不同產(chǎn)地昆侖雪菊抗氧化活性比較研究

杜鵑，吳津蓉，吳忠紅

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

不同產(chǎn)地昆侖雪菊抗氧化活性比較研究

杜鵑1，吳津蓉1，吳忠紅2

（1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，新疆昌吉831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工所，新疆烏魯木齊830091）

采用化學(xué)發(fā)光法比較不同產(chǎn)地昆侖雪菊水提物的體外抗氧化活性，結(jié)果表明，3種不同產(chǎn)地、海拔的雪菊水提物均能有效地清除O2-·、HO·和H2O2，只是對(duì)不同的自由基清除效果不同。和田高原雪菊對(duì)O2-·、HO·的清除效果都是好的，達(dá)坂城平原雪菊對(duì)H2O2的清除效果最好，田高高原雪菊和喀什高原雪菊對(duì)HO·的清除效果都優(yōu)于維生素C，不同產(chǎn)地、海拔雪菊中黃酮含量與O2-·、HO·的清除率之間相關(guān)性良好。

不同產(chǎn)地；雪菊；抗氧化性

雪菊［1-2］是生長(zhǎng)海拔3200米以上的雪山之隅及喀喇昆侖山脈的野生蛇目菊，所以又稱昆侖雪菊、天山雪菊，其花期極短，產(chǎn)量稀少，是目前新疆惟一與雪蓮齊名，具有獨(dú)特功效的稀有高寒植物。長(zhǎng)期以來(lái)，昆侖雪菊被新疆和田當(dāng)?shù)鼐用癞?dāng)花茶飲用，有燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒的功效。近年來(lái)，雪菊以其卓越的降血壓、降血脂功能，成為茶界新寵，身價(jià)暴增，目前在新疆和田、喀什、達(dá)坂城開(kāi)始產(chǎn)業(yè)化種植。雪菊中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物［3-4］，研究表明，黃酮類(lèi)化合物也是一類(lèi)天然強(qiáng)抗氧化劑，其中很多黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性甚至大于維生素E。化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、檢測(cè)限低、線性范圍寬等特點(diǎn)，常用于抗氧化活性的測(cè)定，而且儀器操作快捷簡(jiǎn)便，便于自動(dòng)化分析［5］。本試驗(yàn)分別以生長(zhǎng)在不同產(chǎn)地、不同海拔高度的3種昆侖雪菊為研究對(duì)象，采用化學(xué)發(fā)光法比較不同產(chǎn)地昆侖雪菊水提物的體外抗氧化活性，以期為雪菊花茶的深入研究及新疆雪菊資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

材料：采自3個(gè)不同地點(diǎn)的昆侖雪菊樣品分別為新疆和田皮山縣克里陽(yáng)高原雪菊（生長(zhǎng)海拔3 200 m左右）、新疆喀什高原雪菊（生長(zhǎng)海拔2 000 m左右）、新疆達(dá)坂城平原雪菊（生長(zhǎng)海拔1 000 m左右）。50℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，儲(chǔ)藏備用。

魯米諾（色譜純）：Sigma公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：上海金穗生物有限公司；乙醇、鐵氰化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、沒(méi)食子酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、抗壞血酸均為分析純；檢測(cè)用水為重蒸水。

MPI-A型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光分析測(cè)試系統(tǒng)：西安瑞邁分析儀器有限公司；FA2004電子天平：上海儀器天平廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器分析有限公司；KS-300EⅡ型超聲波清洗機(jī)：寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；Edw ards Pirani 1001冷凍干燥器（U. K.）、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；粉碎機(jī)：浙江省瑞安市春海藥材器械廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠。

1.2方法

1.2.1雪菊供試樣品溶液的制備

采用超聲波提取法［6-7］，將3種雪菊樣品粉碎，過(guò)60目篩，分別稱取干燥的昆侖雪菊粉各5 g，加95%乙醇50 mL，于超聲波清洗機(jī)中提取10 min，趁熱減壓抽濾，用80%乙醇定容至100 mL，搖勻后再稀釋5倍即得樣品溶液。

