液質(zhì)法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷

侯文慧

（烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

液質(zhì)法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷

侯文慧

（烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的的含量。試樣經(jīng)0.1%甲酸-乙酸乙酯超聲萃取，HC-C18固相萃取柱凈化后，UPLCBEHC18色譜柱分離，選擇離子監(jiān)測（SIM），定量離子對（m/z）：258.7/ 127.0（敵百蟲）、221.0/127.1（敵敵畏）、142.1/94.1（甲胺磷）；定性離子對（m/z）：258.7/109.0（敵百蟲）、221.0/109.1（敵敵畏）、221.0/112.0（甲胺磷）。結(jié)果表明：敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷加標回收率在90.6%～106.0%之間，相對標準偏差不大于8.8%；以信噪比RSN=3計算，方法檢出限均為1.5μg/kg，方法定量限均為5.0μg/kg。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；敵百蟲；敵敵畏；甲胺磷；水產(chǎn)品；測定

有機磷農(nóng)藥（Organophosphrous pesticides，簡稱OPPS）是含有C-P鍵或C-O-P、C-S-P、C-N-P鍵的有機化合物。作為殺蟲劑，有機磷農(nóng)藥具有廣譜、高效、量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。但與此同時產(chǎn)生的環(huán)境問題也引起人們的關(guān)注，而且絕大多數(shù)有機磷農(nóng)藥是劇毒的，容易對人體或動物造成急性中毒，且對肝臟、腎臟、心臟、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)有一定毒害作用。由于在生產(chǎn)、管理及農(nóng)業(yè)中濫用有機磷農(nóng)藥，使土壤、水源受到了污染，并影響到養(yǎng)殖用地和用水，使水產(chǎn)品含有有機磷農(nóng)藥的殘留存在可能。敵百蟲作為國標漁藥廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，其在堿性條件下分解成劇毒的敵敵畏，加上養(yǎng)殖用戶非法使用甲胺磷等劇毒農(nóng)藥作為殺蟲劑和消毒劑，給水產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥殘留帶來潛在的風(fēng)險。此外，在咸魚加工過程中非法使用敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷等有機磷農(nóng)藥浸泡來進行防腐，這嚴重威脅著消費者的身體健康。

目前，國內(nèi)外對有機磷殘留的檢測方法主要是氣相或氣質(zhì)，而該方法前處理復(fù)雜、耗時長、有機溶劑消耗多，且其在進樣口襯管容易產(chǎn)生吸附，發(fā)生基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致定量結(jié)果的不準確。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其對極性有機磷檢測時選擇性更高，其對樣品的前處理凈化要求較氣相或氣質(zhì)法相對較低，但目前國內(nèi)外關(guān)于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（簡稱：液質(zhì)）法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷殘留的研究較少。本文以魚、蝦、咸魚等水產(chǎn)品為研究對象，探索超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷殘留量的分析方法，為水產(chǎn)品監(jiān)督部門、檢測機構(gòu)、水產(chǎn)品加工企業(yè)提供實際的應(yīng)用參考。

1試驗部分

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜儀Waters Acquity UPLC系統(tǒng)配Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國沃特世公司）；XS-205型電子分析天平（賽多利斯北京有限公司）；Milli-Q型超純水器（美國Millipore公司）；HY-3型多功能振蕩器（常州國華電器公司）；0.22 μm有機微孔濾膜（天津津騰試驗設(shè)備有限公司）；固相萃取裝置（美國Supelco公司）。

敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準溶液（1.0 μg/mL）：分別準確稱取敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準品100 mg（精確至0.1 mg），用65%乙腈水溶解后定容至100 mL。

魚、蝦、咸魚：購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)超市。

所用試劑除特別標注外均為分析純試劑，水為超純水。

標準物質(zhì)：敵百蟲（trichlorfon，CAS：52-68-6）、敵敵畏（dichlorvos，CAS：62-73-7）、甲胺磷（methamidophos，CAS：10265-92-6），純度均≥97%，購自美國SIGMA公司；乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，德國默克公司）；氮氣、氬氣（純度≥99.99%，河南三門峽市榮鑫氣體廠）；HC-C18固相萃取柱（500 mg/3 mL，美國安捷倫Agilent公司）。

1.2儀器工作條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱溫為35℃；流動相A為甲醇；流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速為0.2mL/min；梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1Gradient elution program of the mobile phase

質(zhì)譜條件：電離方式，電噴霧電離，正離子模式，ESI（+）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；其它質(zhì)譜條件見表2。

1.3樣品前處理

1.3.1羅非魚、對蝦等鮮活、冷凍樣品

稱取試樣5 g于50 mL離心管中，加入4.0 g無水硫酸鎂，再加入15 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯，振蕩提取10 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，殘渣用10 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯重復(fù)提取1次，離心后合并上清液并定容至刻度。準確移取上述提取液5.00 mL于離心管中，于35℃水浴氮氣吹至近干，加入2 mL 0.1%甲酸-乙腈超聲2 min后再渦旋溶解，待凈化。

