應(yīng)用微波提取法與RT-PCR技術(shù)進(jìn)行肉制品鑒別

陳筱婷

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640；2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（福州），福建福州350000）

應(yīng)用微波提取法與RT-PCR技術(shù)進(jìn)行肉制品鑒別

陳筱婷1，2

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640；2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（福州），福建福州350000）

為更好地利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)鑒別肉制品的真實(shí)屬性，創(chuàng)新性地采用微波提取法對(duì)樣品均質(zhì)液進(jìn)行DNA提取，并且根據(jù)不同物種動(dòng)物的基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物與探針，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果確定肉制品所含物種成分。在30份牛肉制品中，檢測(cè)出有7份樣品含有豬、雞或鴨源性成分，檢出率約為23.3%；在20份羊肉制品中，檢測(cè)出有5份樣品含有豬、雞或鴨源性成分，檢出率為25.0%。微波提取DNA的方法優(yōu)化了DNA提取流程，使不同類型肉制品中提取DNA可在短時(shí)間內(nèi)完成，極大地提高了檢測(cè)效率。開(kāi)發(fā)的樣品前處理方法、DNA提取方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于肉制品及其相關(guān)產(chǎn)品真實(shí)屬性的鑒別，具有良好的社會(huì)效益與經(jīng)濟(jì)效益。

肉制品；種類鑒別；微波提取法；實(shí)時(shí)熒光PCR

肉制品在國(guó)際食品市場(chǎng)中占有舉足輕重的地位，肉制品種類鑒別在食品貿(mào)易中具有極其關(guān)鍵的作用。食品的全球貿(mào)易需要考慮不同國(guó)家、不同文化以及不同宗教的飲食習(xí)慣，并遵循相應(yīng)規(guī)則。由于豬肉在伊斯蘭教、猶太教以及我國(guó)回族居民中是被禁止食用的，因此人們對(duì)食品中是否含有豬肉成分的關(guān)注度較高。另一方面由于牛肉、羊肉的價(jià)格較其它肉類高，在肉制品加工行業(yè)存在以低價(jià)肉冒充高價(jià)肉，以次充好的現(xiàn)象。原料肉經(jīng)過(guò)各項(xiàng)加工工序通常已經(jīng)失去原有形態(tài)，已不能通過(guò)傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)判斷、感官鑒別或是經(jīng)典的生化分析方法來(lái)對(duì)肉類物種進(jìn)行鑒定。目前應(yīng)用于肉制品種類鑒別的方法較多，主要有蛋白分析法、核酸分析法、脂肪酸分析法等［1-8］，具體的分析方法包括PCR、HPLC、FTIR法等［9-14］。

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱，是分子生物學(xué)中廣泛運(yùn)用的一種技術(shù)，主要原理是通過(guò)熱循環(huán)，達(dá)到目的基因片段的大量擴(kuò)增。目前這項(xiàng)技術(shù)越來(lái)越廣泛地運(yùn)用于食品來(lái)源種類的檢測(cè)鑒別中。例如，運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)牛奶或臘腸中的植物成分等［15-16］，運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)肉骨粉等產(chǎn)品中的動(dòng)物源性成分等［17-19］。結(jié)合先進(jìn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)在食品原材料以及加工食品種屬鑒定中獲得了迅猛長(zhǎng)足的發(fā)展。由于PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，使得PCR技術(shù)在物種鑒定等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用，可快速準(zhǔn)確地為食品摻假的監(jiān)管提供有力的證據(jù)。

對(duì)于常規(guī)樣品DNA的提取與純化，目前已有較多商業(yè)化試劑盒應(yīng)用于科研以及檢測(cè)行業(yè)中。然而針對(duì)大規(guī)模的樣品篩查檢測(cè)，使用試劑盒進(jìn)行提取具有成本高，提取時(shí)間長(zhǎng)等諸多不足。為了降低研究成本以及提高實(shí)驗(yàn)速度，本研究開(kāi)發(fā)了一種快速檢測(cè)肉制品真實(shí)屬性的方法。該方法基于各物種不同的線粒體等基因序列設(shè)計(jì)合成專一性的擴(kuò)增引物與探針，創(chuàng)新性地采用微波法提取樣品中的核酸，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果判斷肉制品種屬成分。

