殼聚糖精制蹄葉橐吾葉多糖及抗氧化活性研究

尤婷婷，姜燕，于潤美，張海悅，周玲君

（長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

殼聚糖精制蹄葉橐吾葉多糖及抗氧化活性研究

尤婷婷，姜燕*，于潤美，張海悅，周玲君

（長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春130012）

利用殼聚糖絮凝純化作用精制蹄葉橐吾葉多糖，以多糖損失率，蛋白質去除率及脫色率為指標，通過單因素及正交試驗確定最佳工藝參數：在50mL粗多糖溶液（濃度為20 mg/mL）中加入2%殼聚糖溶液1 mL，絮凝溫度30℃下處理60 min，得到的精制蹄葉橐吾葉多糖（DPLF）多糖損失率為42.81%，蛋白質脫除率為85.03%，脫色率為81.74%。DPLF抗氧化活性結果表明：DPLF總抗氧化能力和還原力均隨濃度增加呈上升趨勢，清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子能力和清除羥基自由基能力的IC50值分別為0.0351、1.4591mg/mL和0.1548mg/mL。

蹄葉橐吾葉多糖；殼聚糖法；絮凝作用；抗氧化活性

蹄葉橐吾葉是吉林省延邊市居民常食的一種山野菜，俗名馬蹄葉［1］，屬菊科橐吾屬植物。馬蹄葉具藥用價值，有祛痰、鎮痛［2］和排毒［3］等功效。此外，還含有硒、錳、鋅等微量元素，通過協同作用，有助于防止心血管疾病等。通過水提醇沉法得到的蹄葉橐吾葉多糖（PLF）呈深褐色，并含有大量的蛋白質等雜質，需精制。傳統方法采用Sevage法［4］或三氯乙酸法［5］，前者通過Sevage試劑（正己烷∶氯仿=1∶4）處理，劇烈震搖，靜置分層除雜，此法需要反復操作數次；而后者反應劇烈，可能會造成多糖大量損失。

殼聚糖具有來源廣泛，安全無毒副作用等特點［6］，作為一種天然高分子絮凝劑［7］，廣泛應用于化學工業、環境處理、食品加工和醫藥等行業中，主要通過電中和作用［8］及吸附架橋作用［9］產生絮凝效果，進而達到澄清、除雜和純化等目的。由于殼聚糖的脫乙酰度［10］較高時，溶解性好，發揮絮凝作用明顯，本試驗選用脫乙酰度為90%的殼聚糖絮凝純化PLF，探討最優工藝，并研究其抗氧化活性。

1材料與方法

1.1主要材料

蹄葉橐吾葉多糖（PLF）：采用水提醇沉法大批量提取。取10 g溶于500 mL蒸餾水中，充分混勻，靜置待用。

殼聚糖母液：準確稱取2 g殼聚糖溶于100 mL 2%的冰醋酸溶液中配成2%殼聚糖溶液，現用現配。

Sevage試劑配制：按正己烷∶氯仿=1∶4（mL/mL）比例配制，混勻靜置，避光保存，現用現配。

1.2主要試劑與儀器

殼聚糖（脫乙酰度為90%）：南通興成生物制品廠；二苯代苦肼自由基（DPPH）：長春蘭德爾科技有限公司；冰醋酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯乙酸：天津光復精細化工研究所；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒：南京建成生物科技有限公司。

集熱式磁力攪拌器（DF-101S）：金壇市科技儀器有限公司；紫外可見分光光度計（201304084）：上海佑科儀器儀表有限公司；臺式高速離心機（TG15GT）：湖南凱達科學儀器有限公司。

