推拿對坐骨神經損傷大鼠層黏連蛋白表達的影響*

張林峰，于天源，潘璠，魯夢倩，冼思彤，崔旻珍，姚斌彬，郭鑫，賈文端，陶艷紅，馬馳

北京中醫藥大學，北京100029

推拿對坐骨神經損傷大鼠層黏連蛋白表達的影響*

張林峰，于天源△，潘璠，魯夢倩，冼思彤，崔旻珍，姚斌彬，郭鑫，賈文端，陶艷紅，馬馳

北京中醫藥大學，北京100029

目的：探討推拿對坐骨神經損傷（SN I）大鼠運動功能及脊髓腹角、損傷點處層黏連蛋白（LN）表達的影響。方法：將SD大鼠48只隨機分為正常組、假手術組、模型組、模型對照組、推拿組，造模采用坐骨神經損傷模型，以按摩推拿手法模擬儀進行手法干預，觀察各組大鼠斜板實驗評分及L3～5節段脊髓和患側坐骨神經處LN的表達情況。結果：造模7天后，模型組大鼠的斜板實驗評分與同期正常組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；模型組LN在脊髓腹角和坐骨神經處的表達與同期正常組相比升高（P＜0.05）；LN在正常組、模型組中脊髓腹角的表達量較坐骨神經中的表達明顯增高（P＜0.01）。在推拿治療20次后，模型組、模型對照組、推拿組斜板實驗評分與同期正常組相比有差異（P＜0.05），推拿組斜板實驗評分與同期模型組相比升高（P＜0.05）；同時，模型組、模型對照組、推拿組LN在脊髓腹角和坐骨神經處的表達均高于同期正常組（P＜0.01），推拿組LN在脊髓腹角和坐骨神經損傷處的表達與同期模型組比較明顯升高（P＜0.01）；LN在正常組、推拿組中脊髓腹角的表達量明顯較坐骨神經中的表達高（P＜0.01）。結論：推拿可以上調周圍神經損傷大鼠LN在脊髓腹角和坐骨神經處的表達，加快損傷神經的修復，改善SN I大鼠的運動功能。

坐骨神經損傷；層黏連蛋白；推拿治療；機理研究

周圍神經損傷是臨床常見病，嚴重影響患者的生活質量。當神經損傷后，遠端的雪旺細胞（SC）很快增殖，形成雪旺氏細胞索（Bungner帶），再生軸突沿著SC細胞索生長，進而促進細胞再生［1-2］；同時周圍神經損傷后層黏連蛋白（Laminin，LN）分泌水平增高，可促進損傷神經修復［3］，進一步研究LN發現LN不僅能夠引導神經趨向性生長，促進軸突生長成熟、引導神經方向性生長，還能維持正常的神經再生微環境、增強細胞間黏附，促進損傷神經的修復［4］。本研究采用SNI大鼠模型模擬臨床周圍神經損傷癥狀，以推拿作為干預手段，通過行為學和免疫組化方法檢測脊髓腹角、坐骨神經損傷點處LN的變化，研究推拿起效與LN表達量間的關系，探討推拿治療坐骨神經損傷的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級SD大鼠48只，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（京）2012-0001，體質量（180±10）g，雄性（因雌激素能促進周圍神經損傷修復）［5］。

1.2動物分組利用隨機數字表制定隨機分組方案，48只大鼠進行隨機分組，分出正常組12只，假手術組12只，模型組24只，第一次取材后將模型組剩余動物再次隨機分為模型組、模型對照組、推拿組各6只。

1.3儀器與試劑

1.3.1實驗儀器按摩推拿手法模擬儀（中國人民共和國發明專利號：200710187403.1）；RY-32型熱源自動測試儀；SKP-02.600型電熱恒溫培養箱；LS-100型病理石蠟包埋機（沈陽市龍首電子儀器有限公司）；石蠟切片機（北京弘泰嘉業科技發展有限公司Finesse 325）；顯微鏡（麥克奧迪BA400）等。

