血紅鉚釘菇黃酮體外抗氧化活性的研究

張海悅，楊雪，李震，于浩

（長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

血紅鉚釘菇黃酮體外抗氧化活性的研究

張海悅，楊雪，李震，于浩

（長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

研究血紅鉚釘菇黃酮提取工藝及其體外抗氧化作用。在單因素基礎上，采用響應面優化血紅鉚釘菇黃酮提取的最佳工藝條件。以VC為對照，對其清除1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基（·OH）的能力進行探討。結果表明最佳工藝條件為：乙醇體積分數83%、液料比15∶1（mL/g）、提取時間2.5h、提取溫度85℃，在此條件下進行驗證試驗，血紅鉚釘菇黃酮的提取率可達6.72%。血紅鉚釘菇總黃酮清除DPPH自由基、·OH的IC50值分別為0.01、0.17 mg/mL，均高于VC。表明血紅鉚釘菇黃酮具有較強的體外抗氧化活性。

血紅鉚釘菇；黃酮；響應面；抗氧化作用

血紅鉚釘菇［Chroogomphus rutilus（Schaeff.）O.K. Mill.］，屬擔子菌亞門、牛肝菌目、鉚釘菇科、鉚釘菇屬。分布于吉林、黑龍江、遼寧、河北、山西、云南、四川、西藏、廣東、湖南等地區［1］，其菌肉肥厚，肉質細嫩，風味好，且營養豐富，含有蛋白質、糖類、脂肪、微量元素及人體必需的氨基酸［2］。目前對血紅鉚釘菇的研究多數集中在形態、分類和栽培和發酵方面［3-4］。國內外主要研究了血紅鉚釘菇多糖的提取工藝［5］、體外抗氧化活性［6］、提高免疫力［7］、抑菌活性［8］以及醇溶性色素［9］。關于血紅鉚釘菇的其他生物活性物質鮮有報道，具有廣闊的開發利用前景，本文主要對血紅鉚釘菇總黃酮的提取工藝進行了優化及體外抗氧化活性進行了研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑

血紅鉚釘菇：購買于吉林省延吉市，由東北師范大學生物系鑒定；無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、雙氧水：北京化工廠；亞硝酸鈉：萊陽化工實驗室；硝酸鋁：天津市光復精細化工研究所；磷酸氫二鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵：天津市光復科技發展有限公司；三氯乙酸：天津市致遠化學試劑有限公司；鄰菲羅啉：天津基準化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：東京化成工業株式會社；以上試劑均為分析純。蘆丁標準品：北京恒元啟天化工技術研究院與北京世紀奧科生物科技有限公司聯合研制。

1.2儀器與設備

SHHW21.600AⅡ三用恒溫水箱：天津市泰斯特儀器有限公司；TG16GT高速臺式離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；UV754可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；FW135中草藥粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥器：上海精宏實驗設備有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫康技術公司。

1.3方法

1.3.1血紅鉚釘菇總黃酮提取工藝流程

原料烘干→粉碎→脫脂→干燥→提取→抽濾→合并濾液→減壓濃縮→冷凍干燥→總黃酮

1.3.2操作要點

1）烘干：將血紅鉚釘菇65℃烘干。

2）粉碎：將烘干后的血紅鉚釘菇粉粹過80目篩，備用。

3）脫脂：石油醚（沸點60℃～90℃）浸泡24 h。

4）提?。翰捎靡掖蓟亓魈崛。掖俭w積分數83%、液料比15∶1（mL/g）、提取時間2.5 h、提取溫度85℃，提取3次合并濾液。

5）減壓濃縮：將濾液濃縮至無醇味，得到浸膏。

6）冷凍干燥：將總黃酮冷凍干燥24 h，得到總黃酮干粉。

1.3.3蘆丁標準曲線的制備［10］

準確吸取105℃烘干至恒重的蘆丁對照品2.5 mg，配制成濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準液，分別吸取50、100、200、400、800 μL相當于（5、10、20、40、80 μg）標準溶液別置于10 mL具塞刻度的比色管中，各加入30%乙醇至5 mL，分別加入5%亞硝酸鈉水溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min；加入10%硝酸鋁水溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min再分別加入4%氫氧化鈉水溶液4 mL，加入30%乙醇至10 mL，靜置10 min，在最大吸收波長510 nm下，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.001 1x-0.002 4，相關系數R2=0.999 4。

