自擬補腎活血顆粒對去卵巢骨質疏松癥大鼠的治療作用*

惠紅巖， 董玉珍

(新鄉醫學院第一附屬醫院 1臨床藥學辦公室， 2骨科， 河南 衛輝 453100)

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自擬補腎活血顆粒對去卵巢骨質疏松癥大鼠的治療作用*

惠紅巖1△， 董玉珍2

(新鄉醫學院第一附屬醫院1臨床藥學辦公室，2骨科， 河南 衛輝 453100)

目的： 觀察自擬補腎活血顆粒(MBHG)對去卵巢大鼠骨質疏松癥的治療作用。方法：雌性SD大鼠，隨機取10只作為假手術組(sham組)，其余大鼠制備去卵巢骨質疏松癥，隨機分為：模型(model)組；補腎活血顆粒高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)劑量組；陽性對照組(戊酸雌二醇組)。每組10只，連續灌胃給藥12周。觀察大鼠骨小梁形態，測量骨小梁的面積、厚度、間距及面積百分數，全自動分析儀檢測血清中鈣、磷和堿性磷酸酶(ALP)含量，測量大鼠骨密度(BMD)，ELISA法檢測血清雌激素(E2)、骨鈣素(BGP)、骨保護素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANK)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)水平。結果：與模型組比較，各給藥組骨小梁顯著變寬，數目增多，網狀結構有部分恢復。各給藥組骨小梁厚度、骨小梁面積和骨小梁面積百分數均大于模型組，骨小梁間距均小于模型組(P<0.05)。各給藥組血清中鈣、磷、E2、OPG以及股骨BMD水平均顯著高于模型組，ALP、BGP、RANK和RANKL水平均顯著低于模型組(P<0.01)。結論：自擬補腎活血顆粒對去卵巢大鼠骨質疏松癥有顯著的治療作用。作用機制可能與上調OPG、抑制RANKL分泌有關。

自擬補腎活血顆粒； 去卵巢后骨質疏松癥； 骨保護素； 核因子κB受體活化因子配體

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身代謝性骨病，患者多呈現骨量減少、骨組織微結構異常、骨骼易碎易骨折等特點[1]。目前，OP多發于婦女及老年人，全世界患者數量已達2億之多，發病率已躍居常見及多發病的第7位，且中國7%的人口患有OP，并且有逐年增長的趨勢。預計到2050年，OP患者將達到總人口的13.2%[2-5]。OP可分為原發性和繼發性兩大類，因雌激素嚴重缺乏而致的絕經后骨質疏松癥占有很大比例，以補充雌激素和孕激素為主的治療方法副作用較大，易引起子宮內膜癌和乳腺癌的發生[6]。OP在中醫學上被認為屬于“骨痹”或“骨萎”，多以氣血阻滯，腎精虧虛病機為主，前人研究已經證實，補腎活血顆粒以中醫病機為基礎，治療OP療效顯著，其機制與其影響骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL) mRNA及蛋白水平、上調OPG/RANKL的表達有關[7]。本實驗所用自擬方補腎活血顆粒(modified Bushen Huoxue granules，MBHG)在原方的基礎上加入菟絲子、續斷和肉蓯蓉，補益肝腎，強筋骨，大大增強了補腎作用。本文擬觀察自擬補腎活血顆粒對去卵巢大鼠骨質疏松癥的治療作用，為其進一步的臨床應用提供理論基礎。

材 料 和 方 法

1 動物

SD大鼠，SPF 級，雌性，3月齡，體重260～280 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號為SCXK京2009-0004。

2 主要試劑和儀器

戊酸雌二醇片購于DELPHARM Lille S.A.S，配成0.02 g/L水溶液；自擬補腎活血顆粒由熟地、肉桂、杜仲、山藥、附子、枸杞、菟絲子、續斷、肉蓯蓉、甘草、紅花和山茱萸組成；血清雌二醇(estradiol，E2)、骨鈣素(bone Gla protein，BGP)、OPG、核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)和RANKL ELISA試劑盒均購自上海索寶生物科技有限公司。

