D組：膝關節內髁軟骨細胞分布均勻，細胞壁連續，細胞核飽滿，線粒體及內質網排列整齊，染色體分布均勻，膠質纖維連續排列密集整齊，有完整的縱橫向結構，有少量軟骨細胞凋亡，見圖2。

圖2　電鏡下各組大鼠關節軟骨細胞形態學變化

2.4原位雜交法檢測關節軟骨細胞中Bc1-2 m RN A表達4組均檢測到bc1-2 mRNA的表達，其中A組表達較強，B組表達明顯減弱；D、C組干預后關節軟骨細胞中Bc1-2 mRNA陽性細胞的表達明顯升高，接近正常組（P＞0.05），與B組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。C組與D組無明顯差異（P＞0.05），見圖3，表2。

圖3　光鏡下各組大鼠關節軟骨細胞Bc1-2 m RN A表達（400×）

表2　原位雜交法檢測關節軟骨細胞中bc1-2 m RN A陽性表達灰度值

3　討論

骨性關節炎又稱退行性骨關節炎，關節軟骨細胞變性、結構破壞、細胞凋亡甚至軟骨缺損等形態學的變化是其基本的病理改變［3-6］。由于沒有神經、血管和淋巴的分布，軟骨雖然有一定的自我修復能力，但是大于5 mm以上的局部軟骨損傷很難自我修復，關節炎類軟骨疾病一直不能得到很好的治療［7-8］。目前臨床上治療骨性關節炎的藥物主要有兩大類：1）消炎止痛類，如非甾體抗炎藥、選擇性COX-2抑制劑等，能有效緩解疼痛，但長期服用可使關節軟骨蛋白多糖和透明質酸的合成減少，加重骨性關節炎的病理損害［9］。2）緩解病情類，如氨基葡萄糖，它是一種糖胺聚糖，以乙酰化的形式存在于關節軟骨，椎間盤和滑液中，是一種天然的蛋白多糖［10］，目前廣泛應用于臨床治療骨性關節炎［11-12］。其能特異性地作用于關節軟骨，維護軟骨基質的形態結構，還能抑制前列腺素的合成，保護各種有害物質對軟骨細胞的破壞，改善關節活動，緩解疼痛，延緩骨性關節炎退變的過程［13-14］。但臨床應用發現其止痛作用有限。因此尋找一種既能有效止痛，又能延緩疾病發展的藥物具有重大意義。中醫藥注重整體觀，采用辨證論治的方法從中醫藥寶庫中挖掘，有望實現該目的。由于OA疾病涉及較多蛋白質，通過蛋白質組學技術發現并鑒定的骨性關節炎相關蛋白已有100多個［15-16］。中藥多靶點調節（從疾病整體水平上的調節）相對于西醫單一化合物單一靶點的治療模式有較大的優勢［17］。痹痛合劑在我院用于治療骨性關節炎已有幾十年，臨床研究表明能有效緩解骨性關節炎患者疼痛等臨床癥狀，改善關節功能，總有效率高于硫酸氨基葡萄糖［2］；實驗研究表明，痹痛合劑能夠抑制關節液中細胞因子IL-1、TNF-α表達［18］，推測痹痛合劑能夠保護關節軟骨，延緩骨性關節炎的發展，但缺乏直接的證據。本研究通過對OA大鼠關節軟骨形態學研究發現，OA大鼠關節軟骨發生明顯退變，模型組呈現典型骨性關節炎關節軟骨形態學變化，病理改變評分與正常組比較明顯增高（P＜0.01）。給予痹痛合劑和硫酸氨基葡萄糖干預后無論是大體觀察還是鏡下觀察，關節軟骨的退變均有明顯改善，與模型組比較關節軟骨病理改變評分下降明顯（P＜0.01），表明痹痛合劑能夠有效保護軟骨，延緩關節軟骨的退變。