1.2.2雪菊水提物化學(xué)成分的測(cè)定

1.2.2.1雪菊總黃酮含量的測(cè)定

精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品105.8 mg，置100mL容量瓶中，用少量甲醇加熱溶解，冷卻后甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.058 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于25 mL的比色管中，加入1.5%AlCl38 mL和醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH 5.5）4 mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5 h。以不加蘆丁為空白，在415 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以顯色液中蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行回歸，線性方程為A= 0.000 638+0.862 3C，r2=0.999 4。結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在濃度為15.3 μg/mL～59.75 μg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。采用AlCl3分光光度比色法［8-10］。取1.0 mL樣品溶液于10 mL容量瓶，以不加樣品的溶液做空白，以上述的條件測(cè)定吸光度，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，平行測(cè)定3次，取平均值。

1.2.2.2雪菊提取物中的總酚測(cè)定

采用Folin酚法［11］測(cè)定雪菊總酚含量，沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，760 nm處測(cè)定樣品的吸光度值，以樣品濃度為橫坐標(biāo)x，吸光度值為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y=15.49x+0.000 1，R=0.999。

圖1　AlCl3法蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1AlCl3method of rutin standard curve

1.2.3化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雪菊樣品的抗氧化性

1.2.3.1雪菊提取物對(duì)超氧化陰離子（O2-·）清除測(cè)定

鄰苯三酚一魯米諾化學(xué)發(fā)光法［12］測(cè)定雪菊提取物對(duì)超氧陰離子O2-·的清除能力。將3種不同產(chǎn)地的雪菊樣品分別配制成不同的濃度梯度（5、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL）的溶液，用不同濃度的抗壞血酸溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以水為空白。在反應(yīng)池中加入0.2 mmol/L的魯米諾溶液4、0.5mL樣品（或空白）溶液和10mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，快速混勻，迅速置于發(fā)光儀測(cè)定室中，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定180 s，每3 s的發(fā)光強(qiáng)度為I，用蒸餾水作空白，測(cè)其I0，計(jì)算樣品液對(duì)O2-·的清除率（%）。以清除率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪出曲線，根據(jù)擬合方程計(jì)算清除率50%時(shí)的濃度IC50，即半抑制濃度，IC50值越大，樣品清除超氧陰離子O2-·自由基的能力越弱。

1.2.3.2雪菊提取物對(duì)羥基自由基（HO·）的清除測(cè)定

Fe2+一雙氧水一魯米諾化學(xué)發(fā)光法［13］測(cè)定雪菊樣品對(duì)羥基自由基HO·的清除能力。將3種不同產(chǎn)地的昆侖雪菊水提物分別配制成不同的濃度梯度，用不同濃度的抗壞血酸溶液為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水為空白。在反應(yīng)池中加入0.2 mmol/L魯米諾溶液4 mL，樣品（或空白）溶液0.5 mL，0.5 mmol/L Fe2+-EDTA0.2 mL，0.6%的雙氧水溶液0.2 mL，快速混勻，迅速置于發(fā)光儀測(cè)定室中，啟動(dòng)反應(yīng)，連續(xù)測(cè)定180 s，每隔3 s記錄發(fā)光強(qiáng)度，至出現(xiàn)峰值，記錄發(fā)光強(qiáng)度I，用蒸餾水作空白記錄I0，以清除率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線，計(jì)算IC50值。

1.2.3.3雪菊提取物對(duì)雙氧水H2O2的清除測(cè)定

雙氧水一魯米諾-碳酸緩沖液體系測(cè)定雪菊樣品對(duì)雙氧水的清除能力。將3種不同產(chǎn)地的雪菊花水提物配分別配制成不同的濃度梯度，陽(yáng)性對(duì)照為不同濃度的抗壞血酸溶液，以水為空白。在反應(yīng)池中加入樣品（或空白）溶液0.5 mL，0.4 mmol/L魯米諾溶液和pH9.0的0.08 mol/L NaCO3-NaHCO3緩沖混合溶液，迅速混勻，立即置于發(fā)光儀測(cè)定室中，啟動(dòng)反應(yīng)，連續(xù)測(cè)定180 s，每隔3 s記錄發(fā)光強(qiáng)度，至出現(xiàn)峰值，記錄發(fā)光強(qiáng)度I，用蒸餾水作空白記錄I0，以清除率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線，計(jì)算IC50值。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)測(cè)試條件為：高壓600 V，測(cè)試波長(zhǎng)范圍為200 nm～700 nm，采集速度0.1 ms，測(cè)試溫度30℃，曲線的積分面積為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度，采用Origin 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算清除率用如下公式：

式中：I0表示不加樣品時(shí)的空白發(fā)光強(qiáng)度，cd；I表示加入雪菊提取物樣品時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度，cd。

