超臨界CO2萃取干姜的工藝優化Δ

馮青云，周昌妮，陳書慧，徐如冰，田效志，賈永艷，3#（.河南中醫學院藥學院，鄭州 450046；2.石家莊醫學高等專科學校中藥系，石家莊 050000；3.呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，鄭州 450046）

超臨界CO2萃取干姜的工藝優化Δ

馮青云1，2＊，周昌妮1，陳書慧1，徐如冰1，田效志1，賈永艷1，3#（1.河南中醫學院藥學院，鄭州 450046；2.石家莊醫學高等專科學校中藥系，石家莊 050000；3.呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心，鄭州 450046）

目的：優化超臨界CO2萃取干姜的工藝條件。方法：采用均勻設計法，以姜酚類成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的含量和干姜油萃取率的綜合評分為指標，考察萃取壓力、萃取溫度、萃取時間3個因素對萃取效果的影響；同時進行驗證試驗。結果：優化的萃取工藝為壓力25 MPa、溫度30 ℃、時間2 h；驗證試驗中干姜油的平均萃取率為3.2%，綜合評分為1.874 2（RSD=0.65%，n=3）；實測值與預測值的相對偏差為0.6%。結論：所得最優萃取工藝條件穩定可行，具有溫度低、耗時短等優點。

干姜；超臨界CO2萃取；均勻設計；姜酚類成分；提取率

干姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，具有溫中散寒、燥濕消痰、回陽通脈之功效，主要用于改善脘腹冷痛、嘔吐瀉泄、肢冷脈微、痰飲喘咳等癥狀［1］。干姜含15%姜辣素及少量揮發油，其中姜辣素主要包括6-姜酚及其分解產物姜烯酚、姜酮和姜萜酮等，具有抗氧化、抑制胃黏膜損傷、增加膽汁分泌等作用［2］。一般來說，超臨界萃取得到的萃取物成分的量和揮發性成分種類遠遠多于水蒸氣蒸餾法［3］。因此，本試驗以干姜中姜酚類成分6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚的含量和干姜油萃取率的綜合評分為指標，采用均勻設計法篩選超臨界萃取干姜的最佳工藝。

1 材料

1.1 儀器

DIONEX Summit系統高效液相色譜（HPLC）儀，包括DIONEXP-600泵、TCC-100柱溫箱、PDA-100檢測器（美國戴安公司）；AE 240十萬分之一天平（德國梅特勒公司）；KQ-100超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW-200高速萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）；HA221-50-06超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）。

1.2 藥品與試劑

二氧化碳（CO2，純度：≥99.5%）購自河南源正科技發展有限公司；6-姜酚對照品（批號：140124，純度：≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；8-姜酚對照品（批號：1508240，純度：≥98%）、10-姜酚對照品（批號：1508240，純度：≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；干姜（產地：四川，批號：20150316）購自河南中原正信藥材有限責任公司；無水乙醇（批號：20150119）購自天津市致遠化學試劑有限公司；乙腈（批號：150907）購自天津四友精細化學品有限公司；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 3種姜酚類成分含量測定方法學考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Venusil XBP C18（L）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～20 min，45%A→65%A；20～40 min，60%A→75% A；40～50 min，75%A→45%A；50～75 min，45%A）；流速：1 ml/min；柱溫：30 ℃ ；檢測波長；280 nm；進樣量：10μl。在此色譜條件下，取“2.1.2”～“2.1.4”項下溶液進樣分析，結果，待測成分與其他成分均達到基線分離，理論板數均大于4 000，分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對照品適量，加無水乙醇溶解，制成每1 ml含6-姜酚105 μg、10-姜酚71μg、8-姜酚88μg的混合溶液作為混合對照品母液；再分別精密吸取0、2.5、3、5、6 ml，置于10 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取干姜萃取物約10.2 mg，加無水乙醇溶解并定容于10 ml量瓶中，超聲（功率：1 200 W，頻率：50 Hz）5 min，用0.22μm濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.1.4 干姜陰性樣品的制備 取無水以醇定容于10 ml量瓶中，用0.22μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品母液及各稀釋液10μl，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚的回歸方程和線性范圍見表1。