1.3.2咸魚制品

稱取試樣2.5 g于50 mL離心管中，加入2.0 g無水硫酸鎂，余下步驟按1.3.1節(jié)操作“再加入15 mL 0.1%甲酸-乙酸乙酯，……，待凈化”。

1.3.3凈化

將1.3.1待凈化溶液過HC-C18固相萃取柱，待自然流干后，用0.1%甲酸-乙腈4 mL清洗上述離心管，并將清洗液依次過柱，收集全部流出液體，35℃水浴氮氣吹至近干，準確加入1.0 mL甲醇-甲酸水溶液超聲2 min后再渦旋溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4標準曲線繪制

稱取相同基質(zhì)的空白試樣6份，每份5 g，分別加入適量的標準工作溶液，制備成含敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的濃度均為5.0、10、20、50、100、200 μg/kg的樣品，按1.3進行操作，按1.2的儀器條件濃度由低到高進樣測定，以特征離子色譜峰面積為縱坐標，敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別用甲醇將敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷標準儲備液稀釋成濃度均為1.0 μg/mL的單標溶液，分別以流動注射的方式在電噴霧離子源（ESI）進行正負離子掃描。首先對單一標準溶液進行全掃描觀察其準分子離子峰，再進行二次質(zhì)譜優(yōu)化時得到子離子峰。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷均在正離子模式下具有豐度較高的母離子和子離子。每種待測物選擇豐度最大的母離子及對應(yīng)的兩個響應(yīng)值較高得子離子為定性離子，再以其中靈敏度最高、基質(zhì)干擾小的子離子為定量離子，最終對2對特征離子對（定量離子對和定性離子對）進行多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化的參數(shù)詳見表2。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的二級質(zhì)譜圖見圖1、圖2、圖3。

表2　待測物定性離子對、定量離子對、去簇電壓、碰撞能量及碰撞池出口電壓Table 2Determination of the ion pair，quantitative ion pair，the cluster voltage，and the impact of the collision energy meter

2.2UPLC色譜條件的優(yōu)化

本試驗采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×150 mm，1.7 μm）色譜柱分析。液質(zhì)聯(lián)用所用流動相可選范圍較小，常用的為甲醇、乙腈、水及其不同比例的混合物和一些易揮發(fā)性鹽的緩沖液。本研究考察了甲醇-水溶液流動相體系與甲醇-0.1%甲酸水溶液流動相體系對待測物峰形和靈敏度的影響。結(jié)果表明：在水溶液中加入少量甲酸有助于敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷等3種有機磷農(nóng)藥的離子化，響應(yīng)值更高；敵百蟲在酸性條件下穩(wěn)定性好，避免其分解轉(zhuǎn)化成敵敵畏對檢測結(jié)果的影響。故選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相。為了進一步改善峰型縮短分析時間，采用了梯度洗脫，3種待測組分均在10 min內(nèi)出峰，且峰型較好。

圖1　敵百蟲二級質(zhì)譜圖Fig.1Two mass spectra of trichlorfon

圖2　敵敵畏二級質(zhì)譜圖Fig.2Two mass spectra of dichlorvos

圖3　甲胺磷二級質(zhì)譜圖Fig.3Two mass spectra of methamidophos

2.3提取溶劑的選擇

水產(chǎn)品中有機磷農(nóng)藥殘留通常以二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈為提取溶劑。二氯甲烷毒性較大，且提取液在下層，移取時易吸出少量樣品組織；丙酮共萃物較多，且與水互溶，此外，3種有機磷農(nóng)藥均在水中有較大溶解度，增加后續(xù)的除水步驟；由于敵敵畏在中性和堿性條件下穩(wěn)定性較差，本研究考察了酸化乙腈和酸化乙酸乙酯的提取效果。結(jié)果表明，酸化乙腈的沸點較高且與水互溶，除水較困難，提取液濃縮耗時較長，對敵敵畏回收率的影響較大；酸化乙酸乙酯的沸點相對較低，水溶性較差，濃縮時耗時短，除水效果好，3種待測組分的回收率均較高。還比較了0.1%甲酸-乙酸乙酯、0.2%甲酸-乙酸乙酯、1.0%甲酸-乙酸乙酯等3種酸化乙酸乙酯對有機磷提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種提取液對3種待測組分的提取效率的影響均較小，故最終選擇提取溶劑為0.1%甲酸-乙酸乙酯。

2.4凈化條件的優(yōu)化

為達到理想的凈化效果和回收率，本研究考察了液液萃取、分散固相萃取、固相萃取等3種常見凈化方法對水產(chǎn)品中敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷測定的影響。用空白南美白對蝦肌肉樣品分別按照上述前處理方法（包括提取和凈化）制備空白基質(zhì)樣品溶液后，加標濃度均為10.0 μg/kg，其加標回收率見圖4。