本研究對(duì)建立的肉制品提取方法以及熒光PCR方法進(jìn)行了靈敏度測(cè)試，在多種不同類型的樣品中驗(yàn)證方法與引物的有效性與可靠性。研究方法不僅可應(yīng)用于肉制品成分的檢測(cè)，也可應(yīng)用于其他產(chǎn)品中相關(guān)成分的檢測(cè)。需要特別指出的是，不同種類的樣品需要在本方法基礎(chǔ)上再進(jìn)行合理的優(yōu)化設(shè)計(jì)，最終建立一個(gè)快速穩(wěn)定可靠的檢測(cè)體系。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心；牛肉制品、羊肉制品等測(cè)試樣品購(gòu)自超市。

1.2試驗(yàn)試劑

Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、蛋白酶K購(gòu)自TAKARA公司（大連寶生物工程有限公司）；裂解緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，10%SDS）；去離子水（Promega）。

1.3儀器設(shè)備

7500熒光定量PCR儀：美國(guó)ABI公司；SmartSpec plus核酸蛋白分析儀：美國(guó)Bio-Rad公司；微量可調(diào)移液器：德國(guó)Eppendorf公司；微波爐：中國(guó)美的集團(tuán)股份有限公司；Minispin臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；MS 3漩渦混合儀：德國(guó)IKA公司；DB-3D熱塊加熱器：英國(guó)TECHNE公司；Savant DNA 120 SpeedVac DNA濃縮儀：美國(guó)Thermofisher公司；Hfsafe1200生物安全柜：上海力申公司。

1.4引物與探針

具體引物與探針信息見(jiàn)表1，引物與探針委托上海生物工程有限公司合成。

表1　引物和探針DNA序列Table 1DNA sequences of the primers and probes

1.5樣品前處理

以中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心購(gòu)買的肉制品標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)市場(chǎng)中購(gòu)買的肉制品進(jìn)行主動(dòng)性監(jiān)測(cè)研究。肉制品樣品均有獨(dú)立的包裝，在取樣時(shí)為了避免交叉污染，于樣品前處理室分別獨(dú)立取樣，于粉碎機(jī)中粉碎，粉碎杯在取完每個(gè)樣品后更換，粉碎杯在使用后立即清洗、消毒并滅菌。

樣品研磨粉碎均勻后，取2 g樣品，加入10 mL裂解緩沖液，將樣品與裂解液混合溶液渦旋震蕩5 min，獲得均質(zhì)的溶液，置于56℃放置45 min，每隔15分鐘渦旋振蕩3 min。

1.6微波法提取樣品DNA

渦旋振蕩后，放置3 min讓樣品顆粒沉降，吸取上層清液轉(zhuǎn)移至2.0 mL離心管中。為了避免微波加熱過(guò)程中離心管的變形或破裂，離心管應(yīng)均勻?qū)ΨQ放置于微波爐載物臺(tái)上，并在微波室內(nèi)放一杯蒸餾水，防止樣品過(guò)熱。放置好樣品后，根據(jù)樣品數(shù)量微波加熱1 min～3 min，經(jīng)微波處理后的管內(nèi)液體溫度約為75℃～85℃。微波提取后，13 000 r/min離心5 min。離心后，轉(zhuǎn)移裂解上清液至一新的離心管中，上清液即為DNA模板溶液。用核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定其濃度，根據(jù)測(cè)定值將樣品DNA濃度稀釋至200ng/μL，置于冰箱中保存。1.7熒光PCR反應(yīng)初始體系及熒光PCR儀循環(huán)程序