ExcelsiorTMES型自動組織脫水機(Thermo);TK-218型恒溫攤片烤片機(湖北泰維醫療科技有限責任公司)；RM2125型常規輪轉石蠟切片機(Leica)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；BH-2型顯微鏡及攝像裝置、BX50熒光顯微鏡(OLYMPUS)；DP70彩色數碼成像系統(北京華躍英泰科技有限公司)；全自動生化分析儀(Beckman)；Multiskan MK3酶標儀(Thermo)；GE Lunar Prodigy 雙能X線骨密度儀(上海同舸醫療器械有限公司)。

3 主要方法

3.1 大鼠模型制備及分組 70只雌性SD大鼠，3月齡，適應性喂養7 d后，隨機選取10只作為假手術(sham)組，其余大鼠作為造模組。參照吳彬等[8-9]文獻，模型制備方法如下：4%水合氯醛麻醉，皮膚經酒精消毒后，沿正中線剪開1.5～2.0 cm的缺口，切除腎臟后方多余脂肪，將卵巢輕輕提出，同時結扎卵巢雙側輸卵管及血管，切除卵巢；假手術組保留卵巢，但同時切除卵巢旁多余脂肪。8周后，造模組死亡4只，將剩余56只大鼠依據簡單隨機抽樣法選取6只造模組大鼠處死后進行骨密度(bone mineral density，BMD)及E2水平(ELISA法)測定，驗證模型制備成功。將成功造模大鼠完全隨機分為：模型(model)組；補腎活血顆粒高劑量(MBHG-high dose,MBHG-H;200 mg/kg)、中劑量(MBHG-middle dose,MBHG-M;100 mg/kg)、低劑量(MBHG-low dose,MBHG-L;50 mg/kg)組;陽性對照戊酸雌二醇組，每組10只。MBHG各劑量組及陽性對照組按上述劑量連續灌胃(ig)，每天1次，灌胃體積10 mL/kg；假手術組及模型組ig等體積蒸餾水，連續12周。

3.2 大鼠骨小梁形態觀察 給藥結束，4%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，迅速分離右側股骨，以至將肌肉和筋膜等軟組織全部剔除，4%甲醛溶液固定48 h。將已固定好的股骨置于脫鈣液中(每周更換1次)，每天檢查脫鈣情況，至大頭針能刺透為止，脫鈣結束。取脫鈣完成的右側脛骨，常規脫水、石蠟包埋、常規 5 μm 組織切片，HE法染色，顯微鏡下觀察骨組織結構變化。

3.3 骨小梁形態計量學指標觀察 顯微鏡下觀察并采集HE染色圖像，每張片取10個視野，觀察同一個位點，測量骨小梁的面積、厚度、間距及面積百分數[10]。

3.4 血清中鈣(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量的檢測 大鼠經4%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血，4 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取血清分裝到EP管中，于-80 ℃冰箱保存待測。全自動生化儀測定血清中Ca、P和ALP含量。

3.5 ELISA法檢測血清E2、BGP、OPG、RANK和RANKL的水平 將ELISA試劑盒從4 ℃冰箱中取出，室溫下平衡30 min。待上述備用血清冰上解凍后按試劑盒說明書檢測血清中E2、BGP、OPG、RANK和RANKL的水平。

3.6 大鼠BMD的測定 給藥8周后，大鼠經4%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血，取右側股骨用Lunar Prodigy雙能X射線骨密度測量儀檢測股骨干骺端BMD。

4 統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0 統計軟件分析，各組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 HE法觀察大鼠骨小梁形態變化

Sham組脛骨HE染色后鏡下可見骨細胞染色均勻明顯，骨小梁寬而粗，粗壯、飽滿，壁厚，形態結構完整，排布規則有序，呈網狀結構分布，密度面積正常，骨小梁間隙較小。與sham組比較，model組大鼠的脛骨骨小梁稀疏、變細、變薄，扭曲，斷裂，網狀結構被破壞，骨髓腔變寬或不規則。與model組比較，MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L組及戊酸雌二醇陽性對照組的骨小梁顯著變寬，數目增多，網狀結構有部分恢復，排列尚整齊連接成網，部分間隙略增大，見圖1。

Figure 1.The morphology of trabecular bone in the rats with different treatments (×400). A: sham group; B: model group; C: MBHG-H group; D: MBHG-M group; E: MBHG-L group; F: estradiol valerate group.