2結(jié)果與分析

2.1化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雪菊樣品的抗氧化性

2.1.1雪菊提取物對(duì)超氧化陰離子（O2-·）清除測(cè)定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化可以產(chǎn)生超氧陰離子，魯米諾是發(fā)光劑，超氧陰離子能激發(fā)魯米諾，使魯米諾由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。加入黃酮樣品后，黃酮類(lèi)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，能提供活潑氫，可阻斷自由基反應(yīng)，抑制其化學(xué)發(fā)光。不同產(chǎn)地的雪菊水提物對(duì)O2-·的清除效果可見(jiàn)圖2。

圖2　雪菊提取物對(duì)超氧化陰離子（O2-·）清除能力比較Fig.2Comparison of the removal ability of the superoxide anion（·）in the snow chrysanthemum

3種雪菊黃酮化合物對(duì)O2-·均有清除作用，且隨其雪菊提取物質(zhì)量濃度的增大，清除效果逐漸增大，3種雪菊黃酮化合物清除率變化趨勢(shì)相似，清除效果基本相當(dāng)，在濃度范圍0.125 mg/mL～0.5 mg/mL時(shí)，喀什高原雪菊黃酮提取物O2-·清除效果最好，在濃度范圍1 mg/mL～5 mg/mL時(shí)，和田高原雪菊黃酮提取物O2-·清除效果最好。

2.1.2雪菊提取物對(duì)羥基自由基（HO·）的清除測(cè)定

硫酸亞鐵一魯米諾一雙氧水化學(xué)發(fā)光體系中，F(xiàn)e2+還原H2O2生成羥基自由基HO·，魯米諾作為發(fā)光劑可以與HO·反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，其發(fā)光強(qiáng)度與HO·在一定強(qiáng)度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但黃酮和多酚類(lèi)物質(zhì)可將Fe2+氧化為Fe3+，阻斷了該體系的反應(yīng)，抑制化學(xué)發(fā)光。不同產(chǎn)地的雪菊水提物對(duì)HO·的清除效果可見(jiàn)圖3。

圖3雪菊提取物對(duì)羥基自由基（HO·）清除能力比較Fig.3Comparison of scavenging capacity of hydroxyl radical（HO·）with snow chrysanthemum

圖3顯示，濃度為0.125 mg/mL～1 mg/mL范圍內(nèi)，3種雪菊提取物對(duì)羥自由基的清除作用均有明顯增強(qiáng)，清除作用和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達(dá)坂城平原雪菊，其中當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，和田高原雪菊的清除率可以高達(dá)81.35%。但是當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL之后，隨濃度升高，3種雪菊對(duì)羥自由基清除率較為穩(wěn)定，變化不大。

2.1.3雪菊提取物對(duì)雙氧水H2O2的清除測(cè)定

H2O2在有氧和堿性條件下能氧化魯米諾，可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度的降低可以反映抗氧化物對(duì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的抑制能力。不同產(chǎn)地的雪菊黃酮提取物對(duì)H2O2的清除效果如圖4。

圖4　雪菊黃酮提取物對(duì)H2O2除能力比較Fig.4Comparison of H2O2scavenging ability of extracts of snow chrysanthemum

3種雪菊黃酮提取物對(duì)H2O2的清除效果均隨其質(zhì)量濃度的增大而增大的趨勢(shì)，呈良好的線性關(guān)系。濃度為0～0.15 mg/mL范圍內(nèi)，隨濃度增加，清除率快速增大，當(dāng)濃度大于0.5 mg/mL時(shí)，清除率隨濃度增加而增速變緩，3種雪菊對(duì)H2O2的清除效果為：達(dá)坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊。

2.2雪菊提取物的抗氧化性與總酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析

計(jì)算不同品種玫瑰花提取物對(duì)3種自由基清除率達(dá)50%時(shí)的樣品濃度IC50及提取物中總酚、總黃酮的含量，結(jié)果如表1所示。

表1　不同產(chǎn)地的雪菊提取物的IC50及其總酚、總黃酮含量Table 1 IC50and total phenol and total flavonoids content of the extracts from different habitats of the chrysanthemum

3種雪菊對(duì)O2-·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達(dá)坂城平原雪菊，對(duì)HO·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達(dá)坂城平原雪菊，對(duì)H2O2的清除效果依次為：達(dá)坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊，可見(jiàn)不同產(chǎn)地、海拔的雪菊水提物對(duì)不同的自由基清除效果不同，與抗氧化物質(zhì)維生素C相比，3種雪菊對(duì)O2-·和H2O2的清除效果均不如維生素C，但喀什高原雪菊和和田高原雪菊對(duì)HO·的清除效果優(yōu)于維生素C，清除能力很強(qiáng)。

