水產品中喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留檢測方法的建立

金鑰，孫延斌，崔進，梅連瑞，趙瑞，閆師杰，4，*，劉祥，*

（1.天津農學院水產學院，天津300384；2.國家加工食品質量監督檢驗中心，天津300308；3.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384；4.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津300384）

水產品中喹諾酮類和磺胺類獸藥殘留檢測方法的建立

金鑰1，2，孫延斌1，崔進2，梅連瑞2，趙瑞3，閆師杰3，4，*，劉祥2，*

（1.天津農學院水產學院，天津300384；2.國家加工食品質量監督檢驗中心，天津300308；3.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384；4.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津300384）

建立了水產品中24種獸藥殘留的QuEChERS結合液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定的分析方法。樣品經1%醋酸乙腈提取離心后，加入到無水硫酸鈉的離心管中，上清液旋蒸至近干，甲醇溶解，經C18填料凈化，氮吹濃縮，初始流動相定容，0.22 μm濾膜過濾，進行UPLC-MS/MS測定，內標法定量。流動相為水、乙腈（均含有0.1%甲酸），色譜柱為WatersBEHC181.7μm，2.1mm×100mm。在1μg/kg～20 μg/kg范圍內，目標獸藥的線性相關系數大于0.99，定量下限范圍為0.5μg/kg～1μg/kg。目標化合物的回收率為69%～124%，相對標準偏差為1%～19%。

UPLC-MS/MS；QuEChERS；水產品；喹諾酮類；磺胺類

磺胺類藥物和喹諾酮類藥物作為兩種廉價有效的人工合成抗菌藥物被廣泛大量的應用于我國的高密度集約化養殖中，不當超量的使用及不遵守休藥期造成該兩種藥物在動物體內積蓄殘留，會對人們的身體造成潛在的危害［1］。就此，許多國家及國際組織對不同基質（豬、牛、羊、水產等）中的獸藥殘留制定了最大允許殘留限量（MRLs）［2-3］，如日本制定MRLs的獸藥和添加劑種類多達231種，歐盟為121種，CAC為57種，美國為87種，加拿大為85種，中國為134種。因此，建立一種靈敏、可靠、同時檢測技術十分必要。

超高效液相串聯質譜法（UPLC-MS/MS）［4-5］技術無需對樣品進行衍生化處理，可同時測定多個目標物，具有高選擇性、高靈敏度、高通量的優勢，使得該技術在食品安全分析中得到廣泛應用。QuEChERS（一種新型前處理技術，快速Quick、簡單Easy、價廉Cheap、高效Effective、耐用Rugged、安全Safe的縮寫）［6-7］自問世以來被廣泛的應用在農藥殘留檢測的樣品處理中；由于其相對傳統獸藥殘留處理方法有諸多明顯優勢，并逐步的應用到獸藥的殘留分析［8］之中。目前，檢測方法已有報道，GABOR BALIZS等使用LC-MS檢測肉中的磺胺獸藥殘留［9］；Hubert Po-on Tang等建立了同時檢測4種大環內酯類（紅霉素、交沙霉素、北里霉素、泰樂菌素）、6種喹諾酮類（環丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氟甲喹、惡喹酸、沙拉沙星）和林可霉素、維及霉素M1、三甲氧芐二氨嘧啶共13種殘留物的在線固相萃取液相色譜-串聯質譜法［4］以及孫偉紅等用HPLC-MS/MS內標法同時測定水產品中18種磺胺類藥物殘留量［10］，但可以看出，同時檢測此兩類藥物的前處理通常較繁瑣，檢測成本高，而本文采用QuEChERS結合UPLCMS/MS對水產品中12種喹諾酮類和12種磺胺類獸藥同時進行測定，通過優化樣品前處理條件及色譜、質譜條件，建立了一次同時提取正離子模式測定喹諾酮類和磺胺類種藥物殘留的新方法。