1.3殼聚糖法純化蹄葉橐吾葉多糖（PLF）

1.3.1殼聚糖法絮凝純化蹄葉橐吾葉多糖（PLF）的單因素試驗

分別對殼聚糖用量、絮凝溫度及絮凝時間3個因素進行單因素試驗，考察多糖損失率、蛋白質去除率及脫色率。量取50 mL PLF溶液，分別加入殼聚糖母液（1、2、3、4 mL），在一定溫度下（30、40、50、60、70℃）絮凝一定時間（60、90、120、150 min和180 min），離心（5 000 r/min）10 min，取上清液加入4倍體積95%乙醇，隔夜離心，揮干乙醇并定容至100 mL，采用紫外分光光度計于490 nm處測定多糖吸光度值，于595 nm波長下測蛋白質的吸光度值，于660 nm波長下測多糖溶液的透光率，每組試驗重復3次。計算蹄葉橐吾葉多糖損失率、蛋白質去除率及脫色率。

式中：N1，N2分別為殼聚糖處理前后蹄葉橐吾葉多糖的含量值，μg/mL；C1，C2分別為殼聚糖處理前后蛋白質的含量值，mg/mL；A1，A2分別為殼聚糖處理前后于660 nm處的透光率值。

1.3.2殼聚糖法絮凝純化蹄葉橐吾葉多糖（PLF）的正交試驗

根據單因素試驗，以多糖的損失率、蛋白質去除率為指標，考察殼聚糖用量、絮凝時間、絮凝溫度的影響。選取L9（34）正交表設計試驗（表1），確定最佳試驗參數。

1.3.3葡萄糖標準曲線的繪制

采用苯酚硫酸法測定多糖含量。配制濃度為1.0 mg/mL葡萄糖標準貯備液，稀釋10倍制得葡萄糖標準溶液。精密移取葡標液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于10 mL具塞比色管中，加蒸餾水補至2 mL，再分別加入6%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5 mL，振搖，靜置5 min，沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，空白管調零，于490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線（圖1）。

表1　正交試驗因素水平表Table 1Orthogonal test factors table

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1Glucose standard curve

1.3.4蛋白質標準曲線的繪制

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。精密移取100 μg/mL牛血清蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL和0.7 mL于試管中，加入蒸餾水至1.0 mL，再依次加入考馬斯亮藍G-250溶液5.0 mL，搖勻，放置2 min后，蒸餾水調零，于595 nm下測定吸光度值，繪制標準曲線（圖2）。

圖2　蛋白質標準曲線Fig.2Protein standard curve

1.4Sevage法精制蹄葉橐吾葉多糖（PLF）的工藝流程

將Sevage試劑與PLF按4∶1（mL/mL）比例混勻，劇烈震搖1.5 h，使其充分接觸，然后將其置于分液漏斗中，陰暗處靜置1 h，產生明顯分層后除去已變性蛋白質，收集多糖溶液，離心（4 000 r/min，10 min～15 min），凍干，得到精制蹄葉橐吾葉多糖（DPLF）。

1.5蹄葉橐吾葉多糖抗氧化活性研究

1.5.1DPPH自由基清除試驗

吸取不同濃度的樣品溶液2 mL，加入60 μmol/L的二苯代苦肼自由基（DPPH）甲醇溶液3mL，搖勻，陰暗處室溫放置30 min，采用紫外可見分光光度計在517nm處測定吸光度值，測A2值。步驟同上，樣品與甲醇混勻，測A0值；DPPH甲醇溶液與甲醇混勻，測A1值。

1.5.2超氧陰離子清除試驗

采用鄰苯三酚自氧化法［11］測定DPLF對超氧陰離子的清除能力。

1.5.3羥基自由基清除試驗

采用鄰二氮菲法［12］測定DPLF對羥基自由基的清除能力。

1.5.4還原力測定

采用鐵氰化鉀法［13］測定DPLF的還原能力。

1.5.5總抗氧化能力測定

采用總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒法，按照操作說明書測定DPLF的總抗氧化能力。

2結果與分析

2.1殼聚糖法絮凝純化蹄葉橐吾多糖的單因素試驗結果分析

通過單因素試驗考察殼聚糖用量、絮凝時間及絮凝溫度對PLF中多糖損失率、蛋白質去除率及脫色率的影響趨勢。結果見圖3。

圖3　殼聚糖用量（a）、絮凝時間（b）及絮凝溫度（c）對PLF多糖損失率、蛋白質去除率及脫色率的影響Fig3.Effect of chitosan addition（a），flocculation duration（b）and flocculation temperature（c）on polysaccharide loss rate，removal rate of protein and decolorization rate of PLF