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.3”項供試品溶液，重復進樣5次，測定峰面積并記錄RSD。結果，6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚的RSD分別為0.69%、0.83%、0.92%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.3”項供試品溶液，分別于放置0、 2、4、6、8、10、12 h時進樣測定，記錄峰面積。結果，6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚峰面積的RSD分別為1.09%、0.57%、0.86%（n= 7），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

表1 3種成分的回歸方程和線性范圍Tab 1 Regression equation and linear range of the three kinds of components

2.1.8 重復性試驗 稱取同一干姜萃取物約8.4 mg，共6份，置于10 ml量瓶中，按“2.1.3”項下制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下方法進樣測定，記錄峰面積。結果，6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚峰面積的RSD分別為1.41%、1.35%、1.19%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 稱取同一干姜萃取物約4.2 mg，共6份，置于10 ml量瓶中，分別加入含6-姜酚0.39 mg/L、10-姜酚0.12 mg/L、8-姜酚0.3 mg/L的對照品混合溶液1 ml，以無水乙醇溶解并定容。按“2.1.3”項下制備供試品溶液，吸取上述6份供試品溶液10μl，按“2.1.1”項下方法進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚的平均加樣回收率分別為105.7%、104.2%、108.3%，RSD分別為1.25%、1.39%、1.03%（n=3）。

2.1.10 檢測限與定量限試驗 精密稱取6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚對照品各2.5 mg，置于50 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并定容，制得質量濃度為0.05 mg/ml的標準溶液。吸取1 ml于10 ml量瓶中，加無水乙醇定容，如此逐級稀釋，進樣測定。按信噪比為3計算，6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚的檢測限分別為0.1、10、1 ng；按信噪比為10計算，其定量限分別為0.5、50、5 ng。

2.2 超臨界CO2萃取干姜工藝

2.2.1 超臨界CO2萃取干姜萃取率的計算公式 干姜萃取率=萃取物質量/藥材質量×100%。

2.2.2 綜合評分指標的確定 在多指標試驗中，各試驗因素及其水平對各試驗指標的影響往往是不同的。加權系數的大小體現了各項指標的重要程度。因此從多成分的綜合整體特征更接近于真實質量的觀點出發［4］，給予3種不同姜酚類成分指標權重各30%，萃取率指標權重10%。因此，綜合評分= 30%×6-姜酚含量+30%×10-姜酚含量+30%×8-姜酚含量+10%×揮發油萃取率。

2.2.3 超臨界CO2萃取干姜工藝的均勻設計試驗 為確定最優工藝條件，通過預試驗并參考文獻［5-6］，本試驗以干姜化合物中6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚的含量和干姜油的萃取率的綜合評分為指標，以萃取壓力（A）、萃取溫度（B）和萃取時間（C）為考察因素，選用均勻設計試驗優選干姜的萃取條件。將干姜藥材粉碎成粗粉，稱取6份，每份200 g，按照U5（53）表安排試驗。因素與水平見表2，試驗安排與結果見表3。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 試驗安排與結果Tab 3 Arrangement and results of tests

將表3得到的結果利用均勻設計數據處理軟件DPS 9.50（標準版）進行二次多項式逐步回歸，得方程y=2.618 3－0.057 1B－0.111C2+0.012 9BC（r=0.994 4）。各因素回歸系數的t檢驗結果見表4。

表4 各因素回歸系數的t檢驗結果Tab 4 t-test results of regression coefficients of each factor

由表4可知，B項對試驗結果有顯著影響（P=0.013），說明萃取溫度對姜酚類成分萃取率影響較大。根據回歸方程，求出各因素最優值為：A=26.196 5 MPa，B=30 ℃，C=1.764 8 h；在此組合基礎上求出最優解：y=1.743 8。

2.2.4 回歸方程分析 由回歸方程中各因素的系數可見，萃取溫度對姜酚類成分萃取量的影響為負效應。由最優方案可知，使用超臨界CO2萃取干姜姜酚類成分，萃取溫度為30 ℃。由于因素A、C對方程貢獻值較小［7］，因此，綜合考慮確定超臨界CO2萃取干姜工藝為：萃取壓力25 MPa，萃取溫度30 ℃，萃取時間2 h。