中醫認為，OA發病是肝腎虧虛為本，合風寒濕邪入侵所形成的痹痿兼癥，其中有著復雜的機理和各種因素相互作用，以肝腎虧虛為基礎，此外還有脾虛、血瘀、痰濕幾個重要環節［19-22］。痹痛合劑正是基于以上理論，經過幾代人的努力，研制而成。方中懷牛膝、續斷、狗脊、香加皮為君藥，以補肝腎、強筋骨，其中懷牛膝為引經藥；獨活、防風祛下焦與筋骨間風寒濕邪，威靈仙、徐長卿舒筋通絡止痹痛；雞血藤、桂枝、地鱉蟲活血通絡，通達四肢關節；川烏（制）、草烏（制）散寒止痛；白術、炒薏苡仁、陳皮、茯苓行氣化痰，健脾祛濕；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過，諸藥合用共奏補肝腎、祛風濕、化瘀痰之功。綜觀全方，扶正祛邪、標本兼顧，可使肝腎強、筋骨壯，風濕除而痹痛愈。但其作用機制目前尚不清楚。研究認為細胞凋亡在骨性關節炎的病理過程中起著重要作用［23］。Bc1-2基因是一種原位癌基因，參與細胞凋亡的調控，它通過抑制線粒體釋放cytc來抑制細胞的凋亡［24］。學者研究發現［25］，老年個體Bc1-2表達較正常人低；小鼠在剔除Bc1-2基因后表現出典型中醫腎虛癥狀：發育不良、形體小、壽命縮短、毛發色澤變淺、軟骨發育異常、多囊腎和生殖能力下降等［26-27］。因此，有學者認為，Bc1-2基因家族在體內作用與中醫腎的功能非常接近，并提出［28］“Bc1-2家族可能是中醫腎本質相關基因”的假說。因此，補腎療法有可能提高Bc1-2基因的表達。本研究結果表明，正常組關節軟骨Bc1-2基因表達最強，模型組表達減弱（P＜0.01），痹痛合劑和硫酸氨基葡萄糖干預后其表達增強（與模型組比較P＜0.01），因而，痹痛和劑和硫酸氨基葡萄糖均能提高OA大鼠關節軟骨細胞中Bc1-2基因的表達。

綜上所述，痹痛合劑能有效延緩OA大鼠關節軟骨細胞的退變，延緩OA病情的發展，其可能的作用機制是通過提高關節軟骨細胞中Bc1-2基因的表達，抑制關節軟骨細胞的凋亡而起作用。其具體的作用靶點有待進一步深入研究。

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The Influence of BiTong Mixture on the Expression of Cartilage Cells Bcl-2 and Articular Cartilage Morphological Changes of OA Rats

LI Suming，HANG Baiya△
Nanjing Municipality TCM Hospital，Nanjing 210001，China

Objective:To observe the influence of BiTong mixture on articular cartilage morphology of osteoarthritis（OA）rats，and explore its possible mechanism.Methods:Sixty-four SD male rats were randomized into sham operation group（A），the model group（B），glucosamine sulfate group（C）and BiTong mixture group（D），the rats in group A were performed with sham operation，the rats in the group B，C and D were replicated by Hulth method，the rats in the group A accepted conventional feeding，the rats in other groups took physiological saline，glucosamine sulfate solution and BiTong mixture after the operation respectively.The rats were sacrificed at the eighth week after the operation，cellular morphology of articular cartilage was inspected by gross observation，under light microscope and electron microscope，and the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells were detected by in situ hybridization（ISH）.Results:Articular cartilage showed typical OA morphological changes in the group B，the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells reduced obviously；articular cartilage degenerated slightly in the groups C and D，morphological changes were similar to the rats in the group A，the expressions of Bcl-2 mR -NA in articular cartilage cells enhanced significantly，it had significant difference compared with the group B（P＜0.01）. Conclusion:BiTong mixture and glucosamine sulfate solution could delay articular cartilage degeneration of OA rats，and the mechanism might be inhibiting articular cartilage cellular apoptosis by raising the expressions of Bcl-2 mRNA in articular cartilage cells.

osteoarthritis；cartilage cells；cellular morphology；B cell lymphoma/leukemia-2；BiTong mixture

R285.5

A

1004-6852（2016）05-0018-05

2015-05-10

南京市醫學科技發展項目（編號YKK 12151）。

李素明（1975—），男，碩士學位，副主任醫師，副教授。研究方向：骨與關節疾病的中西醫結合治療。

杭柏亞（1965—），男，碩士研究生導師，主任醫師。研究方向：骨關節疾病的中西醫結合治療。