恩替卡韋-PLGA緩釋微球的處方優化及體外釋藥研究Δ

林鳳云，羅 易，何雄偉（1.重慶醫藥高等專科學校藥學院，重慶 4011；2.重慶市藥物制劑工程技術研究中心，重慶 4011；.重慶市第九人民醫院藥劑科，重慶 400700；4.重慶市第九人民醫院臨床藥學研究室，重慶 400700）

恩替卡韋-PLGA緩釋微球的處方優化及體外釋藥研究Δ

林鳳云1，2＊，羅 易3，何雄偉4#（1.重慶醫藥高等專科學校藥學院，重慶 401331；2.重慶市藥物制劑工程技術研究中心，重慶 401331；3.重慶市第九人民醫院藥劑科，重慶 400700；4.重慶市第九人民醫院臨床藥學研究室，重慶 400700）

目的：優化恩替卡韋聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）緩釋微球的處方，并考察其體外釋藥特性。方法：采用乳化-溶劑揮發法制備恩替卡韋-PLGA緩釋微球；以微球的包封率、載藥量的綜合評分為評價指標，設計正交試驗優化投藥量、藥物-PLGA質量比、PLGA質量濃度、油相-水相體積比、聚乙烯醇（PVA）濃度，并進行驗證試驗；考察所制微球形態、粒徑及體外釋藥情況（Q）。結果：最優處方為恩替卡韋20 mg、恩替卡韋-PLGA質量比1∶10、PLGA質量濃度200 mg/ml、油相-水相體積比1∶10、PVA濃度2%。所制恩替卡韋-PLGA緩釋微球的包封率為（86.52±3.25）%，載藥量為（18.36±1.37）%，RSD均小于5.0%（n=3）；其表面光滑圓整，平均粒徑為58.35 μm；Q10 h、Q96 h、Q360 h分別為9.6%、42.9%、89.6%，體外釋藥符合Higuchi模型（r2=0.965 8）。結論：優化處方所制恩替卡韋-PLGA緩釋微球的緩釋性能良好。

恩替卡韋；緩釋微球；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；體外釋藥；正交試驗；制備；處方優化

恩替卡韋（Entecavir，ETV）是當前慢性乙型肝炎（CHB）患者抗病毒治療的一線藥物之一［1-2］，具有較強的抗乙肝病毒（HBV）能力［3-4］。但ETV需每日口服，至少用藥半年，療程較長；同時為增強其吸收臨床要求患者空腹用藥，加劇了ETV的不良反應，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、腹部不適和消化不良等，導致患者依從性差，治療效果不佳。另ETV停藥后會出現反跳現象，導致疾病復發，甚至發生肝衰竭，預后不佳［5-6］。本研究以生物可降解新型材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Polylacticco-glycolic acid，PLGA）為基質，將ETV制備成微球（MS）制劑（ETV-PLGA-MS），以期延長ETV的釋藥時間、提高生物利用度、減少藥品不良反應、減少給藥次數及藥物對胃腸道的刺激，進而提高藥物治療效果，改善患者的依從性，提高患者的生活質量。

1 材料

1.1 儀器

Series PC4060高效液相色譜儀（美國蘭博公司）；DV215CD電子天平（美國奧豪斯公司）；S-3400N電子掃描顯微鏡（日本Hitachi公司）；XW-80漩渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；LS 230激光粒度測定儀（美國Beckman公司）；78-1恒溫磁力攪拌器（上海旌派儀器有限公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

ETV原料藥（湖北新銀禾化工有限公司，批號：20150326，純度：99.0%）；PLGA［批號：20141128，丙交酯-乙交酯（LA-GA）：75∶25，相對分子質量：15 000］；聚乙烯醇（PVA，批號：20141021，相對分子質量：13 000～23 000，水解度：87%～89%）均購自美國Sigma-Aldrich公司；磷酸二氫鉀、聚山梨酯80、疊氮化鈉、二氯甲烷等均為市售分析純或化學純。

1.3 透析袋

MD25透析袋（北京索萊寶有限公司）。

2 方法與結果

2.1 ETV-PLGA-MS的制備[7]

采用乳化-溶劑揮發法制備ETV-PLGA-MS。精密稱取適量ETV和PLGA溶解于二氯甲烷中，渦旋混勻，得到油相。將油相在冰浴條件下緩慢滴加至含有乳化劑PVA的水溶液（水相）中，同時以1 000 r/min攪拌20 min，再在室溫以400 r/min繼續攪拌6 h，揮發有機溶劑，靜置沉淀。純化水離心洗滌3次，減壓干燥48 h，得到粉末狀固體ETV-PLGA-MS。

2.2 ETV含量測定

2.2.1 色譜條件 采用高效液相色譜法測定ETV含量［8-9］。色譜柱：Diamonsil ODS-C1（8200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02%（V/V）的三氟乙酸水溶液-乙腈（95∶5）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μl；柱溫：30 ℃ 。在該色譜條件下，理論板數按ETV計不低于3 000。