1材料與方法

1.1材料與儀器

超高效液相色譜串聯四級桿質譜聯用儀（美國AB公司，AB Triple Quad 6500；美國安捷倫公司，Agilent 1290）；天平（Mettler-Toledo公司，ML204/02）；旋轉蒸發儀（德國IKA公司，RV10）；離心機（美國Thermo公司，PICOZ1）；氮吹濃縮儀（美國Organomation公司，OA-SYS）；超純水（屈臣氏蒸餾水）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Honeywell公司）；甲酸（ACS純，美國Sigma公司）；C18填料（天津博納-艾杰爾公司）；醋酸為優級純；無水硫酸鈉為分析純。標準物質：吡哌酸（CAS：51940-44-4）、西諾沙星（CAS：28657-80-9）、萘啶酸（CAS：389-08-2）、諾氟沙星（CAS：70458-96-7）、氧氟沙星（CAS：82419-36-1）、依諾沙星（CAS：74011-58-8）、單諾沙星（CAS：119478-55-6）、環丙沙星（CAS：93107-08-5）、洛美沙星（CAS：98079-52-8）、氟甲喹（CAS：42835-25-6）、恩諾沙星（CAS：93106-60-6）、沙拉沙星（CAS：91296-87-6）、磺胺嘧啶（CAS：68-35-9）、磺胺噻唑（CAS：72-14-0）、磺胺甲基嘧啶（CAS：127-79-7）、磺胺二甲嘧啶（CAS：57-68-1）、磺胺甲氧噠嗪（CAS：80-35-3）、磺胺對甲氧嘧啶鈉（CAS：18179-67-4）、磺胺間甲氧嘧啶鈉（CAS：1037-50-9）、磺胺氯噠嗪（CAS：80-32-0）、磺胺多辛（CAS：2447-57-6）、磺胺甲惡唑（CAS：723-46-6）、磺胺異惡唑（CAS：127-69-5）、磺胺地索辛（CAS：122-11-2）均購于德國Dr. Ehrenstorfer公司；D8環丙沙星、D3磺胺鄰二甲氧嘧啶、D6磺胺間甲氧嘧啶均購于德國Witega公司；D5恩諾沙星購于加拿大TRC公司；D5諾氟沙星購于加拿大C/D/N公司。各標準品純度均99.0%以上。

標準溶液及內標溶液的配制：以乙腈為溶劑，分別配制質量濃度范圍在0.2 mg/mL～1 mg/mL的標準儲備溶液，置棕色容量瓶避光4℃或-18℃保存，保存期為3個月；中間標準工作液配制成10 μg/mL的混合標準中間液，保存期為1個月；用時根據需要，用初始流動相對中間液進行稀釋，稀釋成適當濃度作為標準工作液，保存期為1周。

1.2樣品前處理

取代表性背脊部分魚肉進行破碎，其余貝類、蝦類取可食用部分進行破碎，置于-18℃冰箱保存。稱取2 g（精確到0.01 g）破碎好的魚肉樣品于50 mL離心管內，加入10 ng的內標溶液，加入10 mL 1%醋酸乙腈，勻漿混勻；5 000 r/min，離心5 min，上清液置于另一離心管中，重復提取2次，合并提取液；提取液加入裝有5 g無水硫酸鈉的離心管中，離心后上清液轉移至圓底燒瓶中，在40℃、60 r/min減壓的條件下旋轉蒸發至近干，加入5mL甲醇，轉移至裝有C18填料的離心管中，用8 mL甲醇分數次洗滌圓底燒瓶，同樣轉移至裝有C18填料的離心管中，收集上清液，氮吹至近干；用2 mL流動相復溶，經0.22 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS上機分析檢測。

1.3色譜-質譜條件

1.3.1色譜條件

色譜柱為Waters BEH C181.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動相A為水，B為乙腈（均含有0.1%甲酸），梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1Program of gradient elution

分析時間為30 min，后運行時間為5 min；流速為300 μL/min；柱溫為30℃；進樣量為5 μL。

1.3.2質譜條件

正離子模式掃描（ESI+）；多反應監測采集方式（MRM）；霧化氣壓力（GS1）：413.7 kPa；輔助氣壓力（GS2）：413.7 kPa；氣簾氣壓力（CUR）：206.8 kPa；離子源溫度：550℃；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；各化合物的碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）等質譜參數見表2。

表2　24種化合物的質譜采集參數Table 2Mass spectrometric and acquisition parameters of 24 compounds

續表2 24種化合物的質譜采集參數Continue table 2Mass spectrometric and acquisition parameters of 24 compounds

2結果與討論

2.1樣品前處理方法的優化

2.1.1提取劑的選擇

對于水產品中獸藥多殘留的同時測定，提取方式是關鍵，常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、甲醇等。經研究發現，以乙酸乙酯、甲醇溶液提取時，油脂等雜質不易去除，而且對蛋白的沉積效果也一般。乙腈可避免從組織中提取出過多的脂肪，同時具有很好的蛋白沉積效果，因此，確定采用乙腈作為提取溶劑［11］。之后又對提取劑的酸度進行優化，考慮了乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈。試驗數據顯示，用1%醋酸乙腈提取時，各藥物回收率大多數均在80%～120%之間，純乙腈的回收率只有60%在范圍內，5%醋酸乙腈提取的藥物時，干擾物較多，回收率不穩定。因此，本方法選擇1%醋酸乙腈作為提取劑。

2.1.2QuEChERS方法鹽析劑和吸附劑的選擇

鹽析劑在樣品提取時起到了重要的作用，可以防止樣品中的水分及水溶性雜質進入提取液，達到脫水和鹽析作用，還可促使蛋白質變性分散，防止樣品形成塊狀影響提取效率［12-13］。分別比較了無水硫酸鈉、無水硫酸鎂，無水硫酸鎂和無水硫酸鈉混合鹽3種鹽析劑。無水硫酸鈉的雜峰少而且響應最低，確定以無水硫酸鈉為鹽析劑。