對(duì)雪菊提取物清除3種自由基的IC50與總酚、總黃酮含量做相關(guān)性分析，總黃酮含量與清除O2-·和HO·的IC50之間、總酚含量與清除H2O2的IC50之間呈負(fù)相關(guān)，即總黃酮含量對(duì)O2-·和HO·的清除能力呈正相關(guān)性，總酚含量對(duì)清除H2O2能力呈正相關(guān)性。多酚和黃酮類(lèi)成分在3種雪菊水提物抗氧化活性中都能起作用，但是黃酮和多酚含量對(duì)清除不同自由基的效果有差異，其中總黃酮含量與O2-·和HO·的清除率之間相關(guān)性良好。有資料報(bào)導(dǎo)，多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力與其母核上“-OH”基團(tuán)數(shù)目有關(guān)，母核上“-OH”基團(tuán)數(shù)目越多，提供氫質(zhì)子能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。當(dāng)“-OH”基團(tuán)數(shù)相同，且所在位置也相同，但C環(huán)結(jié)構(gòu)不同，抗氧化能力也不同。Velioglu［14］等比較了28種植物材料的抗氧化活性與酚類(lèi)物質(zhì)含量的相關(guān)性，結(jié)果表明兩者沒(méi)有明顯相關(guān)性。研究還認(rèn)為除黃酮以外的其它物質(zhì)，在抗氧化方面也起一定作用。新疆不同海拔地區(qū)生長(zhǎng)的3種不同品種的雪菊，其黃酮和多酚的含量不同，同時(shí)雪菊水提物中還存在維生素C、綠原酸類(lèi)等其他活性成分，同時(shí)具有清除自由基的能力，可見(jiàn)雪菊的抗氧化活性是多物質(zhì)抗氧化活性的集合。同時(shí)，在對(duì)雪菊進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用時(shí)，可有針對(duì)性的選擇某方面抗氧化能力有優(yōu)勢(shì)的不同產(chǎn)地雪菊為原料，開(kāi)發(fā)多種具有功能活性，抗氧化能力強(qiáng)的特色雪菊產(chǎn)品。本研究為雪菊的深加工，及在食品、保健品、醫(yī)藥中的應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

3結(jié)論

不同產(chǎn)地、海拔的雪菊水提物對(duì)不同的自由基清除效果不同，喀什高原雪菊和和田高原雪菊對(duì)HO·的清除效果優(yōu)于維生素C，3種雪菊對(duì)O2-·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達(dá)坂城平原雪菊，對(duì)HO·的清除效果依次為：和田高原雪菊＞喀什高原雪菊＞達(dá)坂城平原雪菊，對(duì)H2O2的清除效果依次為：達(dá)坂城平原雪菊＞喀什高原雪菊＞和田高原雪菊，總酚含量與清除H2O2的能力有一定相關(guān)性，總黃酮含量與O2-·和HO·的清除率之間相關(guān)性較好。

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Comparative Study on Antioxidant Activity of the Different Habitats of Kunlun Snow Chrysanthemum

DU Juan1，WU Jin-rong1，WU Zhong-hong2
（1.Institute of Science Food，Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Research Institute of Agricultural Products Storage and Processing，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，Xinjiang，China）

The antioxidant capacity of three kinds different origin Kunlun snow Chrysanthemum was investigated by chemiluminescence.Scavenging abilities in vitro on O2-·，HO·and H2O2were determined by three chemiluminescence systems.The results showed that the chrysanthemum extracts had good scavenging activity on O2-·，HO·and H2O2，but different samples had diferent antioxidative activity and it was related to its components.Hetian Plateau snow chrysanthemum on O2-·，HO·scavenging effect was good，the best removal effect of plain of Dabancheng chrysanthemum on H2O2，scavenging effect of Hetian high plateau and Kashi Plateau snow chrysanthemum on HO·were better than that of vitamin C.In different places，at an altitude of snow chrysanthemum between flavonoids and O2-·，HO·clearance rate，good correlation.

differentareas；snowchrysanthemum；antioxidantcapacity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.004

2015-11-10

新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.XJEDU2013S52）

杜鵑（1978—），女（漢），副教授，碩士，從事食品加工教學(xué)及研究工作。