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取ETV 25 mg，置于100 ml量瓶中，加流動性適量，超聲溶解并定容，搖勻，制成250 μg/ml的貯備液。精密移取0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、3.0、5.0 ml的貯備液，置于25 ml量瓶中，流動相定容，得到質量濃度分別為1、3、5、8、10、30、50 μg/ml的系列溶液。精密量取上述溶液各20 μl，按“2.2.1”項下條件測定峰面積。以溶液質量濃度（c）對峰面積（A）進行線性回歸，得回歸方程A=267 634c+18 523（r2= 0.999 8）。結果表明，ETV質量濃度在1～50 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度考察 精密量取高、中、低質量濃度（10、5、1 μg/ml）的ETV溶液，按“2.2.1”項下條件，同日內測定5次，考察日內精密度；連續測定5 d，考察日間精密度。結果顯示，低、中、高質量濃度ETV溶液的日內RSD分別為0.22%、0.54%、0.36%（n=5），日間RSD分別為1.10%、0.75%、0.99%（n=5）。

2.2.4 準確度試驗 精密量取高、中、低質量濃度（10、5、1 μg/ml）的ETV溶液，按“2.2.1”項下條件測定峰面積，根據回歸方程計算對應的質量濃度，以測得值與加入量之比計算回收率。結果，高、中、低質量濃度的ETV溶液的平均回收率分別為99.81%、99.56%、99.05%（RSD分別為0.48%、0.44%、0.35%，n=3），表明該方法的準確度良好。

2.3 載藥量和包封率的測定

精密稱取約20 mg ETV-PLGA-MS，置于離心管中，加入5 ml流動相，渦旋使其充分溶解。混懸液以3 500 r/min（離心半徑6.5 cm）離心10 min，重復3次，合并上清液，用流動相定容至25 ml。按“2.2.1”項下條件測定峰面積，根據回歸方程計算ETV質量濃度，按公式計算載藥量和包封率。載藥量（%）= MS中藥物的質量/MS的質量×100%，包封率（%）=MS中藥物的質量/投藥量×100%。

2.4 ETV-PLGA-MS的處方優化

根據單因素試驗結果，選取對MS制備和性質影響較顯著的5個因素作為考察對象，即投藥量（A，mg）、藥物-PLGA質量比（B）、PLGA質量濃度（C，mg/ml）、油相-水相體積比（D）、PVA濃度［E，%（mg/100 ml）］。每個因素選擇4個水平，按正交設計表L16（45）設計正交試驗方案。以MS的載藥量（Y1）、包封率（Y2）為考察指標，根據各指標因素對制備工藝的影響大小分配權重系數，計算兩個因素的綜合評分Y=50%×Y1+50%×Y2，以其進行綜合評價［10］，優選處方。因素與水平見表1，正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗設計與結果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

由表2和表3可知，各因素對Y的影響大小順序為B＞E＞C＞D＞A，其中B有顯著影響（P＜0.05）。確定最優處方為A2B2C3D2E4，即ETV投藥量為20 mg，ETV-PLGA質量比為1∶10，PLGA質量濃度為200 mg/ml，油相-水相體積比為1∶10，PVA濃度為2%。

2.5 驗證試驗

按照最優處方制備3批ETV-PLGA-MS，測定其包封率、載藥量。結果，ETV-PLGA-MS的平均包封率為（86.52±3.25）%、平均載藥量為（18.36±1.37）%、Y的平均值為（52.44±4.95）%、RSD均小于5.0%（n=3），表明本處方工藝穩定、重現性好。

2.6 ETV-PLGA-MS的形態觀察和粒徑分布考察

以掃描電子顯微鏡觀察優化處方制備的ETV-PLGA-MS的形態，以激光粒度測定儀測定其粒徑大小及其分布。結果，ETV-PLGA-MS球形圓整，表面光滑、致密、無裂縫，平均粒徑為58.35 μm，粒徑分布為10.3～92.2 μm，可見其粒徑分布較窄。ETV-PLGA-MS的形態圖見圖1，粒徑分布圖見圖2。

圖1 ETV-PLGA-MS的形態圖（×950）Fig 1 Morphological of entecavir PLGA sustained-release microspheres（×950）

圖2 ETV-PLGA-MS的粒徑分布圖Fig 2 Particle size distribution of entecavir PLGA sustained-release microspheres

2.7 ETV-PLGA-MS體外釋放性能[11]

取優化處方制備的干燥ETV-PLGA-MS 30 mg，精密稱定，置于透析袋中，加2 ml釋放介質，釋放介質為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，含0.02%疊氮鈉和1%聚山梨酯80）。釋放樣品置于裝有適量釋放介質的具塞錐形瓶中，加入磁力攪拌子，于（37±0.5）℃ 的恒溫磁力攪拌器中，以轉速50 r/min攪拌。分別于0.5、1、10、24、48、72、96、120、168、216、312、360、432、480、600、720 h各取出1 m（l同時補加等量新鮮同溫釋放介質），按“2.2.1”項下條件測定峰面積，計算累積釋放度（Q）。ETVPLGA-MS的體外釋放曲線見圖3。