1.3.2試劑10%水合氯醛、碘伏消毒液、0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛溶液、0.1 mo1/L磷酸緩沖液、二甲苯、石蠟、無水乙醇、10%山羊血清、兔抗LN抗體（Abcam，ab65986）、非免疫山羊血清（編號：NIS-0081），生物素標記的山羊抗兔（編號：IB-0061）。

1.4實驗方法

1.4.1模型制備坐骨神經夾持損傷模型制備：造模前1天在手術區即患側（右側）下肢臀股交界處剪毛，脫毛；水合氯醛麻醉；經手術區常規消毒；于患側臀股交界處切開皮膚；止血和鈍性分離后；暴露梨狀肌下緣及坐骨神經；用10號持針鉗，夾持梨狀肌下緣5 mm處的坐骨神經，滿扣（經過測量壓力為5 kg），時間為5秒，造成長約2 mm的損傷點；逐層縫合。假手術組只暴露坐骨神經即可，然后逐層消毒、縫合。

1.4.2干預方法于造模后第7天開始干預。用“推拿手法模擬儀”依次刺激推拿組大鼠手術側殷門、承山、陽陵泉3穴；施行點法、撥法、揉法3個手法；刺激力量為4 N。每法每穴1分鐘；每只總計9分鐘。正常組、假手術組、模型組不做特殊干預；模型對照組大鼠每天每只束縛9分鐘。1次/d，每治療10次休息1天，共治療20次。

1.5檢測指標分別于造模后7天從正常組、假手術組、模型組各取6只大鼠，干預20次后從正常組、假手術組、模型組、模型對照組、推拿治療組各取6只大鼠，采用盲法進行行為學和免疫組化檢測。

1.6行為學檢測方法

1.6.1斜板實驗按Riv1in法制傾斜板，在室溫安靜狀態下，將大鼠頭向前，身體縱軸與斜板縱軸平行放置，角度從小到大漸增，直至大鼠停留5秒而不跌落的最大角度做斜板實驗行為學評分，每只大鼠重復測量3次，取平均值。

1.6.2免疫組化檢測4%多聚甲醛灌注固定后于脊髓和坐骨神經取材，石蠟包埋，切片脫蠟，3% H2O2室溫孵育12分鐘，微波抗原修復10分鐘，10%山羊血清封閉室溫孵育15分鐘，再加（1∶100）兔抗LN抗體4℃過夜，恢復室溫1小時，加山羊抗兔IgG抗體37℃孵育20分鐘，滴加SABC 37℃孵育20分鐘，DAB顯色劑顯色，流水沖洗，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封固。每組染色過程中均設定并加一抗的空白對照染色。并用Image-Pro P1us 6.0圖像軟件計算光密度值。

1.7統計學方法數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，組間比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，不滿足方差分析條件時采用秩和檢驗（Kruska1-Wa11is法等），P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1行為學造模7天后，模型組大鼠的斜板實驗評分與同期正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；推拿治療20次之后，模型組、模型對照組、推拿組斜板實驗評分與同期正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；推拿組斜板實驗評分與同期模型組相比升高（P＜0.05），見表1。

表1　斜板實驗結果（±s）

表1　斜板實驗結果（±s）

注：與同期正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與同期模型組比較，△表示P＜0.05。

組別只數斜板實驗/度造模后7天治療20次正常組646.75±3.7246.71±1.81假手術組642.42±1.7245.91±2.63模型組636.50±1.64**39.50±0.71*模型對照組6-38.75±1.29*推拿組6-43.25±1.64*△