圖4　3種凈化方式條件下的加標回收率（n=5）Fig.4The recoveries of spiked standard under the condition of 3 kinds of purification methods（n=5）

結(jié)果表明：3種凈化方式后的溶液均為無色；采用分散固相萃取法與固相萃取法，敵百蟲、甲胺磷的回收率均較高，而采用液液萃取法敵百蟲、甲胺磷的回收率均在80%左右，其回收率明顯低于采用分散固相萃取法與固相萃取法凈化中敵百蟲、甲胺磷的回收率；采用分散固相萃取法與液液萃取法，敵敵畏回收率均為30%左右；采用固相萃取法，敵敵畏回收率為60%左右，這可能與敵敵畏的沸點（74℃）較低，穩(wěn)定性較差有關(guān)。故最終凈化方式選擇固相萃取。

2.5方法線性范圍、檢出限和定量限

稱取相同基質(zhì)的空白試樣6份，每份5 g（咸魚制品稱取2.5 g），分別加入適量的標準工作溶液，制備成含敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的濃度均為5.0、10、20、50、100、200 μg/kg的樣品，按前處理方法進行操作，濃度由低到高進樣分析測定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標以峰面積（Y）為縱坐標，以峰面積對目標化合物的折算濃度建立回歸直線方程。以3倍信噪比（S/N=3）計算方法定量限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）計算方法定量限（LOQ）。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷在不同基質(zhì)樣品中的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限、方法定量限見表3。

表3　敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3Linear equations，correlation coefficient，limit of detection and quantification of trichlorfon，dichlorvos and methamidophos

結(jié)果表明，3種有機磷農(nóng)藥在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.995 2～0.999 6之間。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的方法檢出限（LOD）均為1.5 μg/kg，方法定量限（LOQ）均為5.0 μg/kg，滿足國內(nèi)水產(chǎn)品中對其殘留限量的要求。

在空白陰性羅非魚、南美白對蝦、咸魚樣品中，分別添加5.0、10.0、50.0 μg/kg 3個濃度水平的3種有機磷農(nóng)藥，每個濃度水平設(shè)6個平行，同時設(shè)1個空白對照。敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的加標回收率及相對標準偏差（RSD）結(jié)果見表4至表6。

表4　樣品中敵百蟲添加回收率和精密度Table 4Recovery and precision of trichlorfon in samples

表5　樣品中敵敵畏添加回收率和精密度Table 5Recovery and precision of dichlorvos in samples

表6　樣品中甲胺磷添加回收率和精密度Table 6Recovery and precision of methamidophos in samples

結(jié)果顯示：在3種水產(chǎn)品基質(zhì)中，敵百蟲的平均加標回收率為93.7%～103.2%，精密度（相對標準偏差，RSD）為3.3%～8.1%；敵敵畏的平均加標回收率為90.6%～106.0%，精密度（RSD）為6.4%～8.8%；甲胺磷的平均加標回收率為94.5%～102.8%，精密度（RSD）為3.2%～7.3%。

2.6實際樣品的檢測

選取農(nóng)貿(mào)市場待售的水產(chǎn)品（鮮魚、蝦、咸魚），按照本文前處理和儀器條件進行上機測定，結(jié)果表明：不同來源的水產(chǎn)品樣品中，敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷殘留量有所差異，其中咸魚樣品中甲胺磷的殘留量可達26.52 μg/kg。這說明在實際的水產(chǎn)品養(yǎng)殖、加工、運輸、貯藏等過程中，敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷有可能作為殺蟲劑而應(yīng)用于水產(chǎn)品中。因此，為了確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全和維護消費者人身健康，相關(guān)行政部門有必要加強對敵百蟲、敵敵畏、甲胺磷的行政監(jiān)督與日常監(jiān)測。

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Determination of Trichlorfon，Dichlorvos and Methamidophos in Aquatic Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HOU Wen-hui
（Ulanqab Vocational College，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia，China）

A method for determining the residues of trichlorfon，dichlorvos and methamidophos in aquatic products was established by an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Samples was ultrasonic extracted with 0.1%formic acid-ethyl acetate，and purified with SPE-C18，and separated by UPLC BEH C18 column，and measured by selected ion monitoring（SIM）.The qualitative ion pair（m/z）was 258.7/127.0（trichlorfon），221.0/127.1（dichlorvos），and 142.1/94.1（methamidophos）；the quantitative ion pair（m/z）was 258.7/109.0（trichlorfon），221.0/109.1（dichlorvos），221.0/112.0（methamidophos）.The results showed that the recoveries were between 92.3%-106.0%，and the relative standard deviation were no more than 8.8%；According to RSN=3，the detection limits were 1.5 μg/kg quantitative，limits were 5.0 μg/kg.

ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry；trichlorfon；dichlorvos；methamidophos；aquatic products；determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.036

2015-12-29

侯文慧（1979—），男（漢），講師，本科，研究方向：食品加工技術(shù)。