圖1 大鼠骨小梁組織形態變化

2 骨小梁形態計量學指標觀察

Model組的骨小梁厚度、骨小梁面積及骨小梁面積百分數均顯著小于sham組，骨小梁間距顯著大于sham組(P<0.01)；MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L組和戊酸雌二醇陽性對照組的骨小梁厚度、骨小梁面積和骨小梁面積百分數均大于model組，骨小梁間距均小于model組(P<0.05),見表1。

表1 MBHG對大鼠股骨骨小梁參數的影響

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

3 血清中Ca、P和ALP含量的檢測

Model組血清中Ca和P水平均顯著低于sham組，ALP含量顯著高于sham組(P<0.01)，差異有統計學顯著性。MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L組和戊酸雌二醇陽性對照組血清中的Ca和P水平均顯著高于sham組，ALP含量顯著低于sham組(P<0.01)，見表2。

4 血清E2、BGP水平以及股骨BMD的測定

Model組血清中E2和股骨BMD水平顯著低于sham組，血清BGP含量顯著高于sham組(P<0.01)。MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L和戊酸雌二醇陽性對照組血清中E2和股骨BMD水平均顯著高于sham組，血清BGP含量顯著低于sham組(P<0.01)，見表3。

5 ELISA法檢測血清OPG、RANK和RANKL水平

Model組大鼠的血清OPG水平顯著低于sham組(P<0.01)，RANK和RANKL水平顯著高于sham組(P<0.01)。MBHG-H、MBHG-M、MBHG-L和戊酸雌二醇陽性對照組大鼠的血清OPG水平顯著高于sham組(P<0.01)，RANK和RANKL水平顯著低于sham組(P<0.01),見表4。

表2 MBHG對大鼠血清Ca、P和ALP的影響

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

表3 MBHG對大鼠血清E2、BGP水平和BMD的影響

**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsmodel group.

討 論

現代研究證實，原發性骨質疏松癥以腎虛為主，同時伴有血瘀，腎虛日久必有血瘀，血瘀則化精乏源，可加重腎虛。前期研究發現，補腎活血顆粒[11]由熟地、肉桂、杜仲、山藥、附子、枸杞、甘草、紅花和山茱萸組成，具有補腎壯陽、調氣活血之功效，治療去卵巢骨質疏松模型大鼠，療效顯著。本方在前人的補腎活血顆粒的基礎上加以改良，加入菟絲子、續斷和肉蓯蓉，增強補益肝腎的作用，療效更加顯著。方中熟地和杜仲具有養血滋陰、補精益髓之功效；肉桂和附子散寒止痛，溫通經脈；山藥、甘草、紅花和山茱萸補腎活血，補脾益氣，強筋健骨，活血通絡，共同治療腎虛血瘀之癥。

婦女絕經后，雌激素缺乏，骨轉化率高，破骨細胞的吸收遠遠大于成骨細胞的形成，導致凈骨量的丟失[1]。骨代謝生化指標的檢測簡單方便、快捷，可準確靈敏地反映骨代謝轉換情況，聯合BMD預測骨質疏松發生程度，藥效評價較高。Ca和P是骨礦化的必需元素，以其為主要成分的骨礦化物質在骨骼中沉積代表著骨骼的堅實程度。另外，磷酸酶合成于骨基質成熟階段，血清中50%來源于骨的ALP是新生骨分泌的產物，能夠較好反映出成骨細胞的活性和狀態，反映早期骨質疏松骨代謝的變化，同時，ALP對骨的礦化形成有重要的保護作用，可以反應成骨細胞的活性，已經作為臨床上診斷骨質疏松的參考依據。ALP與BGP均是反映成骨細胞活性的重要指標，有結果顯示，絕經后，骨轉化率升高，兩者含量隨之升高，因此測量血清中E2、Ca、P、ALP和BGP對于評價骨質疏松癥有著重要的意義[12-13]。