1.3.4血紅鉚釘菇總黃酮提取率的測定［11］

式中：m為試樣的質量，g；m1為根據標準曲線中計算出被測液總黃酮含量，μg/mL；V1為待測液中分取體積，mL；V2為待測液總體積，mL。

1.3.5響應面優化試驗

利用試驗設計得到的數據采用多元二次回歸方程，尋求最優工藝參數，通過響應面試驗設計方法分析回歸方程［12-13］。

在單因素試驗結果的基礎上，用Design-Expert軟件以血紅鉚釘菇總黃酮提取率為指標，確定選用Box-Behnken試驗設計的自變量有乙醇體積分數、液料比、提取時間和提取溫度，通過響應面對提取條件進行優化，響應面因素水平見表1。

表1　響應面因素及水平設計Table 1Factors and levels for response surface analysis

1.3.6驗證試驗

將得出的最佳提取工藝條件重復操作5次，驗證其穩定性。

1.3.7血紅鉚釘菇總黃酮體外抗氧化活性研究

在驗證試驗的基礎上，血紅鉚釘菇500 g提取總黃酮，用血紅鉚釘菇總黃酮干粉配置不同濃度的黃酮水溶液，進行體外抗氧化試驗。

1）DPPH自由基清除試驗［14］。

2）羥基自由基清除試驗［15］。

1.4數據處理

每次試驗設3個平行，取平均值，數據采用Excel軟件和Design Expert 8.06軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，以血紅鉚釘菇總黃酮提取率為響應值，采用Box-Benhnken的中心組合試驗設計，進一步進行四因素三水平的分析試驗。Design-Expert試驗方案及結果見表2。

表2　Design-Expert試驗方案及結果Table 2Experimental design and results for response surface analysis

續表2Design-Expert試驗方案及結果Continue table 2Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert軟件進行回歸分析，經排除不顯著項后，得到如下回歸方程：Y=5.95+0.13×A+0.37× B+0.73×C+0.059×D+0.025×A×B+0.040×A×C+0.022×A× D+0.2×B×C+0.050×B×D+0.010×C×D-0.56×A2-0.59×B2-0.21×C2-0.14×D2。

方差分析見表3。

表3　方差分析表Table 3Analysis varlance

續表3方差分析表Continue table 3Analysis varlance

對此回歸模型進行分析，由表3可知，一次項D不顯著，B、C對模型的影響極為顯著，A對模型影響為顯著，二次項A2、B2、C2極為顯著，該模型的相關系數為R2=0.966 4，自變量與響應值之間的線性關系也很顯著，可以用作理論上血紅鉚釘菇總黃酮類化合物提取試驗的預測分析。均方值越大意味著該因素對提取率的影響越大。從表3可知，對響應值（提取率）影響因素的主次順序為：C＞B＞A＞D，即提取時間＞液料比＞乙醇體積分數＞提取溫度。通過對回歸模型進行分析，可以得到曲面的最大點，求導方程解得A=83.48%，B= 15.88∶1（mL/g），C=2.5 h，D=85.28℃。在該條件下血紅鉚釘菇總黃酮理論提取率6.66%。

圖1　因素交互作用對黃酮提取率的影響Fig.1The influence of factors interaction of flavonoids extraction yield

2.2驗證試驗

考慮到實際操作的各種條件，對血紅鉚釘菇總黃酮的最佳提取工藝條件進行修正：A=83%，B=15∶1（mL/g），C=2.5 h，D=85℃，在此條件下重復5次進行驗證試驗，驗證試驗結果見表4。血紅鉚釘菇總黃酮提取率可達到6.72%。