2.2.5 萃取工藝驗證 按上述篩選的最優萃取工藝取干姜藥材粗粉3份，每份200 g，進行驗證試驗。結果，每1 g生藥含6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚3.22、0.93、2.1 mg，RSD值分別為0.95%、0.62%、1%（n=3）；干姜油的平均萃取率為3.2% （RSD=0.57%，n=3）；綜合評分可達1.874 2（RSD=0.65%，n=3）；實測值與預測值的相對偏差為0.6%。

3 討論

超臨界流體萃取法具有條件溫和、可有效避免揮發油中熱敏性物質分解與異構化、提取率高等優點［8］。超臨界CO2低溫萃取干姜，不僅可保存干姜中有效成分的完整性，還可保持藥材原有的氣味。相關研究優化超臨界CO2萃取姜油工藝多以姜油的萃取率和6-姜酚的含量為指標［9-11］，但10-姜酚、8-姜酚也是干姜中的主要特征性成分，含量較高，藥理活性顯著且與干姜的主治功能相關［12］。因此本試驗將6-姜酚、10-姜酚、8-姜酚的含量納入研究指標，優化超臨界CO2萃取干姜的工藝，以充分、高效地萃取干姜中的有效成分。前期試驗分別考察了甲醇和無水乙醇對干姜中有效成分色譜峰的影響，結果以無水乙醇為溶劑時，干擾的雜質峰少、分離度較好。

預試驗結果表明，在一定條件下，萃取壓力越高，超臨界流體密度越大，其溶解能力越強，溶質溶解度越大，出油率也隨之增加。但當萃取壓力增加到一定程度時，干姜油在超臨界流體的溶解度增加速度趨于緩慢，出油率增幅也很小。因此萃取壓力是影響萃取過程的重要因素之一。而萃取溫度不僅影響干姜的出油率，還會影響干姜油的活性成分，且出油率會隨溫度的升高而下降。萃取溫度與萃取壓力關系密切，需根據萃取壓力確定較佳的萃取溫度［5］。萃取率隨著萃取時間的延長而逐漸增加，但超過一定時間后，萃取率增加的幅度明顯減少。

近年來，均勻設計用于提取工藝研究的應用較多［13］，其可將試驗有關因素的各水平均勻分散在實驗范圍內，使每一個試驗點都有更好的代表性［14］。試驗結果可用計算機處理，并通過回歸方程得出理論上最優的試驗條件［15］。

綜上所述，本研究建立的干姜萃取工藝條件穩定可行，具有溫度低、耗時短等優點。

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Technology Optimization of Supercritical CO2Extraction from Zingiberis rhizoma

FENG Qingyun1，2，ZHOU Changni1，CHEN Shuhui1，XU Rubing1，TIAN Xiaozhi1，JIA Yongyan1，3（1.College of Pharmacy，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China；2.Dept.of TCM，Shijiazhuang Medical College，Shijiazhuang 050000，China；3.Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment&Chinese Medicine Development of Henan Province，Zhengzhou 450046，China）

OBJECTIVE：To optimize the technology of supercritical CO2extraction from Zingiberis rhizoma.METHODS：With the comprehensive score of the contents of 6-ginger phenol，8-ginger phenol and 10-ginger phenol and the extraction rate of the oil from Z.rhizoma as the index，uniform design method was adopted to investigate the effects of extraction pressure，extraction temperature and extraction duration on the extraction result；verification tests were conducted.RESULTS：The optimal conditions were as follows as the extraction pressure of 25 MPa，extraction temperature of 30 ℃and extraction duration of 2 h.In the verification tests，the average extraction rate of the oil from Z.rhizoma was 3.2%（n=3），and the comprehensive score was 1.874 2 （RSD=0.65%，n=3），with the relative deviation of 0.6%between the measured value and the predicted value.CONCLUSIONS：The optimal extraction technology is stable and feasible，with the advantages of low temperature，short duration.

Zingiberis rhizoma；Supercritical CO2extraction；Uniform design；Ginger phenolic components；Extraction rate

R284.2

A

1001-0408（2016）25-3552-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.29

2015-12-18

2016-07-11）（編輯：劉明偉）

河南省科技攻關計劃項目（No.092102310112）；呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心基金項目（No.20130012）

＊碩士。研究方向：藥物制劑新技術、新劑型及新藥。E-mail：417018951@qq.com

教授。研究方向：藥物制劑新技術、新劑型及新藥。E-mail：hnzyjyy@126.com