2.2免疫組化脊髓腹角、坐骨神經處LN免疫組化結果表達：經Image-ProP1us 6.0平均光密度檢測，造模后7天，模型組LN在脊髓腹角和坐骨神經處的表達與同期正常組相比升高（P＜0.05）；正常組、模型組LN在脊髓腹角的表達明顯較坐骨神經中的表達量高（P＜0.01）。推拿治療20次后，模型組、模型對照組、推拿組LN在脊髓腹角和坐骨神經處的表達均高于同期正常組（P＜0.01），推拿組LN在脊髓腹角和坐骨神經損傷處的表達與同期模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；正常組、推拿組LN在脊髓腹角的表達較坐骨神經中的表達量高（P＜0.01），見表2—4、圖1—4。

表2　各組大鼠不同時期脊髓腹角處LN平均光密度值（±s）

表2　各組大鼠不同時期脊髓腹角處LN平均光密度值（±s）

注：與同期正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與同期模型組比較，△△表示P＜0.01。

組別只數造模后7天治療20次正常組60.024±0.0030.025±0.003假手術組60.023±0.0020.019±0.005模型組60.040±0.005*0.051±0.002**模型對照組6-0.050±0.022**推拿組6-0.100±0.008**△△

表3　各組大鼠不同時期坐骨神經處LN平均光密度值（±s）

表3　各組大鼠不同時期坐骨神經處LN平均光密度值（±s）

注：與同期正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與同期模型組比較，△△表示P＜0.01。

組別只數造模后7天治療20次正常組60.0028±0.00080.0033±0.0013假手術組60.0032±0.00090.0032±0.0010模型組60.0060±0.0006*0.0069±0.0016**模型對照組6-0.0075±0.0006**推拿組6-0.0110±0.0008**△△

表4　不同時期脊髓腹角、坐骨神經處LN平均光密度值（±s）

表4　不同時期脊髓腹角、坐骨神經處LN平均光密度值（±s）

注：**表示脊髓腹角與坐骨神經組內比較P＜0.01。

組別只數造模后7天治療20次坐骨神經脊髓腹角坐骨神經脊髓腹角正常組60.0028±0.00080.024±0.003**0.0033±0.00130.025±0.003**模型組60.0060±0.00060.040±0.005**--推拿組6--0.0110±0.00080.100±0.008**

圖1　各組大鼠造模后7天LN在脊髓腹角處免疫組化結果（×400）

圖2　各組大鼠推拿治療20次時LN在脊髓腹角處免疫組化結果（×400）

圖3　各組大鼠造模后7天LN在坐骨神經處免疫組化結果（×400）

圖4　各組大鼠推拿治療20次時LN在坐骨神經處免疫組化結果（×400）

3　討論

推拿對坐骨神經損傷有顯著療效，推拿能夠促進坐骨神經損傷大鼠行為學的改善和形態學的修復［6］，能促進周圍神經損傷后修復再生，其機理可概括為以下3點：1）調控內源性營養因子的表達：如促進NGF［7］、GAP-43［8］、bFGF［9］、降低P75NTR受體的釋放［7］；2）改善損傷局部微循環：促進軸漿運輸功能的恢復［10］以及細胞骨架蛋白［11］，降低損傷組織MBP含量的表達［12］，促進損傷軸突的修復；3）信息調控，整體治療：通過中醫推拿的整體治療作用，加強對神經遞質分泌、釋放、作用等的調控，促進損傷神經修復再生。