本實驗研究發現，模型組血清中Ca和P水平均顯著低于假手術組，ALP含量顯著高于假手術組；自擬補腎活血顆粒治療組和陽性對照組血清中Ca和P水平均顯著高于假手術組，ALP含量顯著低于假手術組。結合股骨骨小梁形態變化及骨小梁各參數結果顯示，假手術組脛骨HE染色后鏡下可見，骨細胞染色均勻明顯，骨小梁寬而粗，粗壯、飽滿，壁厚，形態結構完整，排布規則有序，呈網狀結構分布，密度面積正常，骨小梁間隙較小。與假手術組比較，模型組大鼠脛骨骨小梁稀疏、變細、變薄，扭曲，斷裂，網狀結構被破壞，骨髓腔變寬或不規則，骨小梁厚度、骨小梁面積及骨小梁面積百分數均顯著小于假手術組，骨小梁間距顯著大于假手術組。與模型組比較，自擬補腎活血顆粒高、中、低劑量組及戊酸雌二醇陽性對照組，骨小梁顯著變寬，數目增多，網狀結構有部分恢復，排列尚整齊連接成網，部分間隙略增大，骨小梁厚度、骨小梁面積、骨小梁面積百分數均大于模型組，骨小梁間距均小于模型組。HE染色明顯加之BMD、E2、Ca和P顯著下降，ALP和BGP顯著升高，推知去卵巢后骨的重建和吸收無法達到協調，骨吸收大大增加，骨質疏松嚴重。而自擬補腎活血顆粒各劑量組及戊酸雌二醇陽性對照組可有效改善雌激素下降，骨小梁組織形態改變等，有利于Ca和P水平的增加，ALP和BGP水平的降低，對OP有很好的治療作用。

最近研究證實[7]，雌激素減少可引起破骨細胞分化因子RANKL和成骨細胞骨素OPG的分泌失衡，OPG/RANKL系統被認為是雌激素對骨骼產生作用的中間環節，若此系統平衡受限，導致骨轉換增加，導致OP的發生。OPG由OB細胞分泌，而RANKL可促進OC分化，OPG可通過競爭性地與RANKL相結合，阻斷RANKL與RANK結合，抑制OC活化，降低骨吸收活性，促進骨的重建。本實驗結果顯示，模型組大鼠血清OPG水平顯著低于假手術組，RANK和RANKL水平顯著高于假手術組。自擬補腎活血顆粒治療組和陽性對照組大鼠血清OPG水平顯著高于假手術組和RANK和RANKL水平顯著低于假手術組。推測自擬補腎活血顆粒各劑量組可通過有效平衡OPG/RANKL比例，降低骨吸收，提高骨對的重建率，有效緩解OP。綜上所述，自擬補腎活血顆粒對OP有較好的治療作用，其機制與調整OPG/RANKL的比例有關。

[1] 翁澤斌，顏翠萍，吳 育，等. 鹽制對杜仲治療去卵巢大鼠骨質疏松癥影響的研究[J]. 中國骨質疏松雜志, 2014, 20(12):1457-1463.

[2] Deal C. Potential new drug targets for osteoporosis [J]. Nat Clin Pract Rheumatol, 2009, 5(1): 20-27.

[3] Roy A, Heckman MG, O’Connor MI. Optimizing screening for osteoporosis in patients with fragility hip fracture [J]. Clin Orthop Relat Res, 2011, 469(7): 1925-1930.

[4] Bessette L, Davison KS, Jean S, et al. The impact of two educational interventions on osteoporosis diagnosis and treatment after fragility fracture: a population-based randomized controlled trial [J]. Osteoporos Int, 2011, 22(12): 2963-2972.