吸附劑比較了C18、PSA及C18與PSA的混合物對水產品基質的凈化效果及回收率。從得出結果顯示，C18的凈化效果和回收率較好。其他2種吸附劑凈化的樣品在過濾膜后均呈渾濁狀態。分析原因為C18主要吸附的雜質是脂類化合物，而PSA主要吸附脂肪酸、有機酸和色素等，而魚肉樣品的主要雜質為脂類，正適合用C18去除雜質。因此，選取C18作為試驗的凈化吸附劑。

2.2質譜與色譜條件的優化

2.2.1質譜條件的優化

質譜條件中的去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）的大小影響離子的豐度，與方法的靈敏度密切相關［14］。本文用乙腈配制的大約濃度為25 ng/mL的標準品，以不連接液相，直接針泵進樣的方式對24種組分以及5種內標物的去簇電壓及碰撞能量進行了優化。

2.2.2色譜條件的優化

比較了Waters BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Eclipse Plus C18RRHD（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱，結果顯示，Waters BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）對24種化合物的分離情況及響應值均高于其他，峰型尖銳且無漂移現象，對實際樣品的檢測適用性更好，最終選擇Waters BEH C18色譜柱。

在液質檢測中，甲醇、乙腈常作為流動相，考慮乙腈作為流動相時，峰形較尖銳，較好定量，選擇乙腈作為流動相［15］；甲酸有增強離子化的作用，提高方法的靈敏度，故本試驗在水相和有機相中分別加入0.05、0.1、0.2%的甲酸進行試驗，從回收率方面看，當添加0.1%甲酸時，回收率最高。根據以上優化所得到的條件，24種獸藥及5種內標分離譜圖見圖1。

圖1　24種組分及5種內標組分混合標準溶液的MRM色譜圖Fig.1MRM chromatogram of 24 analytes and 5 internal standards mixed standard solution

2.3方法學驗證

標準曲線與檢出限采用魚肉（天津養殖的鯉魚、鰱魚、石斑魚，以及南美白對蝦、毛蛤、扇貝）陰性樣品進行5點內標標準工作曲線的繪制［15-16］，在選定的色譜和質譜條件下進行測定，以10倍信噪比計算24種獸藥的檢定量下限（LOQ）為0.5 μg/kg或1.0 μg/kg，各種藥物均低于我國規定的MRLs，結果見表3。結果顯示，24種獸藥在質量濃度為1 ng/mL～20 ng/mL范圍內的線性關系良好，相關系數在0.99以上。

表3　24種獸藥的定量下限、回歸方程、線性系數、回收率與相對標準偏差（n=5）Table 3Limits of quantitation（LOQs），regression equations，correlation coefficients，recoveries and RSDs of 24 veterinary drugs（n=5）

3結論

本研究以鯉魚、鰱魚、石斑魚等作為樣本，采用1%醋酸乙腈提取，以QuEChERS方法為前處理方法，水：乙腈（均含有0.1%甲酸）為流動相，建立了UPLCMS/MS同時測定水產品中24種獸藥殘留的分析方法。該方法目標獸藥的線性相關系數大于0.99，定量下限范圍為0.5 μg/kg～1 μg/kg，回收率為69%～124%，相對標準偏差為1%～19%。本方法檢測周期短、前處理技術簡單，無需特殊實驗裝置，實驗成本低，為大批量水產品獸藥殘留檢測提供了簡便可靠的篩查方法。

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Establishment of Detection Method of Quinolones and Sulfonamides in Aquatic Products

JIN Yue1，2，SUN Yan-bin1，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，ZHAO Rui3，YAN Shi-jie3，4，*，LIU Xiang2，*
（1.College of Aquaculture，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，Tianjin 300308，China；3.College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；4.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

A method was developed for the simultaneous determination of 24 veterinary residues by QuEChERS and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The sample was extracted with 1% acetonitrile acetic acid and centrifuged with centrifugal machine.The supernatant liquid was directly passed with anhydrous sodium sulfate.Then，the extract was evaporated under rotary evaporator，dissolved in methanol，passed with C18，the extract was evaporated under nitrogen stream and redissolved with water-acetonitrile（both with 0.1%formic acid）.The HPLC separation was performed on Waters BEH C181.7 μm，2.1 mm× 100 mm by gradient elution with water-acetonitrile（both with 0.1%formic acid）as mobile phase.Under the optimal conditions，the veterinaries were larger than 0.99 in the linear range of 1 μg/kg-20 μg/kg，the limits of quantitation ranged from 0.5 μg/kg to 1 μg/kg.The recoveries of 24 veterinary at three spiked levels were between 69%and 124%，their relative standard deviations were in the range of 1%-19%.

UPLC-MS/MS；QuEChERS；aquatic products；quinolones；sulfonamides

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.029

2015-11-18

國家重大科學儀器設備開發專項（2013YQ510391）

金鑰（1990—），女（漢），在讀碩士研究生，主要從事動物性食品安全與營養方面的研究。

閆師杰（1971—），男（漢），教授，博士，主要從事食品質量與安全方面的研究與教學。劉祥（1976—），男（漢），正高級工程師，博士，主要從事食品安全檢測與分析。