近年關于LN的研究越來越廣泛，其在神經修復方面的作用也越來越受到人們的重視，LN是一種廣泛存在于多種動物及人類細胞基底膜基質中的蛋白，其發揮神經損傷修復的機理可以概括為：1）促進SC分裂、增殖、遷移和髓鞘化，促進有髓神經纖維的再生［13］。SC細胞不僅能夠分泌基底膜成分，形成基底膜，還能促進神經纖維的再生和髓鞘化的形成，在損傷神經的修復過程中起重要作用。陳雪等［14］在施萬細胞的層黏連蛋白表達變化及兩者關系的初步研究中發現LN作為基質中一種多功能的蛋白質分子，能選擇性地結合到SC表面，促進SC合成細胞基底膜成分，并在其黏附過程中發揮作用；2）促進軸突的再生［15］。LN可增加細胞間黏附作用，保持生長錐前進運動的穩定性，防止其回縮，進而促進軸突的再生，因而LN是調控軸突生長成熟不可缺少的物質之一［16］；3）具有再生軸突導向作用，引導神經再生方向［17］。LN分布在基底膜的細胞側，能夠調控軸突的生長行為，其引導作用是神經軸突完全修復的關鍵因素之一。王國英等［17］在研究SC基底膜成分LN在神經再生領域的實驗時發現對照組約92%的新生軸突選擇基底膜管內側生長，而實驗組（LN失活組）只有48%的軸突長在基底膜管外的結締組織中，它們并不選擇基底膜管作為再生通路，表明LN可為軸突提供方向性生長信息物質；4）引導再生軸突生長錐的方向［18］：神經損傷后，細胞的黏附和遷移能力是傷口愈合的重要環節，周圍神經損傷后，SC與細胞基底膜的黏附及細胞移行可使生長錐保持穩定性，促進軸突沿著基質生長，并引導神經纖維定向生長，最終利于神經再生［19-20］。李軍［21］在使用外源性LN研究SC與軸突在周圍神經再生微環境間的關系時發現，再生神經纖維錯向生長的比例明顯少于其他組，說明LN能夠引導再生軸突生長錐的方向，發揮積極正向引導作用；5）為周圍神經再生提供了良好的微環境［22］。LN可促進SC細胞的增殖及各種營養因子的分泌，改善神經自身的微環境。

本實驗中推拿手法直接作用于殷門、承山和陽陵泉3穴，采用中醫循經取穴原則，殷門在大腿后，位于足太陽膀胱經承扶與委中連線上，解剖學上屬坐骨神經干位置；陽陵泉是足少陽膽經的穴位，位于坐骨神經的分支腓總神經上；承山屬足太陽膀胱經穴位，位于坐骨神經的分支脛神經上；從神經支配區域分析：此3穴分別是坐骨神經、脛神經和腓總神經所支配的肌肉區--股二頭肌、腓腸肌和脛前肌。正常的運動功能主要在神經（傳導通路）和肌肉（效應器）的相互協調下完成。選穴體現了中、西醫理論相結合的特點，實驗中通過行為學斜板實驗評分，以及脊髓腹角免疫組化檢測，從運動功能方面評價大鼠恢復情況：發現推拿組大鼠的斜板實驗評分優于模型組和模型對照組（P＜0.05），而本實驗中所選取的斜板實驗評分和脊髓腹角LN免疫組化都是評價其運動功能損傷的指標，推拿干預不僅能上調脊髓腹角LN的表達量，還能上調外周神經損傷處LN表達量，改善中樞與外周運動通路進而發揮其促進損傷神經運動功能修復的作用，這可能是推拿促進SNI大鼠運動功能修復的機理之一。

李軍［21］在研究周圍神經損傷后雪旺細胞與軸突再生關系時發現，外源性LN組的再生有髓神經纖維計數、橫截面積、等效直徑和髓鞘厚度均優于絲裂霉素組和生理鹽水組及其組合，說明增加外源性LN，提高組織內LN含量能夠促進損傷神經的修復；楚燕飛等［22］在研究大鼠坐骨神經損傷后雪旺細胞、LN動態變化時發現LN的表達依賴于SC的增殖，所以推測LN表達量的增加可能是因為推拿促進SC細胞增值，SC促進LN表達量的增加共同介導了神經損傷的修復過程。本研究推拿組LN在脊髓腹角和坐骨神經損傷處的表達與同期模型組比較有差異（P＜0.01），說明推拿能夠促進坐骨神經損傷大鼠LN的表達，促進損傷神經的修復，其可能機理為：坐骨神經損傷后其組織雖能分泌少量的LN，但在推拿干預后損傷組織LN的表達量明顯增加；同時本研究還發現造模7天后LN在正常組、模型組及治療20次后LN在正常組、推拿組中脊髓腹角的表達量均較坐骨神經中高（P＜0.01）；即坐骨神經損傷的情況下LN在脊髓腹角處的高含量以及推拿干預后LN在脊髓腹角處的高表達，間接反映LN發揮主導作用的部位在中樞，及推拿干預可促進中樞分泌更多的LN，推測LN治療作用的發揮可能是由中樞介導和調控外周一起完成，并共同發揮其促進損傷神經功能修復的作用。LN在損傷大鼠組織的表達量增加，不僅能發揮促進SC分裂、增殖、遷移和髓鞘化作用和髓神經纖維的再生，還能發揮其軸突生長導向作用，促進軸突的生長，給損傷神經提供良好的再生微環境，推斷推拿干預下LN在中樞與外周的高表達，進而改善脊髓至外周通路的功能可能是其修復損傷坐骨神經的機理之一。但關于LN在中樞與外周通路如何具體發揮效應還需要進一步的探索。