熒光PCR反應(yīng)初始體系見(jiàn)表2，熒光PCR儀循環(huán)程序見(jiàn)表3。

表2　熒光PCR反應(yīng)初始體系Table 2Original fluorescent PCR system

表3　熒光PCR儀循環(huán)程序Table 3The thermal program for fluorescent PCR

2結(jié)果與分析

2.1熒光PCR引物與探針的特異性驗(yàn)證

分別使用牛、羊、豬、雞、鴨5種物種的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，以表2中的反應(yīng)體系和表3的循環(huán)程序?qū)σ镆约疤结樳M(jìn)行特異性驗(yàn)證，具體結(jié)果見(jiàn)圖1及表4。

由圖1及表4可知，本研究合成的6對(duì)引物及其探針均有良好的特異性與靈敏度，只對(duì)目標(biāo)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，Ct值均小于30。非目標(biāo)模板DNA及陰性對(duì)照在40個(gè)循環(huán)內(nèi)均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。

2.2方法檢出限測(cè)試

為了測(cè)試豬源性成分檢測(cè)方法的靈敏度與檢出限，我們將豬肉粉以10%，5%，1%，0.5%，0.3%，0.1%，0.01%（質(zhì)量比）的比例摻入牛肉粉中。按照本研究方法提取DNA后通過(guò)PCR試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖中橫坐標(biāo)Cycle代表實(shí)時(shí)熒光PCR所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；△Rn代表標(biāo)準(zhǔn)指示信號(hào)值減去基線信號(hào)值。

由圖2可知，采用本研究方法可以檢測(cè)出低至含有0.1%濃度豬肉成分的混合樣品。即使在牛肉粉中只摻入0.1%豬肉粉，我們依然可以檢測(cè)出豬源性成分。其他動(dòng)物源性成分的靈敏性測(cè)試同豬源性成分測(cè)試方法，具體的檢出限見(jiàn)表5。

圖1　熒光引物及其探針的特異性試驗(yàn)Fig.1The specificity results of primers and probes

表4　熒光PCR的特異性結(jié)果Table 4The specificity of fluorescent PCR（The number in table is Ct value，U.D.means undetermined）

2.3市售牛羊肉制品檢測(cè)結(jié)果

為了評(píng)價(jià)方法的可靠性與適用性以及了解市售牛肉制品、羊肉制品情況，我們從市場(chǎng)中購(gòu)買了30份牛肉制品與20份羊肉制品。采用本研究方法進(jìn)行核酸提取與PCR分析，除檢測(cè)出牛源性成分外，我們從30份牛肉制品中檢測(cè)出2份牛肉制品含有豬源性成分，2份牛肉制品中含有雞源性成分，3份牛肉制品含有鴨源性成分。除檢測(cè)出羊源性成分外，我們從20份羊肉制品中檢測(cè)出1份羊肉制品含有豬源性成分，2份羊肉制品含有雞源性成分，2份羊肉制品中含有鴨源性成分。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2　豬源性成分熒光PCR的檢出限Fig.2Detection limit of porcine derived components

表5　動(dòng)物源性成分熒光PCR的檢出限Table 5The detection limit of fluorescent PCR

3討論

圖3　市售樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.3The test results of market samples

近年來(lái)隨著“假牛肉”、“假羊肉”等事件的曝光，肉制品摻假已成為亟待解決的食品安全監(jiān)管問(wèn)題。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、特異性高、靈敏度強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為對(duì)動(dòng)物、植物源性成分進(jìn)行檢測(cè)的重要技術(shù)方法。但是由于食品如肉制品基質(zhì)的復(fù)雜性，使得PCR技術(shù)在食品摻假鑒別中的應(yīng)用也受到了一定的限制。在肉制品加工處理過(guò)程中，DNA分子存在不同程度的降解，加工輔料如添加劑、防腐劑等的引入也會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)帶來(lái)一定的干擾，且肉制品脂質(zhì)蛋白質(zhì)含量較高引入很多雜質(zhì)。上述種種原因都可能會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果的偏差。因此，急需開(kāi)發(fā)更為科學(xué)有效的針對(duì)肉制品DNA的提取方法。