[5] 宋雙紅，王 德，莫易易，等. 柚皮素防治去卵巢致大鼠骨質疏松癥的實驗研究[J]. 藥學學報, 2015, 50(2):154-161.

[6] Cooper C, Harvey N, Cole Z, et al. Developmental origins of osteoporosis: the role of maternal nutrition [J]. Adv Exp Med Biol, 2009, 646: 31-39.

[7] 芮丹云，唐麗媛，陳 潔，等. 補腎活血顆粒對骨質疏松大鼠骨組織中OPG/RANKL mRNA及蛋白表達的影響[J]. 中國老年學雜志, 2015，35(24):7036-7038.

[8] 吳 彬，張 勇，陳明亮，等. 雌馬酚對去卵巢后大鼠骨質疏松癥的影響[J]. 第三軍醫大學學報，2015, 37(3):256-260.

[9] 盧錦東，謝平金. 骨質疏松大鼠造模法研究進展[J]. 遼寧中醫藥大學學報, 2015, 17(5)：248-251.

[10]李學朋，朱立國. 骨疏康膠囊對去卵巢大鼠骨小梁的影響[J]. 中醫正骨, 2015, 27(12):892-895.

[11]孟照明，李學朋，孟兆亮，等. 補腎活血方治療原發性骨質疏松癥的臨床研究[J]. 臨床與實踐, 2013, 10(1):22-24.

[12]Gamero P,Somay-Rendu E.Biochemical markers of bone loss rate and prevalence of osteoporosis at multiple skeletal sites in Chinese women[J]. Osteoporos Int, 2002, 13(8):669-676.

[13]Lofman O, Magnusson P, Toss G, et al. Common biochemical markers of bone turnover predict future bone loss: a 5-year follow-up study[J].Clin Chim Acta, 2005, 356(1-2):67-75.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

AIM: To observe the therapeutic effect of modified Bushen Huoxue granules (MBHG) on ovariectomized osteoporosis rats. METHODS: Female SD rats were randomly given sham operation (n=10) and ovariectomy, and then the model rats were further randomly divided into model group, MBHG treatment groups at doses of 200 mg/kg, 100 mg/kg and 50 mg/kg respectively, and positive control (estradiol valerate) group, with 10 rats in each group by intragastric administration for 12 weeks. The morphology, area, thickness, spacing and area percentage of trabecular bone in the rats were observed. The serum levels of calcium (Ca), phosphorus (P) and alkaline phosphatase (ALP) were mea-sured by automatic analyzer. Bone mineral density (BMD) was analyzed. Serum estradiol (E2), osteocalcin (BGP)， osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) and receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL) levels were detected by ELISA. RESULTS: Compared with model group, trabecular bone significantly widened in all treatment groups with large number, and net-like structure restored partially. The thickness, area and area percentages of trabecular bone in treatments groups were higher than those in model group,and trabecular spacing was less than that in model group (P<0.05). The serum Ca, P, E2and OPG, and femoral BMD were significantly higher in treatment groups than those in model group, and the levels of ALP, BGP, RANK and RANKL were significantly lower than those in model group (P<0.01). CONCLUSION: MBHG has a significant therapeutic effect on ovariectomized osteoporosis rats. The mechanism may be related to the regulation of OPG and inhibition of RANKL secretion.

Modified Bushen Huoxue granules; Ovariectomized osteoporosis; Osteoprotegerin; Receptor activator of nuclear factor κB ligand

雜志網址： http://www.cjpp.net

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2016- 03- 28

2016- 06- 16

河南省醫學科技攻關計劃項目(No. 201403141)

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R285.5； R363

A

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Therapeutic effects of modified Bushen Huoxue granules on ovariectomized osteoporosis ratsHUI Hong-yan1, DONG Yu-zhen2

(1DepartmentofPharmacy,ClinicalPharmacist，2DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,China.E-mail:xiang8zi@163.com)