表4　最佳條件的驗證試驗Table 4The optimum condition of experiment

2.3血紅鉚釘菇總黃酮體外抗氧化活性研究

2.3.1DPPH自由基清除試驗

VC和血紅鉚釘菇總黃酮對DPPH自由基的清除能力見圖2。

圖2　VC和血紅鉚釘菇總黃酮對DPPH自由基的清除能力Fig.2DPPH radicals scavenging capacity of VCand total flavonoids from Chroogomphis rutilus

如圖2所示，血紅鉚釘菇總黃酮類對DPPH自由基有較高的清除率，隨著血紅鉚釘菇總黃酮質量濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，呈現出正相關，血紅鉚釘菇總黃酮質量濃度在0.08 mg/mL，清除率能達到93.88%以上，但在同等條件下，VC的清除率是75.66%，其清除DPPH自由基的IC50值為0.01 mg/mL，由此可表明血紅鉚釘菇總黃酮具有較好的抗氧化性。

2.3.2羥基自由基清除試驗

VC和血紅鉚釘菇總黃酮對羥基自由基的清除能力見圖3。

圖3　VC和血紅鉚釘菇總黃酮對羥基自由基的清除能力Fig.3Hydroxyl radicals scavenging capacity of VCand total flavonoids from Chroogomphis rutilus

由圖3可以看出，隨著樣液質量濃度的增加，對·OH的清除率呈逐漸上升趨勢，質量濃度在0.2mg/ mL以前增長速度較快，且質量濃度在＞0.1 mg/mL時，血紅鉚釘菇總黃酮對·OH的清除能力已經超過VC?？梢钥闯鲅t鉚釘菇總黃酮對·OH有較強的清除能力，在達到一定質量濃度以后要優于VC，其清除·OH的IC50值為0.17 mg/mL，表明其具有較好抗氧化能力。

3結論

響應面優化血紅鉚釘菇總黃酮提取的最佳工藝條件為乙醇體積分數83%、液料比15∶1（mL/g）、提取時間2.5 h、提取溫度85℃，在此條件下進行驗證試驗，血紅鉚釘菇總黃酮的提取率可達6.72%，各因素對提取率的影響主次順序為：提取時間＞液料比＞乙醇體積分數＞提取溫度。血紅鉚釘菇總黃酮體外抗氧化實驗結果表明，清除能力在一定范圍內隨血紅鉚釘菇總黃酮質量濃度的升高而升高，均呈現出一定的量效關系，且均高于VC，其清除DPPH自由基、·OH的IC50值分別為0.01、0.17 mg/mL，由此可知，血紅鉚釘菇總黃酮具有較好的體外抗氧化能力。

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Antioxidant Activity in vitro of Chroogomphis rutilus Flavonoids

ZHANG Hai-yue，YANG Xue，LI Zhen，YU Hao
（College of Chemical and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

The extraction and antioxidant activity in vitro of flavonoids from Chroogomphis rutilus was investigated.The extraction process was optimized using response surface methodology.The evaluation of antioxidant activity was carried out by DPPH radical and hydroxyl radical scavenging assays in comparison to VC.The optimumextractionconditionsweredeterminedas83%，15∶1（mL/g），2.5 h and 85℃forethanolconcentration，solvent-to-solid ratio，extraction time and temperature，respectively.The experimentally observed on extraction efficiency of flavonoids under the optimized conditions was 6.72%.In DPPH radical and hydroxyl radical scavenging assays，the IC50of the flavonoids from Chroogomphis rutilus were 0.01，0.17 mg/mL，were higher than that of VC.These results showed that flavonoids of Chroogomphis rutilus had strong antioxidant activity in vitro.

Chroogomphisrutilus；flavonoids；responsesurface；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.026

2015-11-09

張海悅（1967—），女（漢），教授，博士，研究方向：天然產物提取及功能食品研發。