本研究以推拿作為干預手段，通過行為學和免疫組化方法檢測脊髓腹角、坐骨神經損傷點處LN表達量的變化，探究推拿起效與LN間的關系，結果表明推拿能夠改善SNI大鼠的運動功能，上調脊髓腹角和坐骨神經處LN的表達量，其中脊髓腹角處LN的表達量明顯高于坐骨神經處，表明中樞調控外周在損傷修復中發揮主要作用，可改善中樞外周通路的功能，在促進損傷神經修復的過程中扮演重要角色。

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The Effects of Massage on the Expression of Laminin of the Rats with Sciatic Nerve Injury

ZHANG Linfeng，YU Tianyuan△，PAN Fan，LU Mengqian，XIAN Sitong，CUI Minzhen，YAO Binbin，GUO Xin，JIA Wenduan，TAO Yanhong，MA Chi
Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective:To explore the influence of massage on the expressions of laminin（LN）in the damage point and cornu ventrale medullae spinalis，motor function of the rats with sciatic nerve injury（SCI）.Methods: Forty-eight rats were randomized into the normal group，sham operation group，the model group，model control group and massage group，the rat model with SNI was prepared and intervened with massage manipulation simulator，LN expressions of sciatic nerve in the affected limb and L3～5spinal cords，and the scores of inclined plate test were observed.Results:After the models were prepared in seven days，there was significant difference when the model group was compared with the normal group at the same period in the scores of inclined plate test（P＜0.01）；LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve in the model group raised compared with the normal group at the same period（P＜0.05）；LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis in the normal group and the model group improved notably compared with LN expressions in sciatic nerve obviously（P＜0.01）.After massage for 20 times，there was the difference existed in the comparison of the scores of inclined plate test when the model group，model control group，massage group were compared with the normal group at the same period（P＜0.05），the scores of inclined plate test raised in the massage group compared with the model group（P＜0.05）；at the same time，the model group，model control group and the massage group were higher than the normal group in LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve（P＜0.01），LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve in the massage group raised obviously compared with the model group at the same period（P＜0.01）；LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis were higher than LN expressions in sciatic nerve in the normal group and the massage group significantly（P＜0.01）.Conclusion:Massage could up-regulate LN expressions in cornu ventrale medullae spinalis and sciatic nerve of the rats with peripheral nerve injury，speed up the recovery of damaged nerve and improve the motor function of SNI rats.

scatic nerve injury；laminin；massage；mechanism study

R244.1

A

1004-6852（2016）05-0012-06

2015-06-24

國家自然科學基金資助項目（編號81373759）；博士點基金資助項目（編號20130013110016）；北京市自然基金資助項目（編號7142097）。

張林峰（1990—），男，在讀碩士研究生。研究方向：針灸推拿治療周圍神經損傷的機理研究。

于天源（1965—），男，博士研究生導師，博士學位，教授，主任醫師。研究方向：針灸推拿治療周圍神經損傷的機理研究。