如圖3（a）所示，殼聚糖添加量逐漸增加，PLF的多糖損失率不斷增加，當添加量為2 mL時，多糖損失率已超過80%，進一步增加殼聚糖用量，PLF中蛋白質去除率及脫色率也呈現緩慢下降趨勢，這可能是由于殼聚糖的增加使溶液達到過飽和狀態，阻礙絮凝作用［14］。絮凝時間對三者的影響見圖3（b），絮凝時間的增加，PLF中的多糖損失率、蛋白質脫除率及脫色率均在小范圍內波動，影響不大。絮凝溫度對三者影響的趨勢圖（圖3（c））表明絮凝溫度的改變對PLF中蛋白質去除率影響較小，當溫度超過40℃時，脫色率及多糖損失率均呈上升趨勢。

2.2殼聚糖法絮凝純化蹄葉橐吾多糖的正交試驗結果分析

殼聚糖絮凝純化蹄葉橐吾葉片多糖的正交試驗結果見表2。

表2　殼聚糖絮凝純化蹄葉橐吾葉片多糖的正交試驗結果Table 2Orthogonal test results of purifying PLF by chitosan flocculation method

續表2殼聚糖絮凝純化蹄葉橐吾葉片多糖的正交試驗結果Continue table 2Orthogonal test results of purifying PLF by chitosan flocculation method

通過正交試驗優化得到A1B1C1（以多糖損失率為考察指標）和A2B3C2（以蛋白質去除率為考察指標）兩組最優組合，其中殼聚糖用量為主要影響因素。從正交試驗數據可知A2B3C2條件下蛋白質去除率最高，但本試驗中主要目標物質為多糖成分，應在多糖損失率處于一定范圍內時綜合考察最優參數。故選擇A1B1C1組和A2B3C2組進行驗證試驗，每組平行3次。驗證試驗結果見表3。

表3　驗證試驗Table 3Verification test

通過驗證試驗，兩種條件下蛋白質去除率變化4.93%，脫色率變化1.05%，A2B3C2組多糖損失率較高，較A1B1C1組增加23.90%，綜合3個指標評價，確定試驗組A1B1C1為最優工藝參數：在50 mL粗多糖溶液（c=20 mg/mL）中，加入2%殼聚糖溶液1 mL，絮凝溫度30℃下處理60 min，得到DPLF，多糖損失率為42.81%，蛋白質脫除率為85.03%，脫色率為81.74%。

2.3殼聚糖法與Sevage法精制效果對比

殼聚糖法與Sevage法對PLF精制效果對比如表4所示。

表4　殼聚糖法和Sevage法精制效果對比Table 4Comparison chitosan method with Sevage method for refining effect

由表4可知，Sevage法處理后的多糖損失率較殼聚糖法略小，而脫除蛋白質和色素的比例相較于殼聚糖法分別低了30.80%和46.49%，綜合考察，當操作次數為1次，殼聚糖法優于Sevage法。

2.4抗氧化試驗結果分析

考察DPLF對DPPH自由基，超氧陰離子和羥基自由基的清除能力如圖4～圖6所示。

圖4　DPLF對DPPH自由基的清除能力曲線圖Fig.4Scavenging activity of DPLF on DPPH free radicals

圖5　DPLF對超氧陰離子的清除能力曲線圖Fig.5Scavenging activity of DPLF on superoxide anion radicals