圖3 ETV-PLGA-MS的體外釋放曲線Fig 3 Drug release in vitro profile of entecavir PLGA sustained-release microspheres

由圖3可知，ETV-PLGA-MS的Q10 h為9.6%，表明無突釋現象；Q96 h、Q360 h分別為42.9%、89.6%，說明ETV-PLGA-MS有較好的緩釋性能。將試驗結果按零級、一級、Higuchi方程進行擬合。結果，ETV-PLGA-MS的釋放更符合Higuchi方程，擬合結果見表4。

表4 ETV-PLGA-MS的體外釋藥方程擬合結果Tab 4 Fitting results of drug release in vitro of entecavir PLGAsustained-release microspheres

3 討論

注射用緩釋微球是近年來發展的一種新劑型，即將藥物分散或吸附在高分子聚合物基質中，形成粒徑為1～300 μm的固體顆粒分散體系，可在體內緩釋30 d以上。注射用微球作為一種新型給藥技術，其優點主要有：（1）通過調節和控制藥物的釋放速度實現長效給藥的目的；（2）注射入組織內，可達到靶向治療的目的，且微球與某些細胞組織有特殊的親和性，能被組織器官的網狀內皮系統所吞噬，從而實現靶向性；（3）減少藥物對胃腸的刺激，改善首關效應，提高生物利用度，降低給藥劑量［12-13］。

PLGA是一種性能優良的合成高分子材料，可作為多種藥物緩釋載體，其優點包括生物相容性好、安全性高［14-16］。

本研究以乳化-溶劑揮發法制備ETV-PLGA-MS，結果發現，其具有較高的載藥量和包封率，微球形態圓整，粒徑均勻，可緩釋480 h以上，體外釋放符合Higuchi模型，符合注射用緩釋微球的體外釋放要求。

鑒于注射用微球制劑的質量要求較高，在今后的工作中，還應對該微球的體內藥動學、藥效學和注射刺激性作進一步研究，并考察丙交酯、乙交酯不同比例及不同分子質量的PLGA對藥物釋放和緩釋性能的影響，進一步闡明ETV-PLGA-MS的緩釋特性，探討其作為緩釋注射劑治療HBV感染的可行性。

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Study on the Formulation Optimization of Entecavir PLGA Sustained-release Microspheres and Its Drug Release in vitro

LIN Fengyun1，2，LUO Yi3，HE Xiongwei4（1.School of Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；2.Engineering Research Center of Chongqing Pharmaceutical Sciences，Chongqing 401331，China；3.Dept.of Pharmacy，the Ninth People’s Hospital of Chongqing，Chongqing 400700，China；4.Dept.of Clinic Pharmacy Laboratory，the Ninth People’s Hospital of Chongqing，Chongqing 400700，China）

OBJECTIVE：To optimize the formulation of entecavir PLGA sustained-release microspheres，and explore its drug release in vitro.METHODS：PLGA sustained-release microspheres was prepared by emulsification-solvent evaporation method.Using composite score of entrapment efficacy and drug loading as indexes，orthogonal test was designed to optimize drug amount，drug-PLGA mass ratio，PLGA mass concentration，oil phase-aqueous phase volume ratio and polyvinyl alcohol（PVA）concentration；and validation test was also conducted.The prepared microsphere morphology，particle size and durg release in vitro were detected.RESULTS：The optimized formulation was entecavir 20 mg，entecavir-PLGA mass ratio 1∶10，PLGA mass concentration 200 mg/ml，oil phase-aqueous phase volume ratio 1∶10，and PVA concentration 2%；entrapment efficacy was（86.52±3.25）%，drug loading was（18.36±1.37）%，RSDs were lower than 5.0%（n=3）；it was round and smooth in appearance with average particle size of 58.35 μm；Q10 h，Q96 hand Q360 hwere 9.6%，42.9%and 89.6%，and the drug release in vitro fitted to Higuchi model （r2=0.965 8）.CONCLUSIONS：Entecavir PLGA sustained-release microspheres prepared by optimized formulation has good sustained-release performance.

Entecavir；Microspheres；PLGA；Drug release in vitro；Orthogonal test；Preparation；Formulation optimization

R943

A

1001-0408（2016）25-3549-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.28

2016-03-07

2016-04-07）

（編輯：鄒麗娟）

重慶市醫學科研計劃項目（No.2013-2-153）；重慶醫藥高等專科學校校級科研計劃項目（No.ygz2013101）

＊講師，碩士。研究方向：藥物新劑型與新技術。E-mail：linfengyun2009@126.com

副主任藥師。研究方向：臨床藥學。E-mail：1462683447@qq.com