本研究創(chuàng)新性地采用微波法提取肉制品DNA，在高溫高能量的作用下，在pH 6.0～9.0裂解體系的環(huán)境中，我們可以獲得較高產(chǎn)量的DNA。與常規(guī)的DNA提取方法相比較，微波提取DNA法由于微波輻射的能量很高，可以將樣品的沸點(diǎn)較通常水平提高25℃左右。在這樣的情況下，更高的裂解沸點(diǎn)可以獲得更快的DNA提取效率。微波處理后，通過(guò)高速離心，可以盡量減少添加劑等的干擾，獲得質(zhì)量較高的樣品核酸，方法簡(jiǎn)便快捷經(jīng)濟(jì)，特別適合于大批量樣品的DNA提取。另外根據(jù)常見(jiàn)肉制品種類進(jìn)行設(shè)計(jì)相應(yīng)物種的特異性引物和探針，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)證明了引物及探針的特異性。在優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對(duì)方法的靈敏度進(jìn)行試驗(yàn)，得到該方法對(duì)牛、羊、豬、雞與鴨源性成分的檢測(cè)靈敏度在0.1%～0.3%之間。

通過(guò)對(duì)市場(chǎng)中肉制品種屬成分進(jìn)行檢測(cè)分析，我們發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)中牛肉制品以及羊肉制品存在不同程度的摻假行為。在30份牛肉制品中有7份樣品檢測(cè)出豬、雞或鴨源性成分，檢出率約為23.3%；在20份羊肉制品中有5份樣品檢測(cè)出豬、雞或鴨源性成分，檢出率為25.0%。從上述數(shù)據(jù)可以看出，市場(chǎng)中“假牛肉”、“假羊肉”依然存在，嚴(yán)重地?cái)_亂了市場(chǎng)秩序，同時(shí)也極大損害了消費(fèi)者的權(quán)益。

本研究開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)方法可以為肉制品樣品種屬成分測(cè)試節(jié)約大量的時(shí)間，同時(shí)本方法采用的微波加熱方法提取樣品DNA具有一定的創(chuàng)新性與廣泛的適用性，特別適合復(fù)雜基質(zhì)樣品如食品等樣品DNA的提取，方法可以推廣應(yīng)用于不同類型的樣品中，為樣品DNA的提取以及食品種屬鑒別開(kāi)拓新的思路。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化試劑組合，本方法可以開(kāi)發(fā)試劑盒或用于商業(yè)推廣，是食品監(jiān)管部門進(jìn)行食品摻假監(jiān)管的有力工具，具有重大的價(jià)值與意義。

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Detection of Meat Species in Meat Products by Microwave Irradiation and Real-time PCR

CHEN Xiao-ting1，2
（1.College of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2.National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food（Fuzhou），F(xiàn)ujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350000，F(xiàn)ujian，China）

A unique DNA isolation protocol based on microwave irradiation and density centrifugation for the simultaneous detection of bovine，caprine，ovine，porcine，chicken and duck species in meat products by PCR using newly developed primers was described.The method had been optimized using the primers designed from mitochondrial DNA（mtDNA）sequence and tested in 50 samples.To evaluate the method，30 beef products and 20 mutton products were analyzed by microwave irradiation and RT-PCR technique.Porcine，chicken and duck content was detected in beef products and mutton products.The design of this protocol makes it possible to process many samples in a short time.The new set of primers and the method involved showed high sensitivity in detecting beef，mutton，porcine，chicken and duck content in meat products.The present sample preparation method has the potential to be applied to other meat detection systems as well.

meat products；species detection；microwave irradiation；real-time PCR

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.041

2016-06-25

陳筱婷（1986—），女（漢），助理工程師，本科，研究方向：食品安全與檢測(cè)。