圖6　DPLF對羥基自由基的清除能力曲線圖Fig.6Scavenging activity of DPLF on hydroxyl free radicals

圖7　DPLF還原能力曲線圖Fig.7Curves of DPLF on reducing power

DPPH是一種比較穩定的脂性自由基，DPLF濃度升高，對DPPH自由基的清除能力不斷增強（圖4），當濃度為0.06 mg/mL時，清除率為78.94%，由二次多項式擬合得到IC50值約為0.035 1 mg/mL。由圖5可以看出DPLF對超氧陰離子自由基清除率趨勢，當DPLF濃度小于1.5 mg/mL時，曲線呈緩慢上升趨勢，繼續增加濃度，對超氧陰離子自由基清除率的增加趨勢明顯，由二次多項式擬合得到IC50值約為1.459 1 mg/mL。DPLF對羥基自由基的清除能力見圖6，當濃度為0.1 mg/mL時，DPLF對其清除能力達到33.06%，由二次多項式擬合得到IC50值約為0.154 8 mg/mL。通過DPLF還原能力曲線圖可以看出，隨著濃度的增加，還原能力逐漸增強，濃度為0.4 mg/mL時，DPLF的吸光度值為2.719，DPLF具有較強的還原能力。

采用總抗氧化能力試劑盒法研究了不同濃度DPLF溶液總抗氧化能力，結果如圖8所示。

圖8　DPLF與抗壞血酸總抗氧化能力曲線圖Fig.8Curves of DPLF and ascorbic acid on antioxidant capacity

DPLF濃度5 mg/mL～10 mg/mL范圍時，曲線呈明顯上升趨勢，當DPLF濃度為5 mg/mL時，其抗氧化能力為29.97 mL，弱于同等條件下的抗壞血酸溶液，當濃度為10 mg/mL時，其抗氧化能力達到64.63單位/mL，較濃度為5 mg/mL時提高了53.6%，進一步增加濃度，其抗氧化能力提高18.8%。李恃圻等［15］采用相同方法在相同濃度下測得的薏仁多糖總抗氧化能力僅為3.1單位/mL。

3結論

本文通過單因素試驗結合正交試驗優化了殼聚糖法絮凝純化蹄葉橐吾葉多糖（PLF）的工藝，確定了最佳條件為在濃度為20 mg/mL的PLF溶液50 mL中，加入2%殼聚糖溶液1 mL，在30℃條件下絮凝60 min，此條件下處理的PLF損失率為42.81%，蛋白質脫除率為85.03%，脫色率為81.74%。對處理后PLF的抗氧化活性予以研究，隨著濃度的增加，DPLF對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、還原力和總抗氧化能力均呈上升趨勢，采用二次多項式擬合得到DPLF清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力和清除羥基自由基能力的IC50值分別為0.035 1、 1.459 1 mg/mL和0.154 8 mg/mL，為其他多糖的抗氧化活性對比分析及其生物活性進一步研究提供參考。機體的抗氧化能力可能會直接或間接影響身體各項機能調節，因此選擇抗氧化活性較高的生物活性成分并應用于食品和醫藥領域中具有更大價值。

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Flocculation and Purification of the Polysaccharide of Ligularia fischeri Leaves and Its Antioxide Activity

YOU Ting-ting，JIANG Yan*，YU Run-mei，ZHANG Hai-yue，ZHOU Ling-jun
（College of Chemical and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun130012，Jilin，China）

The polysaccharide of Ligularia fischeri（PLF）were purified using chitosan method.Indicates for polysaccharide loss rate，removal rate of protein and decolorization rate，the optimum parameter were determined that chitosan solution（concentration of 2%）of 1 mL was added，and pured 60 min under the temperature of 30℃in PLF solution of 50 mL（concentration of 20 mg/mL）to obtain the DPLF.Polysaccharide loss rate was 42.81%，removal rate of protein was 85.03%and decolorization rate was 81.74%.Antioxide activity of DPLF showed that total antioxide activity and reducing power appeared the trend of rising with concentration increasing.IC50values of scavenging activity of DPLF on DPPH free radicals，superoxide anion radicals and hydroxyl free radicals is 0.035 1，1.459 1 mg/mL and 0.154 8 mg/mL，respectively.

polysaccharide of Ligularia fischeri；chitosan method；flocculation；antioxide activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.007

2015-11-24

尤婷婷（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產物研發。

姜燕（1983—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品